Образование сульфидов меди Desulfovibrio sp. R2 в оптимальных температурных условиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Образование сульфидов меди Desulfovibrio SP. R2 в оптимальных температурных условиях

Биотехнология

О.П. Буторова

Определена оптимальная температура роста и образования сероводорода сульфатредуцирующими дельтопротеобактериями Desulfovibrio sp. R2, устойчивыми к повышенным концентрациям меди в среде и перспективными для использования в биотехнологиях осаждения металлов. Методом энергодисперсионного анализа показано образование бактериями Desulfovibrio sp. R2 сульфида меди, соответствующего минералу ковеллиту, при оптимальной температуре 28єС.

Ключевые слова: сульфатредуцирующие бактерии; Desulfovibrio; сульфиды меди; энергодисперсионный анализ; сканирующая электронная микроскопия.

Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) играют важную роль в осаждении сульфидов металлов в природных экосистемах и технологических схемах [1]. Образование сульфидов металлов - основной механизм, посредством которого СРБ осаждают тяжелые металлы из раствора [2]. Растворимость сульфидов двухвалентных металлов низкая и изменяется в пределах 10-4ч10-6 г/100 мл растворителя. Микробное осаждение металлов было продемонстрировано еще в середине прошлого века [3]. Образование ковеллита, сульфида меди, под действием биогенного сероводорода впервые показано Баас-Бекингом и Муром (Baas-Becking and Moore) в 1961 г. [4]. Мак-Нил (McNeil) с соавт.

(1991) определил ковеллит и халькоцит (Cu2S) как основную твердую фазу сульфидов меди, образующихся биогенным путем [5]. Показано образование ковеллита накопительными культурами, содержащими СРБ [6]. Однако при попытке исследовать образование сульфидов металлов чистыми культурами СРБ исследователи обычно сталкиваются с проблемой ингибирования роста клеток при повышенных концентрациях ионов металлов в среде.

Многие СРБ чувствительны к повышенным концентрациям ионов двухвалентной меди. По имеющимся данным, устойчивость к меди большинства представителей СРБ рода Desulfovibrio довольно низкая. Для бактерии Desulfovibrio desulfuricans G20 удельная скорость роста уменьшалась при концентрации ионов меди 0,4 мг/л [7], для других представителей этого рода рост ингибировался при 4-9 мг/л ионов меди (II) [8, 9]. Нами впервые описаны штаммы бактерий Desulfovibrio spp., устойчивые к меди (II) в концентрации до 2600 мг/л [10]. Бактерии Desulfovibrio sp. R2, выделенные из проб сточных вод предприятия «РОЛТОМ» по производству шарикоподшипников, выдерживали концентрации ионов двухвалентной меди до 800 мг/л [8].

Одним из важных параметров, влияющих на восстановление сульфата в анаэробных осадках [11], а также на скорость сульфатредукции в осадках ветландов, загрязненных металлами, является температура [12]. Кроме того, она оказывает влияние и на продукцию сероводорода СРБ. Описаны случаи, когда оптимальные температуры для роста и дыхания бактерий отличались между собой, оптимум для дыхания клеток был выше, чем для роста их численности [13].

Целью данной работы являются определение оптимальной температуры роста для устойчивых к ионам меди бактерий Desulfovibrio sp. R2, изучение образующихся осадков сульфидов меди современными физико-химическими методами в условиях оптимальной температуры.

Материалы и методы исследования

В работе были использовали бактерии штамма Desulfovibrio sp. R2, выделенные из проб сточных вод предприятия «РОЛТОМ» и поддерживаемые в лаборатории биотехнологии и биоинженерии кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического института Томского государственного университета. Культивирование бактерий проводили в анаэробных условиях с использованием пресноводной среды Видделя [14] с лактатом в качестве донора углерода и электрона. Подробно культивирование устойчивых к меди изолятов СРБ описано нами ранее [8]. Визуальное наблюдение за ростом культуры проводили путем фазово-контрастного микроскопирования с использованием исследовательского микроскопа Axio Star (Carl Zeiss).

Влияние температуры на рост клеток и образование сероводорода в культуре бактерий оценивали по продукции биомассы (концентрации белка) и образованию сероводорода. Эксперименты по определению концентрации белка и сероводорода в процессе роста микроорганизма проводили в трех повторностях при температурах в диапазоне от +18 до +38°С. Питательную среду с инокулятом (10%) анаэробно разливали в пенициллиновые флаконы. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури с использованием фенольного реактива Фолина [15]. Концентрацию сероводорода определяли спектрофотометрически по методике Пахмайера [16]. Кинетические параметры роста - удельную скорость (µ) и период удвоения культуры (Td) - определяли, используя данные о концентрации белка в разных временных точках [17]. Данные, полученные в ходе экспериментов, обрабатывались с помощью пакета Microsoft Office Excel 2003 и представлены в работе в виде средней со стандартным отклонением.

Для изучения образования сульфидов бактерии Desulfovibrio sp. R2 культивировали на среде Видделя с добавлением ионов меди в концентрации 250 мг/л по описанной методике [8]. Выращивание культуры проводили в течение 9 и 58 сут. Образовавшийся после культивирования осадок собирали и концентрировали на центрифуге Eppendorf 5804R (Германия) при 5000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок высушивали на воздухе и измельчали до состояния порошка. Порошок исследовали с использованием сканирующего электронного микроскопа Philips SEM515 (Голландия). Энергодисперсионный анализ проводили с помощью микроанализатора EDAX. Съемка производилась при ускоряющем напряжении 30 kV, фокусное расстояние 12 мм, размер зонда 50-100 нм.

Результаты исследования и обсуждение

Определение оптимальных температур роста и образования сероводорода

Изменение концентрации белка бактерий Desulfovibrio sp. R2 с течением времени при различных температурах показано на рис. 1. Кривые роста бактериальной культуры имели классический S-образный вид. Для каждой температуры культивирования определены продолжительность лаг-фазы, удельная скорость роста и период удвоения культуры (таблица).

Кинетические параметры роста, выход биомассы и сероводорода

Desulfovibrio sp. R2 при разных температурах

Наименьшую продолжительность лаг-фазы (4 ч), максимальную скорость роста (0,37±0,15 ч-1) и наименьший период удвоения (2,12 ч) наблюдали при температуре культивирования +35єС. При понижении и повышении температуры продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 23,5 ч при +18єС и 10,5 ч при +38єС. При снижении температуры с +32 до +28єС продолжительность лаг-фазы и период удвоения также возрастали.

Несмотря на то что максимальная скорость роста бактерий обнаружена при температуре +35єС (рис. 2), максимальную концентрацию биомассы наблюдали при +28єС, а сероводорода - при +22єС. В целом, кривые изменения концентрации сероводорода в среде с течением времени (см. рис. 3) соответствовали кривым роста бактериальной культуры (рис. 1). Следует заметить, что максимальные концентрации сероводорода в среде с культурой бактерий в исследованном диапазоне температур отличались незначительно (от 52,9±8,67 до 68,9±3,75 мг/л). Для дальнейшего изучения образования сульфидов меди бактериями была выбрана температура культивирования +28єС, т.к. именно при этой температуре образуется наибольшее количество биомассы.

ВремяВремя, , часч

Рис. 1. Изменение концентрации белка в культуре бактерий Desulfovibrio sp. R2 с течением времени при культивировании в условиях разных температур:

1 - 18єС; 2 - 22єС; 3 - 32єС; 4 - 28єС; 5 - 35єС; 6 - 38єС

дельтопротеобактерия desulfovibrio сероводород

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ТемператураТемпература, є, СС

Рис. 2. Зависимость удельной скорости роста бактерий Desulfovibrio sp. R2 от температуры

времяВремя, , часч

Рис. 3. Изменение концентрации сероводорода в культуре бактерий Desulfovibrio sp. R2 с течением времени при культивировании в условиях разных температур:

1 - 18єС; 2 - 22єС; 3 - 32єС; 4 - 28єС; 5 - 35єС; 6 - 38єС

Образование сульфидов меди

Исследование размеров и элементного состава сульфидов меди, образованных бактериями Desulfovibrio sp. R2, проводили с помощью сканирующего микроскопа. Обнаружили, что средний размер частиц осадка составлял 75 мкм (рис. 4, а) при культивировании бактерий в течение 9 дней, в то время как при культивировании в течение 58 дней частицы имели более крупные размеры, до 300 мкм (рис. 4, в). Частицы осадков, наблюдаемые в контроле без инокулята, были значительно меньше (рис. 5, а), их средний размер составлял около 10 мкм. Энергодисперсионный анализ осадков показал, что основными элементами, входящими в состав осадков, образованных в среде бактериями штамма R2, являлись медь и сера, как в экспериментах с непродолжительным, так и более длительным периодом культивирования. Также в полученных спектрах присутствовали железо и в небольших количествах кислород, углерод и фосфор (рис. 4, б, г). Соотношение содержания в осадке серы и меди составляло 1:1,3 при непродолжительном культивировании бактерий штамма R2 - 9 сут и 1:1 при культивировании их в течение 58 сут. В контрольном образце основные пики соответствовали меди и кислороду. Также в контроле присутствовали железо и фосфор, а количество серы было значительно меньше, и его содержание к меди составляло 1:7,5.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

б

Рис. 5. Микрофотография (а) и энергодисперсионный спектр осадка (б), образованного в контроле без инокулята после 11 дней культивирования

Установлено, что оптимальная температура роста для бактерий штамма Desulfovibrio sp. R2, устойчивых к повышенным концентрациям меди, составляла +35єС. При этом максимальное количество микробной биомассы образовывалось при более низкой температуре, а максимальная концентрация сероводорода во всем исследованном интервале температур изменялась незначительно. Для экспериментов по изучению образования сульфидов меди была выбрана температура +28єС, т.к. именно в этих условиях образовывалась максимальная микробная биомасса. При образовании сульфидов клетки могут служить сайтами нуклеации будущих кристаллов, поэтому при оптимизации процесса образования биогенных сульфидов высокая плотность клеток в среде имеет большое значение. В случае промышленного применения процесса низкие температуры позволят снизить затраты на обеспечение энергией предприятия.

Соотношение атомов серы и меди, обнаруженное в биогенном осадке методом энергодисперсионного анализа, соответствовало минералу ковеллиту с химической формулой CuS. Образование ковеллита было ранее продемонстрировано в условиях накопительных [6] и чистых культур [10] СРБ. Возможно, первоначальное связывание серы с медью происходит в виде дефицитного по сере сульфида меди, т.к. соотношение S:Cu увеличивалось при более продолжительной инкубации и было близко к 1 после 58 сут культивирования. Вероятной кристаллической фазой на ранних стадиях культивирования может быть халькоцит (Cu2S).

Возможно, в процессе культивирования происходит превращение одной формы сульфида в другую, т.к. известно, что различные формы сульфида меди в зависимости от температурных и других условий могут трансформироваться друг в друга.

Известно, что в условиях диагенетического образования сульфидов меди в природных условиях устанавливается равновесие между процессом образования сероводорода СРБ и переходом S2- в твердую фазу [18]. При повышении концентрации сероводорода начальная форма CuS может сменяться борнитом (Cu5FeS4), а затем халькопиритом (СuFeS2). Присутствие на диаграммах пиков железа, как при культивировании в течение 9 дней, так и при более продолжительном культивировании, свидетельствует в пользу того, что борнит и халькопирит могут быть возможными кристаллическими фазами биогенного осадка. Возрастание соотношения S:Cu с увеличением срока инкубации свидетельствует о накоплении связанных сульфидов в осадке с течением времени. Небольшое количество серы, обнаруживаемое в контроле без инокулята, связано с внесением абиогенного сероводорода в форме Na2S в питательную среду в качестве восстановителя. Теоретически в условиях питательной среды, использованной в наших экспериментах, могут образовываться нерастворимые соединения фосфата железа, о чем свидетельствуют небольшие пики фосфора, обнаруженные как в контроле без инокулята, так и в экспериментах на разных сроках культивирования. Присутствие кислорода может быть связано с частичным окислением меди до оксидов в процессе подготовки пробы для энергодисперсионного анализа.

Таким образом, температура +28єС является оптимальной для получения сульфидов меди с использованием устойчивого к высоким концентрациям меди штамма бактерий Desulfovibrio sp. R2. Можно предположить наличие нескольких кристаллических фаз сульфидов меди и смешанных сульфидов меди и железа при биогенном осаждении двухвалентной меди, а также смену одних форм сульфидов другими при увеличении срока культивирования.

Литература

1. Карначук О.В. Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими бактериями: Автореферат дис. … д-ра биол. наук. М., 2006. 53 с.

2. Kalin M., Cairns J., McCready R. Ecological engineering methods for acid-mine drainage treatment of coal wastes // Resour. Conserv. Recycl. 1991. Vol. 5. P. 26 -275.

3. Каравайко Г.И., Кузнецов С.И., Голомзик А.И. Роль микроорганизмов в выщелачивании металлов из руд. М.: Наука, 1972. 248 с.

4. Baas-Becking L.G.M., Moore D. Biogenic sulfides // Econ. Geol. 1961. Vol. 56. P. 259-272.

5. McNeil M.B., Jones J.M., Little B.J. Mineralogical fingerprints for corrosion processes induced by sulfate reducing bacteria // NACE Annual Conference. 1991. Vol. 580. P. 1-16.

6. Gramp J.P., Sasaki K., Bigham J.M., Karnachuk O.V., Tuovinen O.H. Formation of Covellite (CuS) Under Biological Sulfate-Reducing Conditions // Geomicrobiology Journal. 2006. Vol. 23. P. 613-619.

7. Sani R.K., Peyton B.M., Brown L.T. Copper-induced inhibition of Desulfovibrio desulfuricans G20: assessment of its toxicity and correlation with those of zinc and lead // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 4765-4772.

8. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Nicomrat D., Frank Yu.A. et al. Copper resistance in Desulfovibrio strain R2 // Antonie van Leeuwenhoek. 2003. Vol. 83. P. 99-106.

9. Cabrera G., Perez R., Gomez J.M., A. balos A., Cantero D. Toxic effects of dissolved heavy metals on Desulfovibrio vulgaris and Desulfovibrio sp. strains // J. Hazard Mater. 2006. Vol. 35. P. 40-46.

10. Karnachuk O.V., Sasaki K., Gerasimchuk A.L. et al. Precipitation of Cu-sulfides by Coppertolerant Desulfovibrio Isolates // J. Geomicrobiol. 2008. Vol. 25. P. 219-227.

11. Russell N.J. Cold adaptation of microorganisms // Philosophical Transaction of the Royal Society of London Series B. 1990. Vol. 329. P. 595-611.

12. Karnachuk O.V., Pimenov N.V., Yusupov S.K., Frank Y.A. et al. Sulfate reduction potential in sediments in the Norilsk Mining area, Northern Siberia // J. Geomicrobiol. 2005. Vol. 22. Р. 11-25.

13. Isaksen M.F., Jоrgensen B.B. Adaptation of psychrophilic and psychrotrophic sulfatereducing bacteria to permanently cold marine environments // Appl. Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62. P. 408-414.

14. Widdel F., Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria // The Prokaryotes: A handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification, applications. Eds. Balows A et al., 2nd edition, Berlin: Springer-Verlag. 1992. P. 3352-3378.

15. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, № 1. P. 265-275.

16. Pachmayr F. Vorkommen und Bestimmung von Schwefelverbindungen in Mineralwasser. PhD thesis, University Mьnchen, FRG. 1960. P. 238.

17. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1998. 720 с.

18. Лурье А.М. Происхождение медистых песчаников и сланцев // На основных направлениях науки. 1985. № 5. С. 102-112.

Размещено на Allbest.ru