Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах "псевдопитающих" клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах "псевдопитающих" клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster

Н.М. Немирович-Данченко, В.Н. Стегний

Аннотация. Изучена локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на политенных хромосомах Drosophila melanogaster. Обнаружено, что ДНК хромоцентра Drosophila orena диспергирована у Drosophila melanogaster по всей длине хромосом. При этом анализ распределения ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах из «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволил выявить как общие, так и тканеспецифичные места её локализации.

Ключевые слова: Drosophila orena, Drosophila melanogaster, политенные хромосомы, мутация otu11, «псевдопитающие» клетки, клетки слюнных желез.

днк drosophila хромосома локализация

К настоящему времени сформировалось представление о гетерохроматине как наиболее изменчивой части генома. По содержанию и распределению гетерохроматина могут сильно различаться близкородственные виды и даже разные популяции одного вида [1, 2]. Кроме того, может значительно варьировать представленность гетерохроматических районов в разных тканях одного организма, что обусловлено разной реплицированностью соответствующих последовательностей [3, 4]. В нашем исследовании изучали распределение ДНК, взятой из хромоцентра Drosophila orena, на хромосомах Drosophila melanogaster, причём исследовались хромосомы двух типов клеток: «псевдопитающие» клетки яичников и клетки слюнных желез.

Материалы и методы

Материалом исследований служили мухи Drosophila melanogaster. Для работы использовали мух дикого типа (линия Canton's) и мух, гомозиготных по мутации otu11 (линия y w otu11 sn3).

Цитологические препараты. Для приготовления препаратов политенных хромосом для гибридизации in situ использовались яичники самок, гомозиготных по мутации otu11, а также слюнные железы личинок из линии Canton's. Яичники и слюнные железы выделяли в 0,7% растворе NaCl и фиксировали в упрощенном растворе Карнуа (этанол и ледяная уксусная кислота 3:1), затем яичники инкубировали в 45% уксусной кислоте в течение 5 мин, накрывали покровным стеклом и раздавливали. Препараты замораживали в жидком азоте, удаляли покровные стёкла при помощи лезвия бритвы, затем проводили по батарее спиртов (этанол) увеличивающейся концентрации (50% - при -20єС 5 мин, 70, 100% - при -4єС по 5 мин), инкубировали в растворе Карнуа при -4єС 5 мин, высушивали на воздухе в течение 5 мин, ополаскивали в 100% спирте и снова высушивали.

Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек. В работе использовалась библиотека ДНК хромоцентра Drosophila orena Dore1, полученная ранее в нашей лаборатории [5]. ДНК метили в 20 циклах полимеразной цепной реакции (амплификатор фирмы Eppendorf (Mastercycler® personal), температура крышки - 105оС). 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 20 мкл ПЦР-смеси: 1ЧПЦР - буфер, 0,2 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и 0,15 мМ дТТФ и 0,1 мМ Tamra-5'-dUTP, 1 мкМ DOP-праймера, 1 мМ MgCl2 и 2,5 ед. ДНК-полимеразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация при 94оС - 1 мин; отжиг при 56оС - 1,5 мин; элонгация цепей при 72оС - 2 мин; с завершающей элонгацией цепей при 72оС - 8 мин.

Флуоресцентная in situ гибридизация. Полученный ДНК-зонд использовали для проведения флуоресцентной in situ гибридизации на хромосомы «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез.

Приготовление гибридизационной смеси. К 10 мкл ДНК-зонда добавляли 1 мкл 5М NaCl и 10 мкл спермальной ДНК лосося (10 мг/мл). Полученную смесь перемешивали на вортексе, затем к ней добавляли 300 мл 96% этанола и оставляли на ночь. На следующее утро смесь центрифугировали 30 мин при 13,2 тыс. об/мин. Потом 96% этанол заменяли на такой же объём 70% этанола и снова центрифугировали 30 мин при 13,2 тыс. об/мин. 70% этанол сливали, а осадок высушивали 20 мин при 50°C. К осаждённому ДНК-зонду добавляли гибридизационную смесь в расчёте 12 мкл на препарат (50% деионизованного формамида, 10% декстрансульфата, 1% Tween 20, в 2ЧSSC, pH = 7). ДНКзонд растворяли в гибридизационной смеси 2 ч, перемешивая на вортексе.

Предгибридизационные обработки и гибридизация. Препараты хромосом промывали в 2ЧSSC при 37°C 3 раза по 5 мин, проводили по батарее спиртов (70, 80, 96% по 5 мин в каждом) при комнатной температуре. Затем их высушивали при 37°C 10 мин, обрабатывали пепсином (0,2 мг пепсина на 1 мл 10% 1 М HCl) при 37°C 10 мин, отмывали от пепсина в 1ЧPBS 2 раза по 5 мин при комнатной температуре и снова проводили по батарее спиртов при комнатной температуре. Потом препаратам давали высохнуть, после чего на них наносили гибридизационную смесь с ДНК-зондом по 10 мкл на препарат, накрывали покровными стёклами и выдерживали 5 мин при 75°C (денатурация ДНК-зонда и ДНК хромосом) и 18 ч при 37°C (гибридизация).

3. Постгибридизационные обработки и окрашивание хромосом. С препаратов удаляли покровные стёкла, после чего их промывали в 50% деионизованном формамиде (в 2ЧSSC) при 45°C 3 раза по 5 мин, в 2ЧSSC при 45°C 5 мин, в 2ЧSSC с добавлением 1 капли Tween 20 при 45°C 5 мин, в 0,2ЧSSC при 45°C 2 раза по 5 мин и в 0,1ЧSSC при 60°C 5 мин. Препараты проводили по батарее спиртов и высушивали. Для окрашивания хромосом на препараты наносили смесь DAPI - VECTASHIELD и накрывали покровными стёклами.

Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioImager (Zeiss, Германия), ССD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5.

Результаты

Ранее была проведена гибридизация зонда Dore1 на первичные политенные хромосомы трофоцитов Drosophila melanogaster [5]. В этом исследовании ДНК, гомологичная последовательностям зонда, была обнаружена только в прицентромерных районах. Первичные политенные хромосомы трофоцитов у Drosophila отличаются от обычных политенных хромосом укороченностью и сильной уплотнённостью структуры. Поэтому мы предположили, что какие-то районы, содержащие исследуемую ДНК, могли быть не выявлены из-за их трудной доступности для зонда. Мутация otu11 была выбрана нами в связи с тем, что в трофоцитах яичников гомозиготных по ней самок (в так называемых «псевдопитающих» клетках) образуются политенные хромосомы с хорошо развитой дисковой исчерченностью. Гибридизация зонда Dore 1 на хромосомы «псевдопитающих» клеток мутантов otu11 и на хромосомы слюнных желез позволила выявить многочисленные сайты связывания по всей длине хромосом (рис. 1, 2). Нами были идентифицированы районы хромосом, гибридизующиеся с зондом Dore1. При изучении хромосом «псевдопитающих» клеток мы основывались на работе Н.И. Мальцевой и др. [6], в которой авторы картировали политенные хромосомы «псевдопитающих» клеток, сопоставляя их дисковую исчерченность с таковой хромосом слюнных желёз. Сравнение распределения метки на хромосомах исследуемых тканей позволило выявить как общие, так и тканеспецифичные места локализации (табл. 1, 2).

Обсуждение

Как показывают наши данные, ДНК хромоцентра Drosophila orena у Drosophila melanogaster распределена по всей длине хромосом, локализуясь не только в прицентромерных, но и в интеркалярных районах. Drosophila orena, по всей видимости, является предком для видов подгрупп melanogaster и yakuba, в том числе и для Drosophila melanogaster. Об этом говорят комплексные данные по хромосомным инверсиям и последовательностям ДНК [7], а также проведённый в нашей лаборатории сравнительный анализ архитектоники ядер трофоцитов [8]. Схема эволюционных отношений в подгруппах melanogaster и yakuba дана на рис. 3, там же показано, как в филогенезе изменялась архитектоника ядер трофоцитов. Для Drosophila orena характерно объединение прицентромерных районов всех хромосом в локальный хромоцентр. У дочерних видов хромоцентр становится более диффузным или исчезает совсем, как у Drosophila melanogaster.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. FISH Dore1 на хромосомы клеток слюнных желез Drosophila melanogaster (линия Canton's): a, b, c, d, e, f - окраска DAPI; a', b', c', d', e', f' - Dore1, меченная Tamra-5'-dUTP; XL, 2L, 2R, 3L, 3R, 4 - плечи хромосом; стрелками и скобками обозначены районы, в которых произошла гибридизация с зондом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. FISH Dore1 на хромосомы «псевдопитающих» клеток Drosophila melanogaster (мутация otu11): a, b, c, d, e, f - окраска DAPI; a', b', c', d', e', f' - Dore1, меченная Tamra-5'-dUTP; XL, 2L, 2R, 3L, 3R, 4 - плечи хромосом; стрелками и скобками обозначены районы, в которых произошла гибридизация с зондом (в работе Мальцевой и др. [6. T. 3. C. 191] не было найдено сходства с хромосомами слюнных желез в районах 30 a - b, 66 a - b и 95 a - f. Поэтому определение локализации зонда в этих районах может быть неточным (30 a, 66 a и 95 a обозначены звёздочками))

Таблица 1

Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. Хромосомы X и 2

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Примечание. XL, 2L, 2R - плечи хромосом.

Таблица 2

Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. Хромосомы 3 и 4

Примечание. 3L, 3R, 4 - плечи хромосом.

Рис. 3. Схема видообразования подгруппы melanogaster и yakuba [8]

Уменьшение способности прицентромерных районов к эктопической конъюгации могло быть связано с тем, что значительная часть участвовавшего в ней прицентромерного гетерохроматина распределилась по плечам хромосом. Такая реорганизация могла быть связана с повышением активности мобильных элементов генома, которые, распространяясь из прицентромерных районов в интеркалярные, захватывали с собой блоки гетерохроматина. Заметим, что у Drosophila melanogaster, самого молодого вида в подгруппе, имеется значительно больше копий мобильных элементов, чем у предковых видов [9]. Это согласуется с рассматриваемой гипотезой, поскольку передвижение мобильных элементов может быть сопряжено с их дупликацией [10]. Правильность приведённых выше рассуждений подтверждают также данные о распределении копий мобильных элементов на хромосомах Drosophila orena и Drosophila melanogaster. У Drosophila melanogaster они обнаружены как в прицентромерных, так и в интеркалярных районах хромосом, тогда как у Drosophila orena - только в прицентромерных [9]. Наблюдаемое нами распределение зонда Dore1 по плечам хромосом Drosophila melanogaster, по всей видимости, является свидетельством происходившего в филогенезе перераспределения гетерохроматина. Выявленные в ходе сравнительного анализа различия по локализации метки между хромосомами «псевдопитающих» клеток мутантов otu11 и клеток слюнных желез линии Canton's могут объясняться как разным распределением исследуемой ДНК в этих линиях, так и её разной реплицированностью в исследованных тканях. Дальнейший анализ распределения разных классов ДНК Drosophila orena на политенных хромосомах «псевдопитающих» клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволит более детально выявить характер эволюционных преобразований гетерохроматина в подгруппе Drosophila melanogaster.

Авторы выражают искреннюю благодарность Т.А. Шелковниковой и К.Е. Усову за предоставление библиотеки Dore1 и И.Ф. Жимулёву за предоставление линии y w otu11 sn3.

Литература

Yoon J.S., Richardson R.H. Evolution in Hawaiian Drosophilidae // Evolution. 1978b. Vol. 32, № 3. Р. 475-484.

Ananiev E.V., Gvozdev V.A., Ilyin Y.V. Reiterated genes with varying location in intercalary polytene chromosomes // Chromosoma. 1978. Vol. 70, № 1. Р. 1-17.

Endow S.A., Gall J.G. Differential replication of satellite DNA in polyploidy tissues of Drosophila virilis // Chromosoma. 1975. Vol. 50, № 2. Р. 175-192.

Lozovskaya E.R., Slesinger S.I., Prokofieva-Belgovskaya A.A. Comparative study of human chromosome replication in primary cultures of embryonic fibroblasts and in cultures of peripheral blood leucocytes. III. Distribution of AT and GC-nucleotide pairs along length of chromosomes 1, 2, 3 and 16 in the two types of human cells // Chromosoma. 1977. Vol. 60, № 1. Р. 69-79.

Усов К.Е., Шелковникова Т.А., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Молекулярноцитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы melanogaster рода Drosophila // Цитология. 2008. Т. 50, № 12. С. 1043-1047.

Mal'ceva N.I., Gyurkovics H., Zhimulev I.F. General characteristics of the polytene chromosomes from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otu 11 and fs(2)B mutants // Chromosome Research. 1995. Vol. 3, № 3. Р. 191-200.

O'Grady P.M., Baker R.H., Durando C.M. et al. Polytene chromosomes as indicators of phylogeny in several species groups of Drosophila // Evolutionary Biology. 2001. Vol. 1, № 1. Р. 6-11.

Cтегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и проблемы филогенетических отношений в подгруппе melanogaster рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. 1994. T. 30, № 4. С. 478-483.

Biemont C., Cizeron G. Distribution of transposable elements in Drosophila species // Genetica. 1999. Vol. 105, № 1. С. 43-62.

Galas D.J., Chandler M. On the molecular mechanisms of transposition // Proc. Nati Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78, № 8. Р. 4858-4862.

Размещено на Allbest.ru