126 Т.Б. Лапирова

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реакция иммунофизиологических показателей молоди сибирского осетра (Acipenser baerii Brandt) на действие перметрина

Перметрин (пиперонилбутоксид) входит в класс пиретроидов - высокоэффективных инсектицидов с широким спектром действия, уничтожающих как взрослых насекомых, так и их яйца и личинки. Используют перметрин против вредителей сельскохозяйственных и декоративных культур, для борьбы с термитами.

Помимо этого, в последние годы перметрин вытесняет традиционно применяемые для уничтожения комаров фосфорорганические соединения. Это обусловлено, с одной стороны, его высокой эффективностью против организмов-мишеней, с другой - низкой токсичностью для млекопитающих и птиц и относительно коротким периодом полураспада. К серьезным недостаткам этого вещества можно отнести высокую токсичность для эстуарных рыб [1]. Значения 48-час. LC₅₀ для рыб весьма низки и для разных видов составляют от 0,05 до 97,0 мкг/л. Такая высокая чувствительность рыб к препарату может быть обусловлена недостаточностью ферментной системы, гидролизующей пиретроиды, а также высокой скоростью поглощения жабрами за счет высокой липофильности этих соединений [2]. В настоящее время из-за широкого распространения пиретроидных препаратов их присутствие выявлено в почвенных и поверхностных водах, что делает актуальным исследование влияния этих соединений на водные организмы, в том числе рыб. Вследствие большой важности этой проблемы она интенсивно изучается в последнее десятилетие, однако сведения носят разрозненный характер и в основном посвящены реакции на пиретроиды отдельных показателей, механизмы же действия этой группы токсикантов до сих пор не выяснены. Отсутствует информация о действии этих веществ на систему неспецифической защиты организма, являющейся у рыб приоритетной. Известно, что наиболее чувствительны к токсическим воздействиям рыбы на ранних этапах онтогенеза, поэтому действие ксенобиотиков предпочтительнее изучать на молоди. Поскольку литературные данные по влиянию пиретроидов на осетровых к настоящему времени отсутствуют, нами была проведена работа по исследованию действия перметрина на молодь осетра.

Цель настоящей работы - определение реакции наиболее общих иммунофизиологических параметров молоди осетра на присутствие в воде перметрина. В задачу исследования входил анализ следующих показателей: коэффициент упитанности; уровень общего белка и протективные свойства сыворотки крови; индексы иммунокомпетентных органов (селезенки, сердца и печени) и содержание лизоцима в их тканях.

Молодь сибирского осетра (Acipenser baerii Brandt) была получена с Волгореченского завода (Костромская область) по искусственному рыборазведению, акклимирована, к моменту начала эксперимента достигла возраста 2 мес. и имела среднюю массу 11,4±3,7 г и длину 61±11 мм. Содержали рыб по 35 особей в проточных пластиковых лотках объемом 250 л с речной водой. Токсикант подавали в воду в форме промышленного препарата перметрина до концентрации 0,1 мкг/л действующего вещества, что составило 0,1 от установленной 96-час. LC₅₀. Для поддержания постоянства концентрации токсиканта у подопытных рыб применяли дилютерную установку оригинальной конструкции [3]. Полный обмен воды в лотках как контрольной, так и подопытной групп рыб осуществлялся в течение суток. Рыб кормили ежедневно, отбор проб проводили через 1, 2, 4 и 8 недель после помещения рыб в раствор токсиканта. Материал получали от 5 контрольных и 5-8 подопытных рыб на точку в двух повторностях. Температура воды в период эксперимента составляла в среднем 17^оС.

Кровь получали из хвостовой вены после каудэктомии, сыворотку для серологических исследований отбирали пастеровской пипеткой после ретракции сгустка. После измерения и взвешивания рыб отбирали органы, взвешивали их, помещали в забуференный физраствор и замораживали до проведения анализа.

Коэффициент упитанности по Кларк рассчитывали как отношение массы порки к кубу длины рыбы, умноженное на 100. Индексы внутренних органов определяли в процентах от массы порки [4]. Одним из важнейших иммунокомпетентных органов у рыб являются почки, но поскольку на начальных этапах эксперимента масса их была очень мала, для исследования отбирали сердце, селезенку и печень, размер которых позволил провести корректный анализ данных. Содержание общего белка сыворотки крови определяли рефрактометрически.

Экстракты тканей органов получали по общепринятым методикам [5, 6]. Навеску исследуемого органа (не более 1 г) растирали в стеклянном гомогенизаторе, разводили 0,45%-ным физиологическим раствором c рН 6,2 в объемно-весовом отношении 1:1. После часового выдерживания при комнатной температуре гомогенаты подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию для более полного экстрагирования фермента. Центрифугировали пробы при охлаждении (+4^оС) в течение 30 мин при 10 тыс. об./мин.

В надосадочной жидкости определяли содержание лизоцима высокочувствительным нефелометрическим методом [7], основанным на способности фермента растворять оболочку бактерий Mycrococcus lysodeicticus. Для работы использовали суспензию лиофилизированных бактерий, в качестве стандарта для построения калибровочной кривой - лизоцим яичного белка. Концентрацию фермента рассчитывали в мкг/мг массы ткани.

Принцип метода учета бактериостатической активности сыворотки крови (БАСК) основан на ее способности угнетать рост микроорганизмов. Мы проводили определение этого показателя нефелометрическим методом, разработанным О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1966 г.), с использованием живой суточной культуры Aeromonas hydrophila [8]. Результаты приведены в процентах угнетения роста тест-культуры в среде, содержащей сыворотку крови по сравнению с контролем, где в среду вместо сыворотки добавлен физраствор.

Статистическая обработка результатов проведена в программе Microsoft Office Excel, статистическую значимость различий определяли по критерию Стьюдента при р?0,05. Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение.

Из всех исследованных параметров только на коэффициент упитанности перметрин не оказал выраженного влияния. Значения показателя в течение эксперимента незначительно колебались: от 0,28±0,02 до 0,33±0,01 и от 0,31±0,04 до 0,33±0,02 у контрольных и подопытных рыб соответственно, но значимых различий между этими группами не выявлено.

Все исследованные иммунофизиологические показатели претерпели значительные изменения. Иммунная система чрезвычайно чувствительна к любым как экзо-, так и эндогенным воздействиям и реагирует на них одной из первых [9]. Поэтому логично ожидать сдвигов в функционировании важнейших иммунокомпетентных органов, в том числе и изменений их относительных масс, при токсическом воздействии. Структура и функции иммунной системы рыб имеют некоторые особенности по сравнению с высшими позвоночными. Так, кроветворные и иммунные функции у рыб (т.е. развитие клеток, участвующих в иммунном ответе, и реализация ими своих функций) осуществляются в одних и тех же органах. Таким образом, гематопоэтические органы рыб одновременно служат и органами иммунной системы [10].

Помимо почек у рыб к наиболее важным органам гемо- и иммунопоэза относят селезенку. Ткань ее содержит большое количество клеток лимфомиелоидного ряда [11, 12], что обусловливает ее активное участие в реакции на неблагоприятные воздействия. Хрящевые ганоиды, к которым относятся осетровые, принадлежат к числу наиболее древних рыб, что объясняет некоторые отличия в организации иммунной системы этих рыб. Так, к характерным особенностям гемопоэза осетровых можно отнести наличие так называемого перикардиального органа, расположенного на вентральной стороне сердца. В строме ткани сердца экстраваскулярно идут процессы эритропоэза, гранулоцитопоэза, лимфопоэза [13-15], что позволяет отнести сердце к иммунокомпетентным органам. Печень у рыб, помимо детоксикационной, осуществляет также ряд защитных функций [16]. В обеспечении выполнения печенью иммунных реакций важная роль принадлежит имеющимся в ее ткани макрофагам - купферовым клеткам [15].

Как показали результаты нашего исследования, наибольшие колебания относительной массы под действием перметрина выявлены в селезенке; причем как подъем, так и снижение индексов органа были статистически значимы. К концу наблюдений значения показателя практически сравнялись с контролем. Индексы сердца, как и селезенки, достоверно снизились в первый срок отбора, далее разница между значениями контрольных и подопытных особей была статистически незначима.

Анализ полученных результатов показывает рост относительной массы печени в контрольной группе рыб на протяжении всего срока наблюдений. Это объяснимо для активно питающейся молоди в период интенсивного роста. При этом происходят значимое возрастание показателя у подопытных рыб относительно контроля к концу 2-й недели и резкое снижение к концу опыта.

Результаты проведенного эксперимента подтверждают активное участие всех исследованных органов в реакции на воздействие перметрина. Динамика изменения относительных масс сердца и селезенки в целом очень сходна (достоверное снижение показателя на первом этапе воздействия), имеются некоторые отличия лишь в размахе колебаний. Уменьшение индексов селезенки было описано при действии токсикантов различных классов на разные виды рыб. Так, показано, что при помещении тиляпии в раствор фосфорорганического пестицида индексы селезенки через 30 сут и до конца опыта (60 сут) были сильно снижены, что авторы объясняют интенсивным выбросом клеток из депо в кровеносное русло [17]. Аналогичная реакция выявлена и при хроническом действии поллютантов: у большинства исследованных черноморских видов рыб значения индексов селезенки у особей, обитающих в более загрязненной части акватории, были ниже, чем из менее загрязненной [18].

Здесь и далее в рисунках и таблице звездочкой отмечены статистически значимые отличия от контроля (р ? 0,05)

Сопоставление наших и литературных данных позволяет говорить о неспецифической реакции данного параметра на токсическое воздействие, обусловленной дополнительным выходом в кровь клеточных элементов для минимизации негативного влияния внешних факторов. Отмеченный нами позже (2 недели) подъем показателя вызван, видимо, усиленным кровотоком в работающем в форсированном режиме органе. Возрастание массы селезенки некоторые другие авторы [19] также связывают с более интенсивным кровообразованием, а следовательно, проявлением адаптации к меняющимся условиям среды. К концу наблюдений происходит возврат показателя и по сердцу, и по селезенке на контрольный уровень.

Кривая изменений гепатосоматического индекса отличалась от описанных для сердца и селезенки. Значительных сдвигов показателя к 1-й неделе экспозиции не выявлено, но ко 2-й он достоверно превысил контрольный уровень. Увеличение массы органа является характерным проявлением адаптивной реакции в ответ на токсический стресс [20], косвенно может указывать на развитие воспалительных процессов в органе на начальных этапах воздействия. Резкое снижение индекса печени к концу эксперимента свидетельствует о том, что фаза адаптации не наступила, ресурсы органа истощаются. Нестабильность относительных масс печени, выявленная в течение эксперимента, вызвана гепатотоксическим действием перметрина, вследствие чего возникают сбои в функционировании органа.

Нарушения в работе печени наглядно подтверждают также данные по уровню сывороточного белка, так как синтез основных плазматических белков у рыб осуществляется именно в этом органе [12]. Снижение концентрации сывороточного белка в нашем опыте отмечалось уже с первого срока отбора. Помимо нарушения процессов биосинтеза белка печенью снижение данного показателя может быть связано с усилением катаболических процессов, перераспределением белка между тканями и кровью, нарушением водно-солевого обмена.

Патологические изменения в структуре иммунокомпетентных органов (почек, печени и селезенки), являющиеся выражением неспецифической реакции тканей органов в ответ на действие разных групп пестицидов, подтверждаются гистологическими исследованиями [21].

Лизоцим является важнейшим фактором гуморального иммунитета. Он не только непосредственно нейтрализует кокковую флору, растворяя муреиновый слой клеточной стенки, но и принимает активное участие в общей регуляции иммунного ответа. Так, только в присутствии лизоцима иммунные комплексы способны активировать систему комплемента и подключать ее к антимикробной защите [22]. Предполагается, что лизоцим играет роль в поддержании гомеостаза в период адаптации к резким изменениям среды и, таким образом, может служить ранним биомаркером, свидетельствующим о нарушении защитных механизмов [23].

Сведений о реакции показателя в тканях органов очень мало, в основном приводятся данные по содержанию лизоцима в сыворотке крови. Большинство авторов сообщает о снижении активности сывороточного лизоцима при хроническом действии стрессоров самой различной природы, при этом на начальных этапах воздействия выявляются достаточно резкие колебания показателя. Возрастание концентрации лизоцима сыворотки на 14-е сут эксперимента обнаружено при изучении влияния стресса, вызванного высокой плотностью посадки [24]. Аналогичные изменения, причем одинаковые для лизоцима как плазмы, так и почек, обнаружены и при действии химических стрессоров: уровень фермента возрастал на протяжении 2 недель при помещении рыб (Paralichthys olivaceus) в раствор фенантрена [25]. Имеются сообщения об угнетении лизоцимной активности сыворотки крови при действии разных пиретроидных пестицидов. Бета-циперметрин и цигалотрин снижали уровень показателя, причем влияние последнего не зависело от дозы и продолжительности воздействия [26]. Приводятся данные о снижении уровня белков плазмы и активности лизоцима после 8 недель действия другого пиретроида - циперметрина [27].

Установлено, что основная масса фермента синтезируется тканевыми макрофагами и молодыми нейтрофилами [28], поэтому содержание лизоцима в ткани органа определяется количеством в нем клеток миелоидного ряда. Как уже упоминалось, сердце и селезенка у осетровых являются важными очагами кроветворения, содержание иммуноцитов в них намного выше, чем в печени, а следовательно, выше оказалась и концентрация лизоцима.

Самый высокий уровень содержания фермента у контрольных рыб выявлен в селезенке. Изменения показателя во всех органах в течение эксперимента в этой группе рыб были незначительны, в то время как у подопытных они были весьма выраженными (рис. 3). Максимальное превышение показателя по сравнению с контролем наблюдалось в экстрактах тканей сердца и селезенки в первый срок отбора - около 8 и 7 раз соответственно.

Под действием перметрина происходят колебания показателя на протяжении всего эксперимента, что свидетельствует о серьезных сдвигах в работе иммунной системы. Такие резкие подъемы концентрации лизоцима могут привести впоследствии к истощению ресурсов гуморальной защиты. Прогнозировать дальнейшее падение уровня фермента в тканях позволяют также данные о нарушении процессов гемоиммунопоэза, вызванных действием перметрина [29].

БАСК достаточно полно характеризует состояние врожденного иммунитета, поскольку включает в себя информацию об активности целого комплекса гуморальных защитных факторов. Обеспечивается она ингибирующими рост микроорганизмов веществами, лизинами, бактерицидными белками и т.п. Однако поскольку эти факторы в основном вырабатываются лейкоцитами, протективные свойства сыворотки крови косвенно позволяют оценить состояние и клеточного звена иммунитета. При исследовании защитных свойств сыворотки крови и экстрактов тканей разных видов рыб была выявлена неспецифическая реакция показателя на токсиканты разных классов, выражающаяся в резком возрастании показателя на начальных этапах воздействия. В зависимости от силы стрессора далее может происходить возврат БАСК к исходному уровню либо его снижение вплоть до полной инактивации факторов [30, 31].

В первые сроки эксперимента мы не смогли осуществить определение показателя вследствие малого количества получаемой крови, проведение анализа стало возможным только с 4-й недели. Следует сказать, что у осетровых рыб БАСК в целом намного ниже, чем, например, у карповых. Тем не менее у рыб, находящихся в растворе пестицида, были выявлены значимые различия по сравнению с контрольными особями (таблица).

перментин сибирский осетр иммунологический

Бактериостатическая активность сыворотки крови осетра, %

Литература

перментин сибирский осетр иммунологический

1. Rebach S. Acute Toxicity of Permethrin/Piperonyl Butoxide on Hybrid Striped Bass // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1999. Vol. 62. P. 448-454.

2. Baєer S., Erkoз F., Selvi M., Koзak O. Investigation of acute toxicity of permethrin on guppies Poecilia reticulate // Chemosphere. 2003. Vol. 51. P. 469-474.

3. Виноградов Г.А., Тагунов В.Б. Установка для изучения влияния различных веществ на рыб и беспозвоночных в проточных условиях // Гидробиологический журнал. 1989. Т. 25, №3. С. 74-77.

4. Методика морфофизиологических и биохимических исследований рыб. М.: ВНИРО, 1972. 132 c.

5. Каграманова Л.К., Ермольева З.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима // Антибиотики. 1966. Т. 11, №10. С. 917-919.

6. Вихман А.А., Генералова Л.П. Методические указания по количественному анализу гуморальных факторов резистентности в органах и тканях рыб. М.: ВНИИПРХ, 1991. 68 c.

7. Практикум по иммунологии: учеб. пособие / под ред. И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М.: МГУ, 2002. 224 с.

8. Методические указания по определению уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб. М.: Минсельхозпрод, 1999. 24 с.

9. Кондратьева И.А., Киташова А.А. Функционирование и регуляция иммунной системы рыб // Иммунология. 2002. №2. С. 97-101.

10. Кондратьева И.А., Киташова А.А., Ланге М.А. Современные представления об иммунной системе рыб. Ч. 1. Организация иммунной системы рыб // Вестник МГУ. Сер. 16. Биология. 2001. №4. С. 11-20.

11. Флоренсов В.А., Пестова И.М. Очерки эволюционной иммуноморфологии. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1990. 248 с.

12. Житенева Л.Д., Макаров Э.В., Рудницкая О.А. Эволюция крови. Ростов н/Д: Деловой мир, 2001. 114 с.

13. Fange R. Lymphoid organs in sturgeons (Acipenseridae) // Vet. Immunol. And Immunopathol. 1986. Vol. 12, №4. P. 153-161.

14. Tavassoli M. Bone marrow in boneless fish: lessons of evolution // Med. Hipotheses. 1986. Vol. 20, №1. P. 9-15.

15. Иванова Н.Т. Система крови. Материалы к сравнительной морфологии системы крови человека и животных. Ростов н/Д: Изд-во РГПИ, 1995. 155 c.

16. Арцимович Н.Г., Настоящая Н.Н., Казанский Д.Б., Ломакин Н.С. Печень как орган иммунобиологической системы гомеостаза // Успехи современной биологии. 1992. Т. 112, №1. С. 88-99.

17. Балабанова Л.В., Степанова В.М. Хроническое действие нафталина и дихлофоса на иммунокомпетентные клетки мозамбикской тиляпии (Oreochromis mossambicus Peters) // Биология внутренних вод. 2000. №4. С. 146-155.

18. Кузьминова Н.С. Видовые, сезонные, половые отличия индекса селезенки некоторых видов черноморских рыб и его подверженность антропогенному фактору // Вестник зоологии. 2008. Т. 42, №2. С. 135-142.

19. Кузьминова Н.С., Салехова Л.П. Индексы печени и селезенки как биоиндикаторы состояния черноморских рыб // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: сб. материалов конф. Петрозаводск, 2007. С. 81-82.

20. Goede R.W., Barton B.A. Organismic Indices and Autopsy-Based Assessment as Indicators of Health and Condition of Fish // Amer. Fish. Soc. Symp. 1990. Vol. 8. P. 93-108.

21. Заботкина Е.А., Лапирова Т.Б. Влияние пестицидов на иммунофизиологический статус рыб (обзор) // Успехи современной биологии. 2004. №4. С. 361-368.

22. Маянский Д.Н. Проблема иммунитета в общей патологии // Методологические аспекты современной иммунологии: сб. науч. трудов. Новосибирск: Наука, 1991. С. 74-84.

23. Weeks B.A., Anderson D.P., DuFour A.P. Immunological Biomarkers to Assess Environmental Stress // Biomarkers. Biochemical, Physiological and Hystological Markers of Anthropogenic Stress. Keystoun, 1989. 384 р.

24. Wang Wen-bo, Li Ai-hua, Wang Jian-guo, Cai Tao-zhen, Wu Yu-shen. Влияние стресса от чрезмерной плотности посадки на неспецифические иммунные функции у Ctenopharyngodon idellus // J. Fish. China. 2004. Vol. 28, №2. P. 139-144.

25. Jee Jung-Hoon, Kim Seong-Gil, Kang Ju-Chan. Effects of phenanthrene on growth and basic physiological functions of the olive flounder, Paralichthys olivaceus // J. Exp. Mar. Biol. and Ecol. 2004. Vol. 304, №1. P. 123-136.

26. Jin Xiao-min, Wu Yin, Lu Gang, Gui Yuan-ming, Liu Yan-fang. Влияние двух пиретроидных пестицидов на лизоцим и глутамат-пируват-трансаминазу сыворотки у Cyprinus carpio // Fish. Sci. 2006. Vol. 25, №8. P. 383-386.

27. Jee J., Masroor F., Kang J. Responses of cypermethrin-induced stress in haematological parameters of Korean rockfish, Sebastes schlegeli (Hilgendorf) // Aquacult. Res. 2005. Vol. 36, №9. P. 898-905.

28. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск: Издво Том. ун-та, 1974. 207 с.

29. Лапирова Т.Б. Влияние перметрина на лейкоцитарную формулу молоди осетра // Токсикологический вестник. 2009. №6. С. 21-25.

30. Лапирова Т.Б., Микряков В.Р. Влияние некоторых стресс-факторов на функциональное состояние гуморального звена неспецифического иммунитета молоди карпа // Вопросы рыболовства. 2005. Т. 6, №4 (24). С. 771-780.

Размещено на Allbest.ru