Влияние СКЭНАР-воздействия на интенсивность свободно-радикальных процессов и состояние про- и антиоксидантных систем плазмы крови и эритроцитов крыс при моделировании острой гипоксии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние СКЭНАР-воздействия на интенсивность свободно-радикальных процессов и состояние про- и антиоксидантных систем плазмы крови и эритроцитов крыс при моделировании острой гипоксии

Актуальность. В связи с расширяющимся применением СКЭНАР-терапии актуальным представляется изучение биохимических последствий СКЭНАР-воздействия на интактный организм. Многие патологические состояния включают гипоксию разной этиологии. Частота гипоксических состояний определяет актуальность поиска средств и методов повышения резистентности организма к гипоксии эндо- и экзогенного происхождения. Особенно перспективны в этом отношении неинвазивные и немедикаментозные методы [7, 12, 23, 27]. К числу последних относится электроимпульсная терапия высокоамплитудными коротковолновыми низкочастотными электрическими сигналами (СКЭНАР-терапия) [2, 3, 5, 15, 22]. Положительный и саногенетический и антирадикальный эффект получен при лечении заболеваний периферической нервной системы [1], неврозов [4, 8], варикозном расширении вен, дерматитах [13, 17], бронхиальной астме и хроническом бронхите [20], ишемической болезни сердца [11].

Цель исследования. Изучение механизмов свободно-радикальной продукции и состояния системы про- и антиоксидантной защиты у лабораторных животных (крыс) при СКЭНАР-воздействии, в ходе моделирования гипоксического состояния путём контролируемой гипобарии.

Материалы и методы.

Лабораторные животные. Эксперименты проводили на белых крысах самках Rattus norvegicus массой 180-200 г в возрасте 9 месяцев. Животные содержались в пластиковых клетках при стандартном режиме освещения и температуры, имели доступ к стандартному лабораторному корму ad libitum.

Дизайн эксперимента. Все подопытные животные были разделены на 4 группы: 1 группа (n = 10) - контроль - интактные животные; 2 группа (n = 10) - крысы, подвергнутые действию гипобарической гипоксии; 3 группа (n = 10) - крысы, которым в течение 5 проводили сеанс СКЭНАР-воздействия; 4 группа (n = 10) - животные, прошедшие предадаптацию с помощью СКЭНАР-обработки в течение 5 дней и подвергнутые сеансу гипобарической гипоксии.

Моделирование гипоксии. Осуществляли в режиме 230 мм. рт. ст. (9000 м над уровнем моря) в течение 180 минут. Подопытные животные помещались в барокамеру объемом 20 л, снабженную щелочным поглотителем углекислоты. Декомпрессию и компрессию проводили в течение 15 мин. Изопрессия составляла 150 минут.

Методика проведения СКЭНАР-воздействия. Животные 3 и 4 группы получали сеансы СКЭНАР-воздействия с помощью аппарата «СКЭНАР-1 НТ» (ОКБ «Ритм», г. Таганрог) контактной стабильной методикой на эпилированную кожу в области позвоночника в режиме Var, интенсивностью 10 Fm продолжительностью 5 мин один раз в сутки в течение 5 суток в одно и то же время в утренние часы.

Извлечение биологического материала. У экспериментальных животных кровь получали путём декапитации по завершению последнего сеанса СКЭНАР-воздействия у 3-ей группы животных и непосредственно после сеанса гипобарии у 4-ой группы животных. Кровь собирали самотёком в стеклянные центрифужные пробирки с добавлением раствора гепарина из расчёта 25 ЕД/мл и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин для получения плазмы и эритроцитов. Печень крыс промывали в ледяном физиологическом растворе и гомогенизировали в смеси, содержащей 150 мМ сахарозы, 100 мМ Tris/HCl буфера рН 8,0 и 10 мМ DTT. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, полученный супернатант использовали для определения активности ксантиноксидазы.

Определение биохимических показателей. Определение уровней глюкозы, молочной кислоты и мочевой кислоты в плазме крови осуществляли с помощью коммерческих наборов реагентов: «Глюкоза GOD-PAP» НПФ «АБРИС+», «Молочная кислота» НПФ «АБРИС+», «Мочевая кислота UR-PAP» НПФ «АБРИС+» [9]. Концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) определяли модифицированным методом Умбрайта (1949) [9]. Количественное определение ксантина проводили микрометодом Williams (1950) в цельной крови в модификации Погореловой и соавт. (1983) [18]. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в хлороформном экстракте по поглощению УФ света при длине волны 233 нм по Стальной (1977) [21].

Концентрацию шиффовых оснований определяли в хлороформном экстракте флуориметрическим методом при длине возбуждения 360 нм и длине эмиссии 440 нм по Bidlack (1973) [24]. Хлороформный экстракт готовили по методу Bligh и Dyer (1959) [25]. Уровень малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с тиобарбитуровой кислотой по Стальной и Гаришвили (1977) [21]. Активность супероксиддисмутазы СОД оценивали по ингибированию восстановления нитросинего теразолия (НТС) супероксидом, генерируемым при аутоокислении адреналина по Сироте (1999) [19].

Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония по Королюк (1988) [10]. Определение активности ксантиноксидазы (КО) проводиди спектрофотометрически в гомогенатах печени крыс по методу W. Kaminski и M. Jezewska (1979) [26]. Суммарную пероксидазную активность СПА оценивали по модифицированному бензидиновому методу [14].

Концентрацию белка в плазме крови определяли методом Лоури (1951) [28]. Содержание липидов в хлороформном экстракте определяли по реакции с фосфорнованилиновым реактивом с помощью коммерческого набора производства «Lachema» (Чехия).

Приборная база и статистическая обработка. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре DU 800, «Beckman Coulter» (США), спектрофлуориметрические исследования проводили на спектрофлуориметре RF-5301 C «Shimadzu» (Япония), анализ некоторых биохимических показателей осуществляли на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир 400» (Hirose Electronic Systems, Япония). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента и пакета программ “Statistica 6.0”.

Результаты исследования и их обсуждение

По завершению сеанса гипобарической гипоксии концентрация глюкозы в крови крыс 2-ой группы снизилась на 24%, тогда как содержание пирувата и лактата выросло в 2,6 и 3,4 раза от соответствующих значений контроля (см. рис. 1). Отношение лактат/пируват выросло на 50%. Полученные результаты свидетельствуют о развитии метаболических нарушений, связанных с быстрым истощением свободного пула глюкозы в плазме крови. Значительное увеличение содержание лактата на фоне отставания роста концентрации пирувата, а также возросшее отношение лактат/пируват свидетельствует о резком усилении процессов анаэробного гликолиза, на фоне общего замедления окислительных процессов и затруднении энергозависимых процессов ресинтеза гликогена из молочной кислоты.

Рис. 1 Изменение некоторых показателей углеводного обмена (глюкозы, лактата, пирувата, соотношения лактат/пируват) и системы пуринового обмена (ксантина, мочевой кислоты и активности ксантиноксидазы) в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией и СКЭНАР-воздействии (в % по отношению к контролю).

Рис. 2 Изменение содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъюгат, шиффовых оснований, малонового диальдегида) в эритроцитах крыс и плазме крови, а также активности СПА, СОД и каталазы в плазме крови крыс при оксидативном стрессе, вызванном острой гипоксией и СКЭНАР-воздействии (в % по отношению к контролю).

Животные, предадаптированные к действию гипобарической гипоксии путём проведения сеансов СКЭНАР-воздействия в течение 5 дней, показали более мягкое течение гипоксии. Концентрация глюкозы в плазме крови животных 4-ой группы статистически достоверно не изменилось по сравнению с контрольной величиной.

У предадаптированных СКЭНАР-воздействием животных по сравнению с крысами 2-ой группы содержание ПВК в плазме крови выросло на 16%, тогда как уровень лактата снизился в 1,5 раза, отношение лактат/пируват на 23%, что свидетельствует о наличии процесса катаболизма углеводовов, вызванного СКЭНАР-воздействием. Результаты исследования содержания лактата и пирувата дают основания предположить, что эффект СКЭНАР-воздействия связан с уменьшением глубины острой гипоксии, возможно сопряжённой с восстановлением уровня РО₂.

Уровень ксантина и мочевой кислоты в плазме крови животных, подвергнутых гипоксии увеличился в 4,2 и 1,7 раза в соответствии с физиологической нормой (см. рис. 1). Очевидно гипоксическое повреждение тканей индуцирует разрушение нуклеиновых кислот, что сопровождается образованием пуриновых оснований, с последующей их модификацией и ксантин. Эти процессы носят ярко выраженный характер, а высокие значения ксантина в плазме крови свидетельствуют о развитии острой гипоксии, как на уровне клеток, так и всего организма. Накопление ксантина, в свою очередь, индуцирует работу прооксидантного фермента ксантиоксидазы (КО). Активности КО в группе животных, подвергнутых гипоксии, достоверно увеличилась на 33%. Развитие гипоксического синдрома способствует переходу ксантиноксидоредуктазной системы из ксантиндегидрогеназной формы активности в ксантиноксидазную, а усиление сдвига равновесия НАДН/НАД⁺ дополнительно усиливает процессы ПОЛ. Содержание ксантина и мочевой кислоты в плазме крови крыс, прошедших предадаптацию СКЭНАР-воздействием к действию гипобарической гипоксии снизилось на 29% и 10% в соответствии к величинам животных,подвергнутых гпоксии без предварительных процедур. В дополнение к полученным результатам, падение ферментативной активности КО на 16% отражает наличие положительной динамики СКЭНАР-воздействия на стабилизацию процессов системы пуринового обмена.

Действие гипоксии, соответствующей высоте 9000 м над уровнем моря в течение 3 часов, сопровождалось активизацией ПОЛ, что находит отражение в достоверном накоплении первичных (ДК), вторичных (МДА) и конечных (ШО) продуктов окисления липидов в плазме крови и мембранах эритроцитов. Содержание как начальных, так и конечных продуктов окисления липидов в мембранах эритроцитов крови крыс, подвергнутых гипоксии увеличилось на 42 и 59% от соответствующих значений контроля (см. рис. 2). Развитие гипоксического синдрома у животных 2-й группы нашло своё выражение в приросте МДА в эритроцитах и плазме крови крыс на 35% и 16% соответственно.

СКЭНАР-воздействие на интактных животных характеризовалось достоверным снижением содержания некоторых продуктов ПОЛ относительно контрольных величин (см. рис. 2). Если концентрация первичных продуктов пероксидации достоверно не изменилась, то уровень ШО и МДА в эритроцитах крови животных 3-ей группы снизился на 39% и 11% соответственно. Применение к животным СКЭНАР-воздействия перед сеансом гипоксии оказывало корригирующее влияние на процессы ПОЛ. По сравнению с показателями животных, подвергнутых гипоксии без предварительных процедур, содержание ДК, ШО и МДА в эритроцитах статистически достоверно меньше на 20%, 8% и 11% соответственно.

Важнейшим следствием усиления ПОЛ и изменения структурных свойств эритроцитарных мембран является их дестабилизация и нарушение барьерных функций [6, 16]. Для оценки функционального состояния мембран форменных элементов крови после воздействия гипоксией нами были определены в плазме крови суммарная пероксидазная активность (СПА). У крыс, подвергнутых гипоксическому оксидативному стрессу по сравнению с контрольной группой, уровень СПА достоверно возрос на 72%.

Проведение предадаптации крыс путём СКЭНАР-воздействия не выявило существенной динамики в изменении структурных мембран эритроцитов и не показало достоверных изменений в 4 группе подопытных животных относительно крыс 2 группы.

Усиление свободнорадикального окисления в крови у крыс при гипоксическом воздействии может быть обусловлено изменением активности работы ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ). В условиях гипоксического синдрома происходит дисбаланс физиологического оксидант-антиоксидантного равновесия, о чём свидетельствует достоверная инактивация на 12% первичного фермента АОЗ-СОД в плазме крови животных подвергнутых гипоксии. Однако активность СОД в плазме крови животных 3 группы достоверно возросла на 12% по отношению к контролю, что свидетельствует об ингибировании свободнорадикальных процессов в крови и позитивном состоянии прооксидантно-антиоксидантного равновесия. Однако, данных достоверного увеличения активности фермента в плазме крови крыс после предадаптации аппаратом СКЭНАР и последующего сеанса гипоксии обнаружено не было.

Вторым по значимости ферментом первой линии АОЗ в живых системах является каталаза, проявляющая максимальную активность в отношении перекиси водорода при окислительном стрессе. Анализ динамики изменений активности каталазы свидетельствует о снижении биологической функции фермента на 36% в плазме крови животных, подвергнутых гипоксии. Достоверных результатов влияния СКЭНАР-воздействия на интенсивность каталитической активности у животных 3-ей и 4-ой групп не обнаружен. Тем не менее, животные предадаптированные к действию гипобарической гипоксии путём проведения сеансов СКЭНАР-воздействия в течение 5 дней, показали более мягкое течение гипоксии, что проявлялось в снижении активности фермента каталазы на 33% по сравнению с контрольной группой.

Заключение

Таким образом, особенностью обменных процессов крыс в остром периоде гипоксического синдрома является активизация свободно-радикального окисления и аварийная перестройка метаболизма углеводов, направленная на восстановление энергетического баланса клеток и тканей в условиях резкого дефицита кислорода за счёт альтернативного синтеза АТФ путём субстратного фосфорилирования. В плазме крови формируется комплекс изменений, характерных для гипоксических поражений - депрессия ферментов антиоксидантной защиты, нарушение пуринового обмена, активация гликогенолиза и ПОЛ, с накоплением конечных продуктов. В случае предадаптации животных СКЭНАР-воздействием, в условиях острой гипоксии, в плазме крови крыс отмечено формирование протекторного влияния электроимпульсной терапии на такие биохимические показатели, как уровень ксантина, лактата, мочевой кислоты и МДА, что свидетельствует о снижении тяжести гипоксического состояния, ингибировании свободнорадикального окисления у экспериментальных животных.

Литература

скэнар гипоксический плазма кровь

1. Воляник Т.А. Опыт применения СКЭНАР- терапии в лечении некоторых болевых синдромов в неврологии// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,1999.-Вып.5.-С.-59-62.

2. Гринберг Я.З. СКЭНАР-терапия: эффектиность с позиций методов электролечения// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза.-Таганрог, 1999,-Вып.2.-С. 18-32.

3. Гринберг Я.З. Эффективность СКЭНАР-терапии. Физиологические аспекты// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-1998.-Вып.4.-С.8-19.

4. Гужавина Г.П. СКЭНАР-терапия для реабилитации детей в психоневрологическом санатории// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,1999.-Вып.2.-С.62-64.

5. Гуляев В.Ю. Щеколдин П.И., Чернышёв В.В. Лечебное применение импульсной низкочастотной терапии/ Уральское медицинское обозревание. - 2001,-№2.-С.-47-54.

6. Дубинина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментативной антиоксидантной защиты плазмы крови человека// Биохимия.- 1993.-Т.58;вып.2.-С. 268-273.

7. Дудченко А.М., Лукьянова Л.Д. Триггерная роль энергетического обмена в каскаде функционально-метаболитических нарушений при гипоксии // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. М., 2004. С. 51-84.

8. Зилов В.Г., Кудаева Л.М., Ревенко А.И. и др. Методика коррекции клинических проявлений соматических, хирургических, неврологических заболеваний электростимулятором «СКЭНАР»: Пособие для врачей. -М.: 2000.

9. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь.-1982.-С. 290-292.

10. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы// Лабор. дело. 1988.-№1.-С.16-19

11. Крайнова Н.Н., Гуськова Е.Н., Милютина Н.П., Внуков В.В. Свободнорадикальное окисление при ишемической болезни сердца и коррегирующее влияние СКЭНАР-терапии // Известия высших учебн. заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Ростов н/Д, 2007, № 6, С.64-67.

12. Кулагин В.К., Болдина И.Г. Основные принципы борьбы с гипоксией при шоке //Пат. физиол. И эксперим. терапия. - 1981. - №4. - с. 10-15.

13. Лебеденко А.А. СКЭНАР-терапия при атопическом дерматите у детей// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-2001.-Вып.7.-С.86-87.

14. Лукаш А.И., Внуков В.В., Ананян А.А. и др. Металлсодержащие соединения плазмы крови при гипербарической оксигенации (Экспериментальные и клинические аспекты) Ростов-на-Дону. 1996. -108 с.

15. Маклецова М.Г., Гринберг Я.З., Сталбов А.Э. и др. Влияние СКЭНАР- воздействия на интенсивность перекисного окисления липидов // СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,2001.-Вып.7.-С.-37-38.

16. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / М.: Фирма «Слово», 2006. - С. 11-140.

17. Олисов Д.Е. СКЭНАР-терапия в лечении дерматологических больных// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-1999.-Вып.5.-С.76-78.

18. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Осташевская М.И., Длужевская Т. Способ определения ксантина и гуанина микрометодом Williams J. М. в модификации Т.Н. Погореловой и соавт. Особенности пуринового и нуклеотидного обмена у ювенильных крыс с аллоксановым диабетом// Проблемы эндокринологии.- 1983.- Т. 29. С. 82 - 85.

19. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопр. мед. химии. - 1999. № 3 . - С. 14 - 15.

20. Смирнова И.Н. Результаты СКЭНАР- и галотерапии при обструктивных заболеваниях лёгких// СКЭНАР-терапия и СКЭНАР-экспертиза. -Таганрог,-2001,-Вып.7.-С.108-110.

21. Стальная И.Ф., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1977. - С. 63-64.

22. Тараканов А.В., Гринберг Я.З., Милютина Н.П. Универсальные механизмы действия СКЭНАР при оксидативном стрессе// Рефлексотерапия.-2003.-№4.-С. 41-45.

23. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Современые представления о патогенезе гипоксий. Классификация гипоксий и пусковые механизмы их развития // Современные наукоемкие технологии.- № 5.- 2006.- С. 23-27

24. Bidlack W.R. Tappel A.T. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation// Lipids, 1973. V. 8. N.4. P. 203 - 209.

25. Bligh E., Dyer W., Rapid method of lipids extraction and purification// Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37.N.8. P. 203-209.

26. Kaminski W., Jezewska M. Intermediate dehydrogenase - oxidase form of xanthine oxidoreductase in rat liver// Biochem.J.-1979.-№181.-Р.-177-182.

27. Lewin B.I. Evolutions: free radical protection systems// J. of NIH Res.-1997.-V.9.-P.65-72.

28. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.. - 1951. - Vol. 193. - P. 265 - 275.

Размещено на Allbest.ru