Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Казанский национальный исследовательский технологический университет. Ул. К. Маркса, 68. г. Казань, 420015. Республика Татарстан. Россия. Тел.: (843) 231-41-65. E-mail: gamaur@kstu.ru.

Кафедра пищевой биотехнологии.

Влияние состава питательной среды на липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica

Гамаюрова* Валентина Семеновна,

Зиновьева*⁺ Мария Евгеньевна,

Чан Тхи Тху Хыонг и Васильева Анна Вячеславовна

*Ведущий направление; ⁺Поддерживающий переписку

Аннотация

культивирование дрожжи липолитический азот

Подобран состав питательной среды для культивирования дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий повысить липолитическую активность культуры в 2.8 раз. Установлено, что неоргани-ческие источники азота не используются культурой для роста и выработки липазы. Определено, что хорошими источниками азота для данной культуры являются пептон, необезжиренная и обезжиренная соевая мука. Определены оптимальные концентрации исследуемых источников азота. Установлено, что введение твина-20 в состав питательной среды приводит к повышению липолитической активности культуры. Показано, что при культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica наиболее высокая липоли-тическая активность наблюдается на среде следующего состава: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, обезжиренная соевая мука - 40 г/л, твин-20 - 0.001 мг/мл при температуре культивирования 30 °С и продолжительности биосинтеза 24 часа.

Ключевые слова: дрожжи Yarrowia lipolytica, источник азота, липолитическая активность, твин-20.

Внедрение липаз микробного происхождения в промышленное производство имеет большое значение для народного хозяйства. Сферы их практического использования очень обширны: пищевая, текстильная, кожевенная промышленность, медицина, сельское хозяйство, бытовая химия и другие [1].

Однако в промышленном масштабе экономически выгоднее производить липазы, высо-коактивные в широком диапазоне рН и температур, а также обладающие разными свойствами и специфичным действием. В этой связи не вызывает сомнений целесообразность отбора и селекции новых штаммов-продуцентов с высоким уровнем липолитической активности [2].

Диморфные аскомицетные дрожжи Yarrowia lipolytica являются перспективным объек-том для получения промышленно ценной липазы.

В данной работе осуществлялся подбор состава питательной среды для повышения липолитической активности дрожжей Yarrowia lipolytica.

Экспериментальная часть

Работу проводили с культурой дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica Y-3153. Данный штамм был получен из Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов. Регистрационный номер в коллекции Y-3153 (АТСС 34088). Посевной материал выращивали на плотной питательной среде: сусло-агар с содержанием сахаров - 5-5.5%. Посевной материал выращивали в течение 24 часов, суспендировали в физ. растворе и вносили в жидкие питательные среды в количестве 10 % от объема питательной среды.

Дальнейшее культивирование дрожжей вели на жидкой питательной среде следующего состава: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - концентрация варьировалась от 5 до 15 мл/л, источник азота - концентрация варьировалась от 5 до 50 г/л, твин-20 (полиокси-этилен 20 сорбитан монолаурат) - концентрация варьировалась от 0.00001 до 1.0 мг/мл. В качестве источника азота применяли различные соединения в концентрациях указанных в табл. 1.

Табл. 1. Характеристика используемых источников азота и их концентрация

Дрожжи выращивали в аэробных условиях при t = 30 °С во встряхиваемых колбах (V = 100 мл) с объемом среды 15 мл на лабораторной качалке со скоростью вращения 250 об/мин в течение 24 ч.

По окончании инкубации содержимое колб тщательно перемешивали, биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (3000 об/ мин, 10 мин.). В надосадочной жидкости (осветленной культуральной жидкости) определяли содержание белка (биуретовым методом) и липолитическую активность (модифицированным методом Ота-Ямада) [3]. Активность липазы выражали в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 ч при гидролизе субстрата одним миллилитром культуральной жидкости.

Осадок из центрифужных пробирок дважды промывали дистиллированной водой и определяли концентрацию биомассы по сухому весу.

Результаты и их обсуждение

В данной работе исследовался штамм дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica Y- 3153(АТСС 34088). Штамм не является генетически модифицированным и относится к микроорганизмам непатогенным для человека.

В исследованиях была поставлена задача подбора состава жидкой питательной среды, для культивирования исследуемого штамма дрожжей, обеспечивающего максимальный выход липолитического фермента.

В ходе предварительных исследований была установлена оптимальная концентрация глюкозы в среде и найдено, что необходимо ввести липидный индуктор для увеличения продукции липазы дрожжами. В результате подбора компонентов питательной среды было установлено, что высокая липолитическая активность и хороший рост культуры наблюдался на среде следующего состава: глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, пептон - 10 г/л, оливковое масло 1 % [3].

Данная среда была взята за основу для дальнейших исследований, липолитическая активность при этом составила 75 ед/мл к.ж. при продолжительности культивирования 24 ч и далее рассматривалась как исходная липолитическая активность культуры. В ходе работы проводилось изменение концентрации отдельных компонентов среды и введение новых компонентов.

На первом этапе работы варьировали концентрацию дрожжевого автолизата в пита-тельной среде. Дрожжевой автолизат содержит многие витамины группы B и имеет высокую физиологическую и питательную ценность, поэтому часто применяется в качестве компонента питательной среды и увеличение его концентрации в среде может иметь положительное влияние как на рост, так и на липолитическую активность дрожжей [4].

Зависимость роста и липолитической активности культуры от концентрации дрожжевого автолизата в среде показана в табл. 2.

Как видно из представленных данных, увеличение концентрации дрожжевого автолизата в среде от 5 до 20 мл/л оказывает незначительное влияние на рост культуры, а липолитическая активность культуры даже снижается.

Важным фактором, определяющим интенсивность накопления липаз микроорганизмами, является источник азота в среде выращивания. Известно [5-7], что большинство проду-центов липаз используют для построения клеток и образования ферментов самые разно-образные источники азота, как органические, так и минеральные. Однако уровень липолити-ческой активности на этих источниках различен и определяется индивидуальными особен-ностями культуры.

Табл. 2. Зависимость липолитической активности культуры дрожжей Yarrowia lipolytica от концентрации дрожжевого автолизата. Состав среды: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5-15 мл/л, пептон - 20 г/л.

Было исследовано влияние на биосинтез липазы культурой дрожжей Yarrowia lipolytica следующих соединений: сульфата аммония, мочевины, пептона, соевой муки и обезжиренной соевой муки.

Рекомендуемая в паспорте культуры среда культивирования в качестве источника азота содержит пептон. Но данный источник азота является дорогостоящим. Ранее приведенные нами исследования с дрожжами Saccharomycopis lipolytica 35 и 36 показали, что достаточно высокая липолитическая активность наблюдается при использовании неорганических аммонийных соединений, таких как сульфат аммония, мочевина, хлорид аммония.

Поэтому были предприняты попытки заменить пептон на более дешевые минеральные источники азота, такие как сульфат аммония и мочевина. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Как видно из представленных данных, введение минеральных солей в среду культивирования приводит к существенному замедлению роста культуры, причем с повышением концентрации этих соединений, угнетение роста усиливается. Липолитическая активность при использовании неорганических соединений азота отсутствует.

Табл. 3. Зависимость липолитической активности культуры дрожжей Yarrowia lipolytica от концентраций сульфата аммония и мочевины. Состав среды: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л. дрожжевой автолизат - 5 мл/л, источник азота - 5-20 г/л. Время культивирования 24 ч.

В дальнейшем исследовалось влияние концентрации пептона на рост и липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica. Данные представлены в табл. 4.

Табл. 4. Зависимость липолитической активности культуры Yarrowia lipolytica от концентрации пептона. Состав среды: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, пептон - 10-30 г/л.

Как видно из представленных данных, увеличение концентрации пептона до 20 г/л, приводит к возрастанию липолитической активности на 33% по сравнению с исходной.

Дальнейшее же повышение концентрации пептона, хотя и приводит к увеличению концентрации биомассы, но не оказывает положительного влияния на липолитическую активность культуры.

По литературным данным, высокая липолитическая активность при культивировании различных видов микроорганизмов наблюдается на средах богатых сложными органическими соединениями, такими как кукурузная мука, соевая мука и прочее [4-8]. В ряде работ показано, что соевая мука является хорошим индуктором для образования липолитических ферментов для многих микроорганизмов. Кроме того, соевая мука является более дешевым субстратом, чем пептон [5, 6].

Ряд авторов предлагают использовать необезжиренную соевую муку. Так как связывают повышение липолитической активности культуры не только влиянием азотистых компонентов соевой муки, но и с влиянием липидов соевой муки на рост и липолитическую активность микроорганизмов [5, 6]. В связи с этим в работе исследовалось влияние как необезжиренной, так и обезжиренной соевой муки на липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica.

Первоначально исследовалось влияние необезжиренной соевой муки на липолити-ческую активность культуры. Вследствие того, что соевая мука является нерастворимым компонентом, измерение концентрации биомассы и содержания белка в среде было затруднено, поэтому измеряли только липолитическую активность культуры.

Зависимость липолитической активности дрожжей Yarrowia lipolytica от концентрации соевой муки, показана на рис. 1.

Представленные данные свидетельствуют о том, что липолитическая активность культуры плавно повышается с повышением концентрации соевой муки в среде, достигая максимума при концентрации - 30 г/л.

Рис. 1. Зависимость липолитической активности культуры дрожжей Yаrrowia lipolytica от концентрации необезжиренной соевой муки в среде культивирования. Состав среды: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, соевая мука - 5-40 г/л.

Рис. 2. Зависимость липолитической активности дрожжей Yarrowia lipolytica от концентрации обезжиренной муки. Состав среды: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л. дрожжевой автолизат - 5 мл/л, обезжиренная соевая мука - 10-50 г/л.

Дальнейшее увеличение концентрации соевой муки в среде приводит к некоторому снижению липолитической активности, что может быть обусловлено изменением реологиических свойств питательной среды. Установлено, что введение соевой муки в оптимальной концентрации эффективнее, чем использование пептона в качестве источника азота, так как липолитическая активность при этом выше примерно в 1.5 раза, по сравнению с исходной средой.

Активный синтез липаз на средах с соевой мукой одни исследователи объясняют действием ее липидного компонента, а другие фракцией содержащей белки и углеводы [10, 11]. Поэтому так же было изучено влияние обезжиренной соевой муки с низким содержанием жирового компонента. Данные представлены на рис. 2.

Как видно из представленных данных, оптимальной концентрацией обезжиренной соевой муки является - 40 г/л. При этом наблюдается максимальная липолитическая активность культуры, которая составляет 153 ед/мл к.ж.

По-видимому, для данной культуры соевая мука выступает только в качестве источника азота, а ее липидные фракции мало используются культурой.

Таким образом, исследование влияния различных источников азота, как минеральных, так и органических, на липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica показало:

Ш неорганические источники азота не усваиваются данной культурой;

Ш органические источники азота используются культурой для роста и способствуют повышению липолитической активности культуры, а наиболее высокая липолитическая активность наблюдается при введении обезжиренной соевой муки в концентрации 40 г/л и составляет 153 ед/мл к.ж.

ПАВ являются хорошими индукторами биосинтеза липазы для различных микроорга-низмов. Широко в этой связи упоминается - твины, желчные кислоты и их соли.

Однако эти сведения противоречивы. Даже у одного и того же продуцента Asinetobacter calcoaceticus ПАВ из одной - полиэтоксилатной - группы вызывали повышение активности до 15 раз или полное подавление роста [9, 10].

Табл. 4. Зависимость биосинтеза липазы культуры дрожжей Yarrowia lipolytica от концентрации Твина-20 в присутствии различных источников азота. Состав среды: оливковое масло - 1 % об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, источник азота, твин-20 - 0.00001-1.0 мг/мл.

ПАВ в составе питательной среды при культивировании продуцентов липаз могут оказывать разностороннее действие, и непосредственно на клетки, и на доступность нерастворимого в воде липидного индуктора для микроорганизма, и на процесс выделения фермента из клеток, и, возможно, на сам фермент [9].

В данной работе исследовалось влияние твина-20 на биосинтез липазы дрожжами Yаrrowia lipolytica при использовании различных органических источников азота (пептон, соевая мука, обезжиренная соевая мука).

Использование твина-20 при применении различных источников азота было интересно исследовать с той точки зрения, что эти источники азота имеют различную растворимость в водной среде.

Данные, полученные при изучении влияния твина-20 на биосинтез липазы дрожжей Yаrrowia lipolytica в присутствии различных источников азота, представлены в табл. 4.

Полученные результаты показывают, что высокие концентрации твина-20 (1.0 мг/мл) оказывают ингибирующее воздействие на липолитическую активность культуры, а в диапазоне концентраций 0.01-0.001 мг/мл наблюдается стимулирующий эффект при использовании сред различного состава.

При использовании в качестве источника азота пептона, повышение липолитической активности культуры наблюдалось в более узком диапазоне концентраций, чем в случае использования соевой муки.

Вероятно, в присутствии соевой муки в среде культивирования реализуются множест-венные механизмы действия твина. Наблюдается не только эффекты, связанные с эмульгированием масла и более активным выходом фермента в культуральную жидкость, но и воз-можно увеличивается доступность соевой муки для действия ферментов культуры, из-за того, что ПАВ улучшает распределение частиц соевой муки по объему среды культивирования и/или способствует выделению отдельных компонентов из соевой муки и увеличению их доступности для культуры.

Наибольший прирост липолитической активности наблюдается при использовании в качестве источника азота соевой муки и обезжиренной соевой муки при добавлении твина-20 в концентрации 0.001 мг/мл.

Заключение

Таким образом, наиболее высокая липолитическая активность при культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica наблюдается на среде следующего состава: оливковое масло - 1% об., глюкоза - 5 г/л, дрожжевой автолизат - 5 мл/л, обезжиренная соевая мука - 40 г/л, твин-20 - 0.001 мг/мл. При использовании данной среды удалось повысить липолитическую активность культуры в 2.8 раз относительно исходной.

1. Увеличение концентрации дрожжевого автолизата в среде выращивания улучшает рост культуры, но негативно влияет на липолитическую активность. Оптимальной концентрацией дрожжевого автолизата в среде является концентрация 5 мл/л.

2. Изучены потребности культуры дрожжей Yarrowia lipolytica в источниках азота. Установлено, что неорганические источники азота не используются культурой для роста и выработки липазы. Обнаружено, что хорошими источниками азота для данной культуры являются такие источники азота как пептон, необезжиренная и обезжиренная соевая мука. Определены оптимальные концентрации исследуемых источников азота. Показано, что наилучшим источником азота является обезжиренная соевая мука, которая обеспечивает высокую липолитическую активность культуры - 153 ед/мл к.ж. в концентрации 40 г/л.

3. Установлено, что введение в питательную среду культуры дрожжей Yarrowia lipolytica твина-20 (полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат) в концентрациях 0.01-0.001 мг/мл приводит к повышению липолитической активности в присутствии органических источников азота.

Благодарности

Работа выполнена на оборудовании ЦКП «Наноматериалы и нанотехнологии» при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту №_01201252915 от 28.02.2012 г тема: "Разработка биологически активных добавок на основе супрамолекулярных бионаносистем".

Литература

[1] Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е. Ферментативный катализ в неводных средах. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.25. №7. С.87-95.

[2] Давранов К. Микробные липазы в биотехнологии: обзорн. информ. Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т.30. №4. С.527-532.

[3] Зиновьева М.Е., Чан Тхи Тху Хыонг, Гамаюрова B.C. Влияние источника углерода и индукторов на рост и липолитическую активность дрожжей Yarrowia lipolytica. Вестник КГТУ. 2012. №7. С.168-173

[4] Паканещикова Н.В., Силищев Н.Н., Логинов О.Н. Влияние компонентов питательной среды на биосинтез липазы. Башкирский химический журнал. 2006. №2. С.16-19.

[5] Паканещикова Н.В., Силищев Н.Н., Логинов О.Н. Сравнительное изучение липолитической активности бактерий рода Serratia от состава питательной среды. Башкирский химический журнал. 2006. №4. С.31-34.

[6] Ксандопуло Г.Б., Рубан Е.Л. Влияние источников азота на синтез липазы грибами рода Geotrichum. Микробиология. 1974. Т.45. №4. С.510-515.

[7] Щелокова С.С., Табак М.Я., Закиров М.З. Влияние различных источников азота на биосинтез липазы Oospara lactis. Прикладная биохимия и микробиология. 1978. Т.14. Вып.4. С.494-496.

[8] Питрюк. И.А., Звягинцева И.С., Бабьева И.П., Рубан Е.Л. Влияние источников азота на синтез дрожжевых липаз. Микробиология. 1974. Т.43. №6. С.198-205.

[9] Шеламова С.А., Тырсина Ю.А. Индукция биосинтеза липаз микромицетом. Вестник ОГУ. 2012. №1. С.172-176.

[10] Шеламова С.А., Тырсина Ю.А. Некоторые каталитические свойства липазы Rhizopus oryzae 1403. Вестник ОГУ. 2009. №6. С.434-437.

Размещено на Allbest.ru