Цитопатическое действие вирусов

Человек не заражается вирусом висны-мэди, но у него есть свои медленные нейротропные вирусы. Прогрессирующая дегенерация нейронов головного мозга наблюдается при ВИЧ-инфекции, являясь одним из центральных проявлений синдрома приобретенного иммунодефицита. Вирус кори, персистируя в нейронах головного мозга, вызывает подострый склерозирующий энцефалит. Опасны паповавирусы (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия), вирус краснухи (прогрессирующий панэнцефалит как последствие врожденной краснухи), цитомегаловирус (цитомегаловирусная инфекция мозга), вирус простого герпеса (подострый энцефалит), аденовирусы типов 7 и 32 (подострый энцефалит), вирус клещевого энцефалита и другие тогавирусы (эпилепсия Кожевникова и прогрессирующий бульбарный паралич). Продолжаются поиски этиологических агентов таких медленных заболеваний ЦНС, как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, шизофрения, болезнь Альцгеймера.

Просматривается и тенденция к расширению классической концепции о медленных инфекциях. По логике к ним могут быть отнесены не только дегенеративные изменения ЦНС, но и ряд других заболеваний, вирусная (или вирусоподобная) природа которых доказана или может быть установлена в будущем. Например, медленной инфекцией можно считать СПИД (это относится не только к ВИЧ-индуцированному поражению ЦНС), хронический гепатит В и С, ретровирусный Т-клеточный лейкоз. В опытах на животных обнаружено влияние вирусной персистенции на функции эндокринных желез (карликовость, диабет), подозревается участие вирусов в развитии атеросклероза и аутоиммунных заболеваний. Здесь кроме новых герпесвирусов большой интерес вызывают эндогенные ретровирусы, которые обнаружены в различных тканях, включая плаценту. Наиболее радикальные сторонники патогенетически значимой персистенции вирусов связывают с ней развитие опухолей и даже старение организма.

Практическое значение цитопатического действия для выявления вирусов в биологическом материале и объектах окружающей среды

Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам (в том числе бляшкообразованию, тельцам включений).

Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование

«Бляшками» называют негативные колонии -- участки разрушенных клеток, выглядящие как зоны просветления на монослоях клеток, покрытых слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).

Тельца включений

Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований - скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварниери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Феномен гемадсорбции

Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.

Практическое значение цитопатического действия для испытания вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов в соответствии с ОФС.1.7.2.0006.15

Для производства вирусных вакцин допускается использовать только субстраты, одобренные национальными регулирующими органами. Если для приготовления иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) используются ткани животных или эмбрионы птиц, а также приготовленные на их основе клеточные культуры, то животные и эмбрионы должны поступать из изолированных, постоянно контролируемых хозяйств, свободных от специфической патогенной флоры (SPF), если в нормативной документации нет других указаний.

На присутствие посторонних агентов должны быть испытаны:

§ контрольные клеточные культуры (клетки, отобранные из производственного пула клеточных культур до внесения вакцинного штамма);

§ объединённый вирусный сбор вакцинного и посевного вирусов для живых и инактивированных вакцин;

§ объединённый вирусный сбор (полуфабрикат вакцины до добавления вспомогательных веществ) каждой серии живых вирусных вакцин.

Учитывая специфические особенности производства ИЛП, в нормативную документацию на них могут быть введены дополнительные требования.

Испытание контрольной клеточной культуры. Исследование в клеточных культурах

Испытанию подвергается не менее 500 мл незаражённой клеточной суспензии в концентрации, используемой для посева клеточных культур-продуцентов вакцины.

Отобранную в качестве контрольной клеточную суспензию разливают во флаконы, клетки оставляют незаражёнными и инкубируют в тех же условиях, что и клетки, используемые для производства вакцины. За контрольной клеточной культурой наблюдают до времени последнего сбора вирусов с культур-продуцентов вакцины, но не менее 14 сут. В конце периода наблюдения все флаконы с контрольными клеточными культурами исследуют с помощью светового микроскопа на наличие цитопатических изменений. Во время культивирования контрольных клеток не должно выявляться признаков специфической дегенерации.

По истечении срока наблюдения (после изучения монослоя под микроскопом) не менее 25% контрольных клеточных культур проверяют на наличие феномена гемадсорбции с 0,25% эритроцитами морской свинки, кур и человека I (0) группы, если нет других указаний в нормативной документации. Материал инкубируют в течение 30 мин сначала при температуре от 2 до 8 °С, а затем при температуре от 20 до 25 °С. Взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,9 % раствором натрия хлорида и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции.

Из оставшихся флаконов с контрольными культурами отбирают по 10 мл культуральной жидкости. Если на протяжении срока инкубации контрольных культур производят сливы вируссодержащей жидкости из производственных культур, то в те же сроки берут пробы культуральной жидкости из флаконов с контрольными культурами и сохраняют их при температуре не выше минус 20°С. В конце наблюдения пробы культуральной жидкости из контрольных клеточных культур объединяют и вносят по 10 мл в 3 клеточные культуры: гомологичную, приготовленную из другой партии производственного субстрата (например, фибробласты куриных или перепелиных эмбрионов), человека или обезьяны (например, диплоидные клеточные культуры человека или клетки Vero) и наиболее чувствительную для выявления вирусов - возможных контаминантов используемого субстрата (для птичьего субстрата - почки эмбриона кур). От каждой вновь испытуемой клеточной культуры оставляют по одному интактному (незаражённому) контрольному флакону. Все культуры выдерживают при температуре (36 ± 1)°С в течение 14 сут. По окончании срока наблюдения все контрольные культуры проверяют на наличие цитопатических изменений и феномена гемадсорбции, как указано выше.

Пробы считают прошедшими испытание, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция.

Если при исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирусный сбор, полученный в производственных культурах, не должен быть использован для приготовления вакцины.

Исследование вируссодержащего материала

Испытанию подлежит объединённый вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма и посевного вируса. При необходимости для определённых вирусных вакцин испытанию также подлежит объединённый вирусный сбор, полученный в процессе приготовления полуфабриката вакцины до добавления вспомогательных веществ, что должно быть указано в нормативной документации.

Контроль проводят в клеточных культурах, на животных и куриных эмбрионах (если в нормативной документации нет других указаний). Если образцы исследуют в течение первых 24 ч, то до проведения контроля их сохраняют при температуре от 2 до 8 °С. При проведении контроля в более поздние сроки образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 20°С. Размораживание материала в процессе контроля разрешается проводить не более одного раза.

Исследование в клеточных культурах

Если испытуемый материал вызывает в культуре цитопатогенное или гемадсорбирующее действие, используют предварительную нейтрализацию вируса иммунной сывороткой. Для получения иммунной сыворотки используют животных, ткани которых не применяют при приготовлении клеточных культур-продуцентов вакцины. Антиген для иммунизации животных готовят в клеточных культурах, не используемых для проведения контроля. Сыворотка не должна оказывать ингибирующего/токсического действия на ход анализа.

Испытуемый материал (не менее 50 мл вируссодержащей жидкости, если в нормативной документации нет других указаний) смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Смесь инкубируют при заданной температуре в течение времени (обычно 1-2 ч), необходимого для нейтрализации вакцинного штамма вируса (если нет других указаний в нормативной документации), затем вносят во флаконы с тремя указанными выше видами клеточных культур. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный флакон с незаражённой клеточной культурой.

Культуры клеток выдерживают при температуре (36 ± 1)°С 14 сут со сменой среды на 4 - 6 сут (если это необходимо). По истечении 14 сут опытные и контрольные клеточные культуры просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений, трижды замораживают и оттаивают, после чего производят пассаж на одноименной культуре, внося в нее не менее 25 мл неосветлённой культуральной жидкости. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать четырёхкратного. Если для испытания используют перевиваемую клеточную линию, то по истечении указанного срока инкубации возможно проведение субпассажа клеток.

После проведения пассажа опытные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре (36 ± 1)°С в течение 14 сут со сменой среды на 4 - 6 сут, периодически просматривая их под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции, как указано выше. Материал считают прошедшим контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция.

Вирус SV40

Вирус SV40 (Simian vacuolating virus 40) - обезьяний вакуолизирующий вирус 40) - это ДНК-содержащий вирус из рода полиомавирусов. К этому же роду принадлежит возбудитель полиомиелита.

Вирус был обнаружен в 1960 году в культурах почечных клеток макак-резусов. Эти культуры использовались для производства вакцины от полиомиелита, которой к тому моменту привили миллионы людей. В связи с этим Всемирная организация здравоохранения и американское правительство порекомендовали использовать для приготовления вакцин клетки зелёных мартышек, проверенные на отсутствие SV40. Тем не менее, уже выпущенные прививки отозваны не были, и их использование прекратилось в западных странах только в 1963 году.

После открытия SV40 выделяли у многих диких обезьян. Само по себе наличие вируса не вызывает у них никаких заболеваний, однако при хронических иммунодефицитных состояниях может привести к поражению почек и нервной системы.

Вскоре было показано, что при введении грызунам, в частности хомякам и крысам, SV40 может вызывать у них различные злокачественные новообразования, преимущественно костей, мозга, брюшины и иммунной системы.

С момента открытия SV40 начали проводиться исследования его роли в возникновении злокачественных опухолей у людей. Результаты этих исследований зачастую противоречили друг другу, а методика проведения не давала должной степени достоверности.

По расчётам, от 10 до 30 миллионов из 98 миллионов американцев, привитых в 1955-1963 годах, вместе с вакциной получили SV40. Проведённые исследования также показали, что прививка от полиомиелита - не единственный путь заражения этим вирусом. Так, ретроспективный анализ установил, что у 12 процентов немецких студентов-медиков антитела к SV40 вырабатывались еще в 1952 году, то есть до введения вакцины в клиническую практику. Точных данных о возможности и, при её наличии, частоте передачи вируса от человека к человеку, в том числе от матери ребенку, получить не удалось.

Как следует из доклада, сделанного на конференции по клеточным культурам для производства вакцин в 2004 году, не исключено, что прививки, применявшиеся в СССР и странах соцлагеря, Китае, Японии и Африке, могли содержать SV40 вплоть до 1980 года. Ни одна из вакцин, произведенных позже, этим вирусом не загрязнена.

Сотрудники НИИ медицинской приматологии РАМН обнаружили, что многие здоровые россияне в настоящее время могут являться носителями обезьяньего вируса SV40, сообщает агентство "Информнаука".

В исследовании приняли участие жители Москвы и Краснодарского края разных возрастных групп: 1956-1966 и 1967-1987 года рождения. Среди краснодарцев вирус был обнаружен в старшей группе у 13 из 23 человек, в младшей - у 36 из 77. Среди москвичей носителей вируса оказалось меньше - его нашли соответственно у 3 из 10 и у 5 из 40 обследованных. Все участники эксперимента клинически были здоровы. Специалисты планируют провести более масштабные исследования в разных областях России.

Очевидно, что если SV40 и может при определенных условиях вызывать болезни, то происходит это чрезвычайно редко, иначе эпидемия этих заболеваний уже наблюдалась бы среди миллионов привитых. Определённого внимания может заслуживать разве что изучение роли вируса при иммунодефицитных состояниях.

Российские исследователи, как сказано в сообщении, вопрос о возможном влиянии SV40 на здоровье человека пока не обсуждают.

Сумма накопленных по обезьяньему вирусу данных позволила Национальному институту рака США в 2004 году сделать заключение о том, что SV40, скорее всего, не вызывает рак у людей. Современные прививки, в любом случае, опасности заражения этим вирусом не несут.

Несмотря на это, вполне научные и, в общем, нейтральные результаты исследования российских медицинских приматологов стали поводом для публикаций в СМИ, поднимающих новую волну недоверия к профилактическим прививкам, что затрудняет борьбу с предотвратимыми инфекциями. Так, газета "Московский комсомолец" осветила исследование в статье, озаглавленной "Россиян подставили раком".

В то же время, вакцинация от полиомиелита, несмотря на загрязнение первых многомиллионных партий биопрепарата, стала одной из наиболее эффективных прививочных кампаний в истории человечества. Благодаря ей инвалидизирующее заболевание, принявшее в прошлом веке катастрофические масштабы, было практически искоренено в большинстве стран и сейчас регистрируется в основном в эндемичных районах Афганистана, Пакистана, Индии и Нигерии. Более эффективной оказалась лишь вакцинация от натуральной оспы, которая официально признана искорененной в декабре 1979 года.

Список использованных источников

1) А.Н. Маянский. Патогенетическая микробиология: руководство. Нижний Новгород: Издательство НижГМА, 2006. — - 520 с., ил. ISBN 5—-7032-—0643—-Х.

Размещено на Allbest.ru