Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

ФГБОУ ВПО «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»

Задание на выполнение

КУРСОВОЙ РАБОТЫ

Тема: «Методы определения молекулярной массы белков»

Кулешова Анастасия Павловна

Этапы выполнения работы

№ п/п	Наименование этапа работы	Срок выполнения	Отметка о выполнении	Подпись преподавателя
		План	Факт
1.	Подбор и анализ использованных источников
2.	Написание работы
3.	Оформление презентации
4.	Рецензирование работы
5.	Постановка (формулирование) целей и задач работы
6.	Формирование выводов по работе
7.	Проверка на наличие заимствований из общедоступных сетевых источников
8.	Оформление отчета
9.	Защита отчета

Цели, задачи и выводы по практической работе

Цель: изучить основные методы определения молекулярной массы белков в рамках использованной литературы.

Задачи:

1. Изучить научную литературу по заданной теме.

2. Ознакомиться с основными определениями настоящей темы.

3. Изучить специфику методов определения молекулярной массы белков в рамках использованной литературы.

4. Рассмотреть влияние белков на организм человека, руководствуясь данными использованной литературы.

Выводы:

1. Ознакомились с основными методами выделения и очистки белков, руководствуясь использованной литературой.

2. Исследовали три основных метода определения молекулярной массы белков на основании использованных источников.

3. Рассмотрели роль белков в питании, а именно их количественное содержание в продуктах питания и суточную норму потребления.

Содержание

Введение

1. Физико-химические свойства белков и методы их выделения

1.1 Физико-химические свойства белков

1.2 Методы выделения белков

1.2.1 Высаливание

1.2.2 Диализ

1.2.3 Гель-фильтрация

1.2.4 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

1.3 Методы очисти белков

2. Методы определение молекулярной массы белков

2.1 Метод гель-хроматографии на колонках

2.2 Метод гель-хроматография в тонком слое сефадекса

2.3 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфат натрия (NaC₁₂H₂₅SO₄)

3. Биологическая ценность белков и их роль в питании человека

3.1 Полноценность белкового питания

3.2Нормы белка в питании

3.3 Белковая недостаточность

Заключение

Список литературы

Словарь терминов и определений

Введение

Почти все органические соединения, состоят из молекул, количество атомов в которых чаще всего не превышает пятидесяти; эти атомы с трудом распадаются в условиях умеренной химической обработки. Однако существуют органические соединения с поистине гигантскими молекулами, построенными из тысяч и даже миллионов атомов. Эти молекулы состоят из сравнительно небольших «строительных блоков». Такие гигантские молекулы легко разложить на образующие их блоки, которые можно исследовать, как, например, поступил Левин, изучая нуклеотиды[1].

Выделение, очистка белков, нахождение их молекулярной массы во многом представляют собой самостоятельную область биохимии, и достигнутые здесь успехи в значительной мере предопределили тот огромный прогресс в наших знаниях о химии живого, который наблюдается в последние десятилетия. Овладеть этой наукой не так просто. Для этого мало знать теоретические основы используемых методов -- необходимо также научиться искусно обращаться с белками, и здесь советы «бывалых» людей крайне для нас ценны[8].

1. Физико-химические свойства белков и методы их выделения

Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией[4].

Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях[4].

Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств [4].

1.1 Физико-химические свойства белков

Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов[4].

1. Различия белков по форме молекул

По форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро (отталкивающего воду), и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки, которые имеют нитевидную форму и стабилизируются за счет межмолекулярных (в том числе и ковалентных) связей (исключение составляют мембранные белки) [4].

2. Различия белков по молекулярной массе

Белки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1000000 Да и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц) [4].

3. Суммарный заряд белков

Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются б-амино- и б-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apг и Гис[4].

Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО^- + Н⁺ > -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH₄⁺с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков[4]:

-NH₄⁺ +ОН^- > -NH₂ + H₂O.

Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют "изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии[4].

Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО^-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина[4].

Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (-). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле[4].

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского- Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в моче[3].

1.2 Методы выделения белков

Клетки содержат сотни, если не тысячи различных белков, и для того чтобы определить аминокислотный состав или аминокислотную последовательность того или иного белка, его прежде всего необходимо получить в виде чистого препарата[6].

1.2.1 Высаливание

Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. Наглядный пример высаливания представлен на рисунке 1.

Рисунок 1-Высаливание

При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов (светло-синие кружочки) связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН4)2SО4, разделить (фракционировать) смесь белков[5].

1.2.2 Диализ

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе[5].

На рисунке 2 представлен метод диализа.

Рисунок 2-Диализ

1.2.3 Гель-фильтрация

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет нам разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков (1б) вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля (1в). На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций (2). Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы (3) [5].

Пример реакции гель-проникающей и представлен на рисунке 3.

Рисунок 3-Гель-проникающая хроматография

1.2.4 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Пример данного метода представлен на рисунке 5.



Рисунок 5- Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфатом натрия [ДСН (SDS)] (C12H25OSO3Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики[5].

Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида (2). После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков (а); выделенного из экстракта гомогенного белка (б); контрольной смеси белков с известными молекулярными массами (в) [5].

1.3. Методы очисти белков

молекулярная масса белок

Проводить очистку ферментов можно с помощью сравнительно простого оборудования; к предметам первой необходимости относятся лишь центрифуги и УФ-спектрофотометр. Конечно, использование более сложного оборудования и автоматических систем значительно облегчает жизнь, но требует больших расходов[8].

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах[8].

На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка[8].

2. Методы определение молекулярной массы белков

Методы определения молекулярной массы белка можно разделить на химические, физико-химические и физические. К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала[7].

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их молярная масса варьирует в широких пределах - от 6000 до 100000 Да и более[3].

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез[3].

Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа обычно проводят в ультрацентрифугах, в которых удается создать центробежные ускорения (g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; последнюю выражают через константу седиментации s, которая зависит как от массы, так и от формы белковой частицы[3]:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

где:

· v - скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с;

· щ - угловая скорость ротора, рад/с;

· r - расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см.

Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1*10-¹³ с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1-50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S[3].

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

где:

· R - газовая постоянная, эрг/(моль*град);

· Т - абсолютная температура (по шкале Кельвина);

· s - константа седиментации;

· с - плотность растворителя;

· v - парциальный удельный объем молекулы белка;

· D - коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков известным методом ультрацентрифугиронания требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рисунке 6[3].

Рисунок 6-Измерение объема элюции (V_Э).

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах) через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка (рис. 7)[3].

Рисунок 7 - Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса Г-150 (сверхтонкого) и их молекулярными массами (в полулогарифмической системе координат).

1 - рибонуклеаза;

2 - химотрипсиноген;

3 -яичный альбумин;

4 - сывороточный альбумин;

5 - г-глобулин;

Х - белок с неизвестной молекулярной массой.

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью[3].

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу. Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка[3].

На рисунке 8 отображена зависимость между молеклярной массой и относительной подвижностью белка.

Рисунок 8- Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

1 - сывороточный альбумин;

2 - яичный альбумин;

3 - пепсин;

4 - химотрипсиноген;

5 - мио-глобин;

6 - цитохром с;

Х - белок с неизвестной молекулярной массой.

Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так называемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий определять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин) и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул[3].

2.1 Метод гель-хроматографии на колонках

Метод основан на том, что для большого числа глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной гелем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекулярной массы глобулярного белка достаточно определить объем его элюции с предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят, пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя объемы элюции для каждого из них[7].

Для сефадекса G-75 экспериментальным путем получено уравнение для расчета молекулярной массы:

lg M = 5,624 - 0,752 (V₃ / Vo),

где М - молекулярная масса;

V₃ - объем раствора, в котором из колонки выходит исследуемое вещество; V_o - свободный объем колонки.

Реактивы: 1. 1 % раствор голубого декстрана.

2. 0,1 моль/л раствор NaCl.

3. Сефадекс G-75 - 4 г.

4. 1 % раствор гемоглобина.

Ход работы. Подготовку колонки проводят аналогично тому, как это описано для метода гель-хроматографии. После заполнения колонки гелем сефадекса G-75 ее промывают 0,1 моль/л раствором NaCl.

Открывают зажим на колонке и сливают 0,1 моль/л раствором NaCl, находящийся над гелем. Зажим закрывают и на поверхность геля аккуратно наносят 0,5 мл раствора голубого декстрана. Открывают зажим и собирают вытекающую из колонки жидкость в мерный цилиндр, сохраняя ее до конца опыта[7].

Как только из колонки начнет вытекать окрашенный (голубой) раствор, начинают сбор элюата в заранее подготовленные пробирки по 20 капель в каждую пробирку. Элюат из этих пробирок от начала ряда, включая пробирку с самой интенсивной окраской, сливают в мерный цилиндр, где уже собраны предыдущие (неокрашенные) фракции. Объем остальных пробирок, в которых окраска начинает ослабевать, не учитывается. Таким образом, объем элюата от начала опыта до появления наиболее яркой голубой окраской составляет свободный объем колонки (V_o).

Закончив определение свободного объема, колонку отмывают от следов голубого декстрана. После этого в колонку вносят 0,5 мл 1 % раствора гемоглобина и повторяют ход работы, описанный для голубого декстрана. Объем элюата от начала эксперимента с гемоглобином до появления в пробирке максимально розовой окраски определяют как V₃.

Полученные значения V_o и V₃ подставляют в приведенное выше уравнение и находят молекулярную массу, используя таблицу логарифмов.

2.2 Метод гель-хроматография в тонком слое сефадекса

По мере продвижения раствора по пластинке с нанесенным на нее тонким слоем геля сефадекса смесь белков распределяется в нем таким образом, что расстояние, пройденное каждым белком от линии старта, пропорционально логарифму его молекулярной массы. Построив калибровочный график зависимости расстояния, пройденного белками-маркерами, от логарифма их молекулярной массы и определив длину пути, пройденного исследуемым белком, можно определить его молекулярную массу[7].

Оборудование:

1. Столик с переменным углом наклона.

2. Хроматографическая камера.

Рисунок 9 - Оборудование для хроматографического разделения белков в тонком слое сефадекса:

· а - столик с переменным углом наклона;

· б - хроматографическая камера (1, 3 - отсеки, заполненные буферным раствором;

· 2 - отсек, в который помещают стеклянную пластинку),

· 4 - стеклянная пластинка, покрытая гелем сефадекса;

· 5 - соединительные мостики из фильтровальной бумаги;

· в - скользящая крышка

Реактивы: 1. Сефадекс G-200 или G-150.

2. 0,1 моль/л натрий-фосфатный буфер, pH 7,4.

3. 0,1 % раствор бромфенолового синего, приготовленного на смеси этанол: концентрированная уксусная кислота (9:1).

4. 5 % раствор СН₃СООН.

5. 2 % раствор СН₃СООКа, приготовленный на 10 % растворе СН₃СООН.

6. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой: сывороточный альбумин (70 000 Да), рибонуклеаза (12 700 Да), яичный альбумин (45 000 Да), трипсин (23 800 Да), креатинкиназа из мышц кролика (80 000 Да), глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (144 000 Да), пируваткиназа (237 000 Да).

7. Хроматографическая бумага.

Ход работы. 4 г сухого сефадекса суспендируют в избытке натрий-фосфатного буфера и оставляют набухать в течение 3 сут при комнатной температуре или в течение нескольких часов при 60 °С. Перед нанесением на стеклянную пластинку (20 х 40 см), которая должна быть вымыта с особой тщательностью, избыток буфера над гелем декантируют, а гель перемешивают и наносят фарфоровой ложкой на пластинку, расположенную на столике со строго горизонтальной поверхностью. Слой геля распределяют по пластинке стеклянной палочкой размером 1 х 22 см с надетой на концы резиновой трубкой, прокатывая палочку вдоль пластинки несколько раз для получения равномерного слоя геля толщиной 1 мм (без комочков и пузырьков воздуха). Пластинку подсушивают на воздухе в течение 15 мин, а затем помещают в средний отсек камеры, как показано на рис. 5[7].

Крайние резервуары заливают 0,1 моль/л фосфатным буфером (pH 7,4), слой геля соединяют с буферным раствором полосками хроматографической бумаги, камеру закрывают скользящей крышкой и помещают на подставку с переменным углом. Угол наклона камеры устанавливают равным 7 - 10°. Камеру оставляют для насыщения на ночь при комнатной температуре. Убедившись в равномерности слоя сефадекса, наносят микропипеткой по 0,02 мл растворов (5 мг/мл) исследуемого белка и белков-свидетелей. Для этого пластинку устанавливают горизонтально и наносят белки в отдельные точки на расстоянии 3 см от верхнего края пластинки и друг от друга. Закрывают камеру крышкой и устанавливают ее под углом 7 - 10°[7].

Гель-хроматографию проводят в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем камеру устанавливают горизонтально, полоски хроматографической бумаги удаляют, пластинку помещают на горизонтальную подставку и снимают “реплику” на хроматографическую бумагу. Для этого бумагу свертывают в трубочку и, постепенно разворачивая, накладывают на тонкий слой так, чтобы бумага прилипла к нему. Не следует сильно надавливать на бумагу, чтобы не повредить слой сефадекса. Бумагу оставляют на пластинке 1 мин, затем высушивают при 90 °С в течение 20 мин и помещают в кювету для окрашивания[7].

Для идентификации белковых зон “ реплику ” помещают на 3 - 5 мин в раствор бромфенолового синего; краситель отмывают дважды 5 % раствором СН₃СООН и закрепляют 2 % раствором уксуснокислого натрия, приготовленного на 10 % растворе СН₃СООН[7].

После тщательного промывания в холодной проточной воде хроматографическую бумагу высушивают и измеряют расстояние, пройденное каждым белком от точки нанесения до центра белкового пятна. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс величину отношения 1_а: 1_ет (1_а - длина пути, пройденного данным белком; 1_ет - расстояние, пройденное стандартным белком, например сывороточным альбумином), по оси ординат - логарифм молекулярной массы данного белка. Определив расстояние белковой зоны исследуемого белка от старта, по калибровочному графику находят его молекулярную массу[7].

2.3 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфатат натрия (NaC₁₂H₂₅SO₄)

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата натрия в присутствии в-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков[7].

Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них: метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли[7].

В методе Вебера и Осборн буферные растворы для приготовления геля и электродный не отличаются между собой. Обычно используют 0,1 или 0,05 моль/л натрий-фосфатный буфер. В методе Лэммли гелевый и электродный буферные растворы отличаются друг от друга по составу и величине pH. Кроме того, используют два типа гелей - концентрирующий и разделяющий. Эти модификации приводят к тому, что на границе между концентрирующим и разделяющим гелем весь белковый образец собирается в виде узкого диска. Это способствует более четкому разделению белков[7].

3. Биологическая ценность белков и их роль в питании человека

Аминокислоты (свободные и в составе белков) содержат почти 95% всего азота, поэтому именно они поддерживают азотистый баланс организма. Азотистый баланс - разница между количеством азота, поступающего с пищей, и количеством выделяемого азота (преимущественно в виде мочевины и аммонийных солей). Если количество поступающего азота равно количеству выделяемого, то наступает азотистое равновесие. Такое состояние бывает у здорового человека при нормальном питании. Азотистый баланс может быть положительным (азота поступает больше, чем выводится) у детей, а также у пациентов, выздоравливающих после тяжёлых болезней. Отрицательный азотистый баланс (выделение азота преобладает над его поступлением) наблюдают при старении, голодании и во время тяжёлых заболеваний.

При безбелковой диете азотистый баланс становится отрицательным. Соблюдение подобной диеты в течение недели приводит к тому, что количество выделяемого азота перестаёт увеличиваться и стабилизируется примерно на величине 4 г/сутки Такое количество азота содержится в 25 г белка. Значит, при белковом голодании в сутки в организме расходуется около 25 г собственных белков тканей. Минимальное количество белков в пище, необходимое для поддержания азотистого равновесия, соответствует 30-50 г/сутки, оптимальное же количество при средней физической нагрузке составляет ?100-120 г/сутки [2].

3.1 Полноценность белкового питания

В ходе эволюции человек утратил способность синтезировать почти половину из двадцати аминокислот, входящих в состав белков. К их числу относят те аминокислоты, синтез которых включает много стадий и требует большого количества ферментов, кодируемых многими генами. Следовательно, те аминокислоты, синтез которых сложен и неэкономичен для организма, очевидно, выгоднее получать с пищей. Такие аминокислоты называют незаменимыми. К ним относят фенилаланин, метионин, треонин, триптофан, валин, лизин, лейцин, изолейцин[2].

Две аминокислоты - аргинин и гистидин - у взрослых образуются в достаточных количествах, однако детям для нормального роста организма необходимо дополнительное поступление этих аминокислот с пищей. Поэтому их называют частично заменимыми. Две другие аминокислоты - тирозин и цистеин - условно заменимые, так как для их синтеза необходимы незаменимые аминокислоты. Тирозин синтезируется из фенилаланина, а для образования цистеина необходим атом серы метионина[2].

Остальные аминокислоты легко синтезируются в клетках и называются заменимыми. К ним относят глицин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту, глутамин, серии, пролин, аланин[2].

Как было показано выше, основным источником аминокислот для клеток организма являются белки пищи. В различных пищевых продуктах содержание белка колеблется в широких пределах (таблица 1) [2].

Таблица 1- Количество белка в некоторых пищевых продуктах

Название продукта	Содержание белка, %
Мясо	18-22
Рыба	17-20
Сыр	20-36
Молоко	3,5
Рис	8,0
Горох	26
Соя	35
Картофель	1,5-2,0
Капуста	1,1-1,6
Морковь	0,8-1,0
Яблоки	0,3-0,4

Из таблицы видно, что распространённые продукты растительного происхождения содержат мало белка (кроме гороха и сои). Наиболее богаты белками продукты животного происхождения (мясо, рыба, сыр). Белки не являются незаменимыми пищевыми факторами, они являются источниками содержащихся в них незаменимых аминокислот, необходимых для нормального питания[2].

Питательная ценность белка зависит от его аминокислотного состава и способности усваиваться организмом. Белки значительно различаются по аминокислотному составу. Некоторые их них содержат полный набор незаменимых аминокислот в оптимальных соотношениях, другие не содержат одной или нескольких незаменимых аминокислот. Растительные белки, особенно пшеницы и других злаковых, полностью не перевариваются, так как защищены оболочкой, состоящей из целлюлозы и других полисахаридов, которые не гидролизуются пищеварительными ферментами. Некоторые белки по аминокислотному составу близки к белкам тела человека, но не используются в качестве пищевых, так как имеют фибриллярное строение, малорастворимы и не расщепляются протеазами ЖКТ. К ним относят белки волос, шерсти, перьев и другие. Если белок содержит все незаменимые аминокислоты в необходимых пропорциях и легко подвергается действию протеаз, то биологическая ценность такого белка условно принимается за 100, и он считается полноценным. К таким относят белки яиц и молока. Белки мяса говядины имеют биологическую ценность 98. Растительные белки по биологической ценности уступают животным, так как труднее перевариваются и бедны лизином, метионином и триптофаном. Однако при определённой комбинации растительных белков организм можно обеспечить полной и сбалансированной смесью аминокислот. Так, белки кукурузы (биологическая ценность - 36) содержат мало лизина, но достаточное количество триптофана. А белки бобов богаты лизином, но содержат мало триптофана. Каждый из этих белков в отдельности является неполноценным. Однако смесь бобов и кукурузы содержит необходимое человеку количество незаменимых аминокислот[2].

3.2 Нормы белка в питании

Для поддержания азотистого равновесия достаточно употреблять 30-50 г белков в сутки. Однако такое количество не обеспечивает сохранения работоспособности и здоровья человека. Принятые нормы белкового питания для взрослых и детей учитывают климатические условия, профессию, условия труда и другие факторы. Взрослый человек при средней физической нагрузке должен получать 100-120 г белков в сутки. При тяжёлой физической работе эта норма увеличивается до 130-150 г. Детям до 12 лет достаточно 50-70 г белков в сутки. При этом подразумевается, что в пишу входят разнообразные белки животного и растительного происхождения[2].

3.3 Белковая недостаточность

Известно, что даже длительное исключение из рациона человека жиров или углеводов не вызывает тяжёлых расстройств здоровья. Однако безбелковое питание (особенно продолжительное) вызывает серьёзные нарушения обмена и неизбежно заканчивается гибелью организма. Исключение даже одной незаменимой аминокислоты из пищевого рациона ведёт к неполному усвоению других аминокислот и сопровождается развитием отрицательного азотистого баланса, истощением, остановкой роста и нарушениями функций нервной системы[2].

Конкретные проявления недостаточности одной из аминокислот были выявлены у крыс, которым скармливали белки, лишённые определённой аминокислоты. Так, при отсутствии цистеина (или цистина) возникал острый некроз печени, гистидина - катаракта; отсутствие метионина приводило к анемии, ожирению и циррозу печени, облысению и геморрагии в почках. Исключение лизина из рациона молодых крыс сопровождалось анемией и внезапной гибелью (этот синдром отсутствовал у взрослых животных) [2].

Недостаточность белкового питания приводит к заболеванию, получившему в Центральной Африке название "квашиоркор", что в переводе означает "золотой (или красный) мальчик". В настоящее время это название часто используют и в других частях света при сходных симптомах. Заболевание развивается у детей, которые лишены молока и других животных белков, а питаются исключительно растительной пищей, включающей бананы, таро, просо и, чаще всего, кукурузу. Квашиоркор характеризуется задержкой роста, анемией, гипопротеинемией (часто сопровождающейся отёками), жировым перерождением печени. У лиц негроидной расы волосы приобретают красно-коричневый оттенок. Часто это заболевание сопровождается атрофией клеток поджелудочной железы. В результате нарушается секреция панкреатических ферментов и не усваивается даже то небольшое количество белков, которое поступает с пищей. Происходит поражение почек, вследствие чего резко увеличивается экскреция свободных аминокислот с мочой. Без лечения смертность детей составляет 50-90%. Даже если дети выживают, длительная недостаточность белка приводит к необратимым нарушениям не только физиологических функций, но и умственных способностей. Заболевание исчезает при своевременном переводе больного на богатую белком диету, включающую большие количества мясных и молочных продуктов. Один из путей решения проблемы - добавление в пищу препаратов лизина[2].

Заключение

Белки- важнейший строительный материал клеток и тканей. Так же они участвуют в образовании ферментов, гормонов и антибиотиков. Выполняют защитные, регуляторные и транспортные функции.

Роль белков в организме человека чрезвычайно велика, так как функции их многообразны.

Ценность белков и выполняемых ими функций в организме человека не поддаются сомнению.

В данной работе рассмотрены не только методы определения молекулярной массы белков, но и методы их выделения и очистки.

Среди известных методов определения молекулярной массы белков нами рассмотрены:

· Метод гель-хроматографии на колонках;

· Метод гель-хроматография в тонком слое сефадекса;

· Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфатат натрия (NaC₁₂H₂₅SO₄).

Белки участвуют в сложном комплексе биохимических процессов, протекающих в организме человека. Определив по общеизвестным методам, представленных в разделе 2 настоящей работы, молекулярную массу белков, представляется возможным определить их аминокислотный состав. В зависимости от строения полипептидной цепи происходит изменение физико-химических свойств белковой молекулы и, соответственно, ее роли в сложной системе биохимических процессов.

Как итог, была рассмотрена роль белков в питании, а именно их количественное содержание в продуктах питания и суточную норму потребления.

Список использованныйх источников

1. Азимов А. Краткая история химии. Развитие идей и представлений в химии/А. Азимов; под ред. А. Н. Шамина.- Пер. с англ. Гельман З. -- М.: Изд-во Мир, 1983.- 253с.

2. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию/Бекер М.Е.-М.: Изд-во Пищевая промышленность, 1978.-248с.

3. Березов Т.Т. Биологическая химия: Учебная литература для студентов медицинских вузов/Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин.- 3-е изд, прераб. и доп.-М.: Медицина, 1998.-704с.

4. Биохимия: Учебник для вузов/Е.С.Северин [и др.];под ред. Е.С.Северина.- 2-е изд.,испр.-М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.-784с.

5. Кольман Я. Наглядная биохимия/Я.Кольман, К.-Г. Рем: пер. с нем. Л.В.Козлов, Е.С.Левина, П.Д.Решетов,- М.: Изд-во Мир,2004.-469с.

6. Ленинджер А.[Lehninger А.]Основы биохимии: в 3-х т. Т.1. пер.с англ.-М.:Мир,1985.-367с.

7. Семак И.В. Биохимия белков: практикум для студентов биол. фак. спец. 1-31 01 01 «Биология»/ И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич.- Минск: БГУ, 2007. - 49 с.

8. Скоупс Р. [Sсopes R.] Методы очистки белков: пер. с англ.-М.:Мир,1985.-358с.

Словарь терминов и определений

1. Буферный раствор - растворы с определённой устойчивой концентрацией водородных ионов. рН буферных растворов мало изменяется при прибавлении к ним небольших количеств сильного основания или сильной кислоты, а также при разбавлении и концентрировании.

2. Дальтон (единица измерения)- атомная единица массы (обозначение а. е. м.), она же дальтон, внесистемная единица массы, применяемая для масс молекул, атомов, атомных ядер и элементарных частиц.

3. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) - Значение рН раствора, при котором молекула белка не имеет электрического заряда.

4. Константа седиментации (s) - частное от скорости частиц (v) в гравитационном поле на центробежное ускорение (с). Обычно выражают в единицах Сведберга (s).

5. Конформационная лабильность белков- это способность белков к небольшим изменениям конформации (формы) за счет разрыва одних и образования других слабых связей.

6. Кумасси (раствор)- название двух близких трифенилметановых красителей, разработанных для текстильной индустрии, но в настоящее время широко используемых в аналитической биохимии для окраски белков.

7. Нативная молекула белка- природная структура белка.

8. Сефадекс- трехмерный полимер декстрана, при добавлении воды образующий гель с порами определенной величины.

9. Элюат- раствор, выходящий из хроматографической колонки.

10. Элюция- извлечение вещества из твердого носителя вымыванием его подходящим растворителем.

11. Эрленмейеровская колба (колба Эрленмейера)- коническая колба.

Анализ использованных источников

Тип источника
№ п/п	Автор и наименование источника	Аннотация	Материал к отчету
Учебники и учебные пособия
1	Березов Т.Т. Биологическая химия: Учебная литература для студентов медицинских вузов/Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин.- 3-е изд, прераб. и доп.-М.: Медицина, 1998.-704с.	В третьем издании учебника (второе вышло в 1990 г.) в сжатой форме представлены новейшие сведения и факты о биогенезе главных классов органических веществ в организме человека и животных. Приведены новые данные о химии углеводов и липидов, расширен раздел медицинской энзимологии. В новой главе «Биомембраны и биоэнергетика» отражены совре- менные представления о структуре биомембран, образовании и транс- формации энергии в биосистемах	Раздел "Молекулярная масса белков". (Стр. 44)
2	Биохимия: Учебник для вузов/Е.С.Северин [и др.];под ред. Е.С.Северина.- 2-е изд.,испр.-М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.-784с.	В учебнике рассмотрены основные положения классической биохимии. Приведены сведения о структуре и свойствах биомолекул, биоэнергетике, молекулярных основах физиологических функций человека. Рассмотрены биохимические особенности важнейших органов и тканей. Изложены современные представления о молекулярных основах нарушений при ряде патологических состояний и болезней. Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, аспирантов.	VII. Физико-химические свойства белков и методы их выделения Б. Методы выделения и очистки белков (Стр.67) II. Биологическая ценность белков. А. Азотистый баланс Б. Полноценность белкового питания В. Нормы белка в питании Г. Белковая недостаточность (Стр. 459-461)
3	Семак И.В. Биохимия белков: практикум для студентов биол. фак. спец. 1-31 01 01 «Биология»/ И. В. Семак, Т. Н. Зырянова, О. И. Губич.- Минск: БГУ, 2007. - 49 с.	Практикум рассматривает методы количественного определения белков в биологическом материале,методы хроматографического и электрофоретическоо фракционирования белков,а также методы изучения молекулярой массы белков.	Глава 3 Определение молекулярной массы белков (стр. 34-38) 3.1 м-д гель-хроматографии на колонках 3.2гель-хроматография в тонком слое сефадекса 3.3 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфатат натрия (NaC12H25SO4)
4	Азимов А. Краткая история химии. Развитие идей и представлений в химии/А. Азимов; под ред. А. Н. Шамина.- Пер. с англ. Гельман З. -- М.: Изд-во Мир, 1983.- 253с.	Известный американский биохимик, популяризатор науки и писатель-фантаст А. Азимов знакомит читателя с предметом химии, историей возникновения и развития основных идей и представлений.	Глава "Белки" История изучения белковых молекул. (Стр. 70)
5	Бекер М.Е. Введение в биотехнологию/Бекер М.Е.-М.: Изд-во Пищевая промышленность, 1978.-248с.	В книге изложены основы микробиологического получения белковых и хлебопекарных дрожжей, бактериальных удобрений, вакцин, липидов, полисахаридов, спиртов, органических кислот, аминокислот, витаминов, антибиотиков, ферментов. Показаны принципы микробиологической трансформации органических соединений и сущность очистки сточных вод.
6	Ленинджер А [Lehninger А.]Основы биохимии: в 3-х т. Т.1. пер.с англ.-М.:Мир,1985.-367с.	Книга представляет собой фундаментальное учебное пособие, предназначенное для изучения основ биологической химии. Главная задача автора - объяснение молекулярной логики биологических систем, позволяющей понять основы функционирования живых организмов. В русском переводе книга выходит в трех томах. Первый том посвящен молекулам, образующим химическую основу живой природы. Последовательно рассмотрены следующие вопросы: роль воды в организме, структура и функции аминокислот, пептидов, белков, ферментов, витаминов, микроэлементов, углеводов и липидов. Во второй том вошли материалы по биоэнергетике и метаболизму клетки. Рассмотрены роль глюкозы в биоэнергетических процессах, цикл лимонной кислоты, электронный транспорт, окислительное фосфорилирование, регуляция образования АТФ, окисление жирных кислот в тканях животных, окислительный распад аминокислот, биосинтез углеводов, липидов, нуклеотидов, аминокислот, а также фотосинтез. Третий том посвящен биохимии человека и включает данные по пищеварению и всасыванию, интеграции обмена веществ, гормонам и питанию человека; рассмотрены вопросы, связанные с передачей генетической информации, структурой хромосом и генов, синтезом белка и его регуляцией, процессами репарации ДНК, мутациями, рекомбинацией и клонированием генов. Предназначена для биологов разных специальностей, медиков, студентов и всех лиц, интересующихся молекулярными основами процессов жизнедеятельности.	Том. 1 Раздел 6.6 Белки можно выделить и подвергнуть очистке (Стр. 143)
7.	Кольман Я. Наглядная биохимия/Я.Кольман, К.-Г. Рем: пер. с нем. Л.В.Козлов, Е.С.Левина, П.Д.Решетов,- М.: Изд-во Мир,2004.-469с.	От издателя Справочное издание в наглядной форме - в виде цветных схем - описывает все биохимические процессы. Рассмотрены биохимически важные соединения, их строение и свойства, основные процессы с их участием, а также механизмы и биохимия важнейших процессов в живой природе. Для студентов и преподавателей химических, биологических и медицинских вузов, биохимиков, биологов, медиков, а также широкого круга читателей, интересующихся процессами жизнедеятельности.	Методы выделения белков.
8.	Скоупс Р [Sсopes R.] Методы очистки белков: пер. с англ.-М.:Мир,1985.-358с.	Книга известного австралийского биохимика, написанная на основе собственного 20-летнего опыта работы в области препаративной биохимии. Изложены принципы и методы основных способов выделения и очистки белков, определения их концентрации и ферментативной активности. 1985 год, 358 с.	Лаборатория очистки ферментов

Рецензия

на практическую работы Кулешовой Анастасии Павловны, выполненную на тему: «Методы определения молекулярной массы белков»

Представленная работа изложена на 30 листах и включает 4 разделов: введения, трех глав, заключения и списка литературы.

Работа Кулешовой А.П. соответствует по содержанию избранной теме и посвящена детальному рассмотрению уже изученных методов исследования белков,а именно определению их молекулярной массы.

В работе автором рассмотрены три метода определения молекулярной массы белков.

Автором подробно были изучены не только методы определения молекулярной массы белков, но и способы их выделения и очистки, к каждому из которых был предоставлен рисунок,что способствовало лучшему ознакомлению читателя с данным материалом.

Автор грамотно структурировал свое исследование на основании литературных данных, первым делом ознакомив читателя и физико-химическими свойствами белков, а после предоставив способы их исследования.

Последний раздел работы был посвящен роли белков непосредственно в организме человека, что свидетельствует о заинтересованности автора в настоящей теме.

Работа выполнена аккуратно и грамотно, разделы имеют логическую связь.

По работе имеется замечание: предоставленные методы определения молекулярной массы не сопровождаются рисунками и таблицами, что затрудняет процесс понимания полученных данных.

Практическая работа, выполненная в форме отчета Кулешовой А.П., соответствует предъявляемым требованиям, а ее автор заслуживает оценки «хорошо».

Рецензент: Жильцов И.А.

Ученое звание: доцент

Ученая степень: кандидат технических наук

Место работы: ФГБОУ ВПО «МГУПП»

Занимаемая должность: Доцент кафедры «Бионанотехнология и биоорганический синтез»

Размещено на Allbest.ru

...