Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей
Анализ структуры генома и количества ДНК в пробе как актуальная проблема во многих областях биотехнологии. Особенности использования искусственно синтезируемых флуоресцентных нуклеотид-специфичных красителей. Основные преимущества и недостатки метода.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 28.01.2019 |
| Размер файла | 149,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
1
Размещено на http://www.allbest.ru/
Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им.Д.И. Менделеева
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей
В.С. Сибирцев, А.В. Гарабаджиу
г. Санкт-Петербург
Основное содержание исследования
Рассматриваются возможности применения для анализа как общего количества ДНК в пробе, так и её структуры системы из двух коммерческих флуоресцентных красителей (бромида этидия и Хехста-33258), обладающих согласованными спектральными и комплексообразующими свойствами.
Анализ структуры генома и количества ДНК в пробе является актуальной проблемой во многих областях биотехнологии. Всё чаще в последнее время для её решения используются искусственно синтезируемые флуоресцентные нуклеотид-специфичные красители. К преимуществам данного метода можно отнести: его простоту, экспрессность и чувствительность к малым количествам ДНК в пробе. А к его недостаткам: не очень высокую селективность, а также достаточно малую информативность при анализе структуры ДНК в пробе.
Для устранения вышеуказанных недостатков (при сохранении достоинств метода) нами для анализа ДНК была использована система из двух широкораспространённых коммерческих красителей: этидия бромида (ЕВ, 2,7-диамино-10-этил-9-фенил-фенантридиниумбромид) и Хехста-33258 (Хт, 2 - [2- (4-гидроксифенил) бензимидазол-5 (6) - ил] - 5 (6) - (4-метилпиперазин-1-ил) бенз-имидазол) (см. схему 1), ранее применявшихся для решения подобных задач лишь по отдельности [1-6].
При этом было отмечено, что спектральные свойства рассматриваемой системы определяются взаимодействием входящих в ее состав красителей как с нуклеиновой кислотой, так и друг с другом. В частности, при сорбции на ДНК, совместно, как ЕВ, так и Хт (c длинами волн максимумов возбуждения флуоресценции в видимой области спектра: 520 и 350 нм - и эмиссии: 600 и 450 нм - соответственно; см. рис.1) между молекулами этих красителей может иметь место флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET): явление, когда при возбуждении флуоресценции Хт (донор) светиться начинают не только его молекулы, но и молекулы ЕВ, (акцептор) сорбированные на полинуклеотиде на расстоянии от молекул Хт меньшем длины волны излучения последних (см. рис.2,3); причем эффективность такого переноса зависит как от расстояния между молекулами донора и акцептора энергии, так и от размера области перекрывания спектров эмиссии донора и возбуждения флуоресценции акцептора [7-11].
Кроме того, известно, что по типу взаимодействия с полинуклеотидом Хt является внешнесвязывающимся соединением, предпочтительно специфичным к участкам двойной спирали полинуклеотида, содержащим три последовательно расположенных АТ - и одну GC - пары оснований; а EB - интеркалятором, прослаивающимся между двумя парами оснований двойной спирали полинуклеотида с некоторым предпочтением к его GC-богатым участкам, и в значительно большей степени, чем Хt, специфичным к степени суперспирализации субстрата [2-6].
Таким образом, есть основания полагать, что совместное использование данных красителей сулит дополнительные эффекты, представляющие интерес в рамках структурно-функционального изучения ДНК: вплоть до возможности экспресс-оценки степени суперспи-рализации полинуклеотида в геноме и даже длины его теломерных участков [12-15]. Для чего, в качестве одной из возможных схем анализа полинуклеотида, можно предложить, следующее.
геном структура флуоресцентный нуклеотид краситель
1. Добавляем к образцу специальный буферный раствор и лизирующую смесь (для поддержания рН в системе на требуемом уровне, а также обеспечения лучшего доступа молекул красителей к ДНК) и делим его на две пробы.
2. К 1-ой пробе добавляем ЕВ и по изменению его флуоресценции (относительно фонового зна-чения - без пробы - при длинах волн возбуждения и эмиссии: 520 и 605 нм) определяем общую концентрацию ДНК в образце (СДЕ).
3. 2-ую пробу насыщаем Хt и по изменению флуоресценции последнего (при длинах волн возбуждения и эмиссии: 350 и 455 нм) также определяем общую концентрацию ДНК в образце (СДХ).
4. Затем ко 2-ой пробе добавляем ЕВ (который займет на полинуклеотиде участки, ещё не связанные Хt). После чего по изменению свечения систему при длинах волн возбуждения и эмиссии: 350 и 605 нм, оцениваем эффективность флуоресцентного резонансного переноса энергии от Хt к ЕВ (К), которая должна коррелировать с числом мест на ДНК, граничных между ее АТ - и GC-богатыми областями, из которых достаточно значительная часть, очевидно, должна приходиться на теломерные участки (имеющих вид: [TTAGGG] n - для позвоночных животных и человека).
5. Вычисляем коэффициент: S=СДЕ/СДХ, увеличение которого должно, в определенной мере, отражать уменьшение степени суперспирализации ДНК пробы.
Условий, когда величины СДЕ и СДХ будут равны, можно добиться, например, посредством предварительной обработки образца ультразвуком (для гомогенизации ДНК). В случае же измерения непосредственно нативной ДНК более адекватную информацию об общем её количестве в пробе даст, вообще говоря, величина СДЕ, хотя величина СДХ имеет большую чувствительность.
Вышеописанная схема анализа ДНК была опробована нами, в частности, на двух группах крыс по 10 особей в каждой; отобранных таким образом, что I-я группа включала в себя животных со средним возрастом - 2 месяца и весом - 140 гр, а II-я: животных со средним возрастом - 1.5 года и весом - 350 гр. В результате, нами были получены статистически достоверно (p<0.01) различающиеся величины усредненных по I-ой и II-ой группам параметров S и K: чего и следовало ожидать, поскольку с возрастом (а различия в "скорости процессов старения" для крысы и человека составляют, примерно, 20:
1) состояние генетического материала в клетках должно ухудшаться, в частности, за счет уменьшения степени суперспирализации ДНК, а также длины теломерных участков генома [].
Больше информации о наших работах в этом и иных смежных направлениях можно найти на сайте: http: \\www.vs1969 r. narod.ru\indexen. htm.
Литература
1. Cesarone C. F., Bolognesi C., Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst. // Anal. Biochem. - 1979. - V.100, №1. - P.188-197.
2. Morgan A. R., Lee J. S., Pulleyblank D. E., Murray N. L., Evans D. H. // Nucl. Acids Res. 1979. V.7. P.547-571.
3. Pjura P. E., Grzeskowiuk K., Dickerson R. E. // J. Mol. Biol. 1987. V. 197. P.257-271.
4. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В., Иванов С.Д. // Биоорган. химия. 1994.Т. 20. С.650-668.
5. Haq I., Ladbury J. E., Chowdhry B. Z., Jencins T. C., Chaires J. B. Specific binding of Hoechst 33258 to the d [CGCAAATTTGCG] 2 duplex: calorimetric and spectroscopic studies. // J. Mol. Biol. - 1997. - V.271. - P.244-257.
6. Борисова О.Ф., Щелкина А.К., Карапетян А.Т., Суровая А.Н. // Молекуляр. биол. 1998. Т.32. С.855-862.
7. Ермолаев В.Л., Бодунов Е.Н., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безизлучательный перенос энергии электронного возбуждения. Л.: Наука, 1977.311с.
8. Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. // Annu. Rev. Biochem. - 1978. - V.47. - P.819-846.
9. Clegg R. M. Fluorescence resonanse energy transfer and nucleic acid. // Methods Enzymol. - 1992. - V.211. - P.353-388.
10. Speiser S. // Chem. Rev. 1996. V.96. P. 1953-1976.
11. Lankiewicz L., Malika J., Wiczk W. // Acta Biochimica Polonica. 1997. V.44. P.477-490.
12. Микер А.К., Коффи Д.С. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1547-1557.
13. Куренова Е.В., Мейсон Д.М. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1453-1466.
14. Скулачев В.П. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1394-1399.
15. Блэкберн Е.Х. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1400-1406.
Приложения
Рис.1. Спектры флуоресцентного возбуждения (a,c) и эмиссии (в,d) красителей ЕВ (a,b) и Хt (c,d) в присутствии различных количеств ДНК тимуса теленка в буфере А, содержавшем 0.01 М NaCl, 0.01 M Na2EDTA (этилендиаминотетраацетат натрия) и 0.01 M Tris (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) (pH 7.4).
Запись спектров производили на спектрофлуориметре фирмы "Hitachi" model 850 (Япония) при ширине щелей монохроматоров возбуждения и эмиссии по 3 нм, скорости сканирования - 120 нм/мин, времени отклика - 2 с и нормальном усилении ФЭУ. При этом использовали стандартные кюветы квадратного сечения с длиной оптического пути 1 см. Все использовавшиеся реактивы были получены от фирмы "Serva" (Германия).
Спектры регистрировались при фиксированных длинах волн эмиссии: 600 (а) и 450 (c) нм - и длинах волн возбуждения: 520 (b) и 350 (d) нм. Кривым 1-6 на графиках соответствуют отношения молярных концентраций CДНК/CЕВ =. СEB=8Ч10-6 М и СХт=1Ч10-6 М.
Рис.2. Схема FRET, происходящего между Хт и ЕВ в присутствии ДНК.
Кривыми 1 и 2 обозначены спектры флуоресцентного возбуждения (при длине волны эмиссии 450 нм) и эмиссии (при длине волны возбуждения 350 нм), регистрируемые для Хт в присутствии ДНК в видимой области спектра. Кривыми 3 и 4 обозначены спектры флуоресцентного возбуждения (при длине волны эмиссии 600 нм) и эмиссии (при длине волны возбуждения 520 нм), регистрируемые для ЕВ в присутствии ДНК в видимой области спектра. Как "IsA" обозначена область перекрывания спектров эмиссии Хт и флуоресцентного возбуждения ЕВ, в которой, собственно, и может происходить FRET, в случае когда молекулы Хт и ЕВ расположены достаточно близко друг от друга; "ex." - excitation; "em." - emission.
Рис.3. Спектры флуоресценции системы “Хт+ЕВ” (CЕВ/CХт=8) в присутствии различных количеств ДНК в буфере А, регистрируемые при фиксированных длинах волн эмиссии: 450 (а) и 600 (б) нм - и длинах волн возбуждения: 520 (в) и 350 (г) нм.
Кривым 1-6 соответствуют отношения молярных концентраций CДНК/CХт = 0, 5, 10, 15,20 и 25. Как "?i1" и "?i2" обозначены изобестические точки, наличествующие на рис. с и рис. d, соответственно. Прочие условия измерений, реактивы и т.д. - как на рис.1.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая - ДНК, рибонуклеиновая - РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.
реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.
курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.
презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).
презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.
презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014Понятие генетического кода как единой системы записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов. Этапы реализации, свойства и расшифровка хромосомы в клетке. Работа по секвенсированию генома человека.
реферат [89,1 K], добавлен 18.01.2011История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.
контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012Сущность, состав нуклеотидов, их физические характеристики. Механизм редупликации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), транскрипция ее с переносом наследственной информации на РНК и механизм трансляции — синтез белка, направляемый этой информацией.
реферат [461,8 K], добавлен 11.12.2009Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.
презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013Роль ДНК при хранении и передаче генетической информации в живых организмах. Основные свойства нуклеиновых кислот. Рентгеноструктурный анализ молекул ДНК. Исследование пространственной структуры белков. Создание трёхмерной модели ДНК Криком-Уотсоном.
презентация [2,0 M], добавлен 14.12.2011Фотоповреждение нуклеиновых кислот ультрафиолетовым излучением. Нуклеотид-эксцизионная репарация повреждений ДНК. Фотоповреждение аминокислот и белков ультрафиолетовым излучением. Влияние ультрафиолетового излучения на биомембраны и клетки организма.
контрольная работа [1,2 M], добавлен 19.08.2015Основные методы биотехнологии. Размножение организмов с интересующими человека свойствами с помощью метода культуры клеток. Особенности применения методов генной инженерии. Перспективы метода клонирования. Технические трудности применения методов.
презентация [616,1 K], добавлен 04.12.2013Использование трансгенных организмов: изучение роли определенных генов и белков; получение новых сортов растений и пород животных; в биотехнологическом производстве плазмид и белков. Выведение флуоресцентных свиней и генетический модифицированных кошек.
презентация [676,7 K], добавлен 25.12.2012История открытия биологического полимера, состоящего из двух спирально закрученных цепочек. Первичная структура нуклеиновых кислот, конформация их компонентов. Взаимодействия между гетероциклическими основаниями в них. Полиморфизм двойной спирали.
презентация [1,6 M], добавлен 24.02.2015Функции биологических мембран и их компонентов. Спектроскопические методы измерения скорости вращения липидов и белков внутри мембраны и скорости латеральной диффузии этих компонентов в плоскости мембраны. Использование спиновых или флуоресцентных зондов.
реферат [1,6 M], добавлен 01.08.2009История открытия дезоксирибонуклеиновой кислоты - биологического полимера, состоящего из двух спирально закрученных цепочек. Первичная структура и конформации компонентов нуклеиновых кислот. Макромолекулярная структура ДНК, полиморфизм двойной спирали.
презентация [1,1 M], добавлен 07.11.2013Дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, состоящий из двух спирально закрученных цепочек, история ее открытия. Первичная структура нуклеиновых кислот, конформации их компонентов. Макромолекулярная структура ДНК. Полиморфизм двойной спирали.
презентация [1,1 M], добавлен 28.01.2013Основные задачи, разделы и направления современной биотехнологии. Производство необходимых человеку продуктов и биологически активных соединений с помощью живых организмов. Изучение генетической, клеточной и биологической инженерии. Объекты биотехнологии.
презентация [2,1 M], добавлен 06.03.2014Понятие и особенности строения нуклеиновых кислот, их составные элементы и их внутреннее взаимодействие. Значение данных соединений в организме, история их открытия и основные этапы исследований. Длина молекул ДНК. Сущность принципа комплементарности.
презентация [1,5 M], добавлен 27.12.2010Генетическая терминология, организация генома вирусов, понятие о лизогенном и литическом цикле. Особенности генома и жизненного цикла ретровирусов, геном бактерий. Современные представления о геноме человека: теоретические и практические аспекты.
презентация [125,3 K], добавлен 04.04.2011
