Клональное размножение ягодных культур in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, Россия, г. Мичуринск

Клональное размножение ягодных культур in vitro

Соловых Н.В.

Муратова С.А.

Янковская М.Б.

В практике отечественного и зарубежного садоводства накоплен большой опыт культивирования in vitro ягодных культур, в том числе малины красной (Rubus idaeus L.) и земляники ананасной (Fragaria х ananassa Duch.). Однако список видов и гибридных форм родов Rubus и Fragariа, используемых в научных исследованиях, а также в промышленном и любительском садоводстве, неуклонно расширяется. Поэтому необходимо разработать и оптимизировать методы клонального размножения in vitro этих нетрадиционных объектов.

Клональное микроразмножение включает в себя несколько этапов: введение эксплантов в культуру, собственно микроразмножение, укоренение растений in vitro и адаптация их in vivo. Проводились исследования по оптимизации методик для каждого из названных этапов применительно к землянике овальной (Fragaria ovalis Rydb.), землянике восточной (Fragaria orientalis Los.), малине чёрной (Rubus occidentalis L.) и малино-ежевичным гибридам Логанберри и Бойсенберри. Изучали влияние минерального и гормонального состава питательных сред и световых режимов на размножение и укоренение микропобегов in vitro. Проводили работы по изучению возможности адаптации пробирочных растений в in vivo в плёночных теплицах.

Для большинства ягодных культур рекомендуется вводить экспланты в стерильную культуру в мае. Наиболее удобным объектом для введения в культуру видов земляники являются верхушки столонов (усов). Поэтому введение в культуру земляники удобнее проводить в конце июня - начале июля, так как растения к этому времени оканчивают плодоношение и обильно образуют столоны с интенсивно делящимися клетками меристем. Для введения в культуру представителей рода Rubus в качестве исходного экспланта используют апикальные и латеральные почки. Стерилизация активно набухающих почек весной часто приводит к сильному повреждению тканей, что снижает количество образовавшихся побегов. Поэтому удобнее использовать в качестве первичного экспланта почки неодревесневших (в июле) или одревесневших (август - сентябрь) побегов.

Верхушки столонов земляники или почки растений рода Rubus в течение 15 -20 минут промывают проточной водой с добавлением моющих средств, освобождают от листьев и кроющих чешуй и стерилизуют 0,1% раствором сулемы (HgCl₂). Оптимальная продолжительность стерилизации для земляники восточной составляет 60-90 секунд, для земляники овальной 40-60 секунд, для почек представителей рода Rubus 90-120 секунд. После промывки материала стерильной дистиллированной водой его высаживают на искусственные питательные среды. При этом до 25-35% материала не удаётся освободить от грибной или бактериальной инфекции, но количество стерильных эксплантов, образующих почки и побеги, возрастает до 80%. Чтобы увеличить стерильность и частично освободить материал от вирусов рекомендуется вычленять экспланты, состоящие из меристематического купола, одного или двух листовых примордиев и некоторого количества субапикальной ткани. Однако это существенно снижает количество полученных побегов.

Установлено, что при введении в культуру всех перечисленных видов и гибридных форм целесообразно использовать питательную среду с минеральным составом, витаминами и сахарами по прописи MS (Murashige, Skoog, 1962). На первом этапе введения в культуру экзогенные регуляторы роста, кроме гибберелловой кислоты (ГК), не оказывали положительного влияния на образование почек и побегов. Внесение 1 мг/л ГК, рекомендованное Деменко (2005) для уменьшения образования раневого каллуса, позволило увеличить число начавших рост эксплантов чёрной малины и земляники восточной соответственно на 17 и 33%. Добавление в среду аскорбиновой кислоты (750 - 100мкМ) или глутатиона восстановленного (100-250 мкМ) снижало вредное влияние продуктов окисления фенолов на экспланты и повышало выход побегов на 23% у земляники восточной и 34% у малины чёрной (Соловых, 2009).

Культивирование проводили при освещенности 2500-3000 люкс, продолжительности светового дня равной 16 часам и влажности воздуха 70 - 75%. Содержание культуральных сосудов в темноте на первом этапе введения в культуру в течение 7-9 дней, рекомендованное Е.Н. Джигадло с соавторами (2005), позволило увеличить число полученных побегов у малины чёрной (на 12,5±3,6%), но практически не оказало влияния на выход побегов у земляники овальной и земляники восточной.

Через 7 -10 дней начавшие рост экспланты пересаживали на содержащие 6-БАП среды для размножения с минеральным составом, сахарозой и витаминами по прописи MS. Для клонального микроразмножения малино-ежевичных гибридов Логанберри и Бойсенберри более эффективным было использование питательной среды по прописи QL (Quoirin, Lepoivre, 1977). У чёрной малины замена в среде MS хлорида кальция эквивалентным количеством нитрата, а сахарозы глюкозой позволила увеличить коэффициент размножения побегов в первом пассаже с 5,6±0,9 до 10,7±1,4. Оптимальной концентрацией 6-БАП для земляники восточной, малино-ежевичных гибридов и малины чёрной является 1 мг/л, для земляники овальной 0,5 мг/л. Использование таких концентраций обеспечивало высокие коэффициенты размножения и образование достаточно крупных (1,5-3 см) микропобегов. Дальнейшее увеличение содержания в среде 6-БАП приводило к увеличению коэффициента размножения, но растения становились более мелкими, и на этапе укоренения снижалась интенсивность их ризогенеза.

Пересадку микропобегов на свежие среды осуществляли один раз в месяц. Отмечено, что во втором и третьем пассажах увеличивались коэффициенты размножения у всех изучаемых генотипов. Наиболее высокий коэффициент размножения продемонстрировала земляника овальная (24,7±5,3), наименьший - Логанберри (6,2±1,5).

Эффективность корнеобразования in vitro у микропобегов всех изученных генотипов зависела от вида растения, типа и концентрации используемого ауксина. Индукция ризогенеза у малино-ежевичных гибридов и обоих видов земляники наилучшим образом удавалась на среде MS, содержащей уменьшенное вдвое количество макросолей, 20г/л сахарозы и 0,5 - 1, 0 мг/л в-индолил-3-масляной кислоты (ИМК). Для чёрной малины наилучшие результаты дали концентрации ИМК равные 0,2-0,5 мг/л. Наибольшая частота корнеобразования наблюдалась у земляники (90-100%), микропобеги и микрочеренки малины чёрной и малино-ежевичных гибридов демонстрировали частоту укоренения не более 65-80%.

Для адаптации пробирочных растений к условиям in vivo их высаживали в мае - июне в плёночную теплицу с воздушно-капельным орошением. Субстрат состоял из равных долей дерновой земли, торфа и песка. В солнечные дни теплицу затеняли. Через 1,5-2 месяца плёнку снимали. В последней декаде августа предназначенные для научных экспериментов растения высаживали на доращивание в открытый грунт. Эффективность адаптации к условиям открытого грунта составляла от 75 до 95% в зависимости от генотипа. Достигшие товарных кондиций растения малино-ежевичных гибридов оставляли в открытых теплицах до конца сентября - начала октября, после чего реализовывали садоводам-любителям.

Литература

клональный размножение растение генотип

1. Деменко В.И. Проблемы и возможности микроклонального размножения садовых растений. Введение в культуру// Известия ТСХА, ?В.2, 2005, ?С. 48-58.

2. Джигадло Е.Н., Джигадло М.И., Голышкина Л.В. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами. Под ред. Е.Н. Джигадло.- Орёл: ГНУ ВНИИСПК, 2005. -51 с.

3. Соловых Н.В. Использование биотехнологических методов в работе с ягодными культурами// Методические рекомендации. Мичуринск - наукоград РФ: ГНУ ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина, Изд. Мичуринского гос. агроуниверситета, 2009. - 47 с.

4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// Physiol. Plant. - 1962. - V.15, №13. - Р. 473-497.

5. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp.///Acta Hortic.-1977. -V. 78. -P. 437-442.

Размещено на Allbest.ru