Поиск потенциальных иммуностимуляторов среди замещенных моно- и бициклических пиперидинов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лаборатория экологической физиологии НИИ «Проблем биологии и биотехнологии» при Казахском национальном университете имени аль - Фараби

ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИММУНОСТИМУЛЯТОРОВ СРЕДИ ЗАМЕЩЕННЫХ МОНО- И БИЦИКЛИЧЕСКИХ ПИПЕРИДИНОВ

Бактыбаева Л.К., к.б.н., доцент

Исследована группа соединений, би- и моноциклических производных пиперидина в виде комплексов с в-циклодекстрином под лабораторным шифром БИВ. Наиболее высокие результаты по стимулированию лейкопоэза, лимфопоэза, гуморального иммунитета показало соединение БИВ-3, лишь уступая соединению БИВ-4 в активации фагоцитоза полинуклеаров. Его химическая структура являясь аналогом другим соединениям, в то же время отличалась наличием гидантаиновой группировки.

В настоящее время предметом пристального внимания исследователей являются различные аспекты экологических взаимоотношений современного человека с факторами окружающей среды, в частности, с солями тяжелых металлов. Около 20 заболеваний являются следствием воздействия высоких концентраций солей тяжелых металлов на организм человека [1]. Раннее проведенные нами исследования показали, что в результате введения в организм солей тяжелых металлов у животных развиваются тяжелые иммунодепрессивные синдромы [2]. Целью данного исследования явилось изучить иммуностимулирующую активность новых синтетических соединений на фоне вторичного иммунодепрессивного синдрома, развившегося на фоне интоксикации организма ацетатом свинца.

Материалы и методы

Материалом служили белые беспородные половозрелые крысы обоего пола массой 210 - 220 г, 240 особей. Все животные содержались в стандартных виварных условиях. Животных разделили на группы по 10 особей с введением исследуемых соединений: 1-ой - БИВ-1, 2 - ой - БИВ-2, 3 - ей - БИВ-3, 4 - ой - БИВ-4, 5 - ой - БИВ-5, 6 - ой - БИВ-7, 7 - ой - левамизол. Интоксикацию животных проводили путем перорального введения раствора ацетата свинца (растворитель дистиллированная вода) в дозе 10 мг/кг объемом 10 мл³ в течение 10 дней. Последующее лечение исследуемыми соединениями проводили в течение 3 дней путем внутримышечного введения соединений (растворитель физиологический раствор) в дозе от ЛД₅₀ объемом 0, 5 мл³. Забор периферической крови осуществляли из хвостовой вены животных с начала проведения эксперимента и последующие 1, 7, 14 сутки наблюдения после введения соединений. Из крови делали мазки для подсчета лейкограммы крови. Мазки крови окрашивали по Романовскому-Гимза, подсчитывали на микроскопе SA3300С под иммерсией (увеличение 7х100) по 100 клеток на каждом мазке, затем относительное количество каждого типа клеток пересчитывали в абсолютное[7]. С помощью камеры Горяева по общепринятой методике определяли общий лейкоцитарный показатель. Кроме того, забор периферической крови проводили из орбитального синуса крыс на 14 сутки наблюдения под слабым эфирным наркозом, в объеме 1, 5 мл³ и немедленно гепаринизировали 25 ЕД/мл. По общепринятой методике получали лимфоцитарно - моноцитарную клеточную суспензию, путем наслаивания на градиент фиколла - верографина (1,5 мл фиколла на 3 мл разведенной крови). Для оценки субпопуляционного состава Т - лимфоцитов периферической крови использовали метод типирования мембранных молекул с помощью моноклональных антител ИКО 111(СД3⁺), ИКО 101(СД4⁺), ИКО 31(СД8⁺), ИКО 180(СД20⁺), ИКО 105(СД25⁺) (НПЦ МедБиоСпектр, Москва)[2]. Результаты реакции СД - типирования оценивали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ при увеличении 10х90. При этом в каждом препарате подсчитывали 300 клеток. Интактным животным давали очищенную воду. Острую токсичность новых соединений определяли по Игнатову А.Р. при внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам обоего пола и массой 18 - 23 грамм. Бласттрансформирующую активность оценивали с помощью метода бластной трансформации [6]. Фагоцитарную активность оценивали НСТ-реакцией [7].

При статистической обработке результатов исследований проводили сравнение выборок по критерию t Стьюдента. На исследование иммуностимулирующей активности были взяты соединения, производные пиперидина.

Результаты исследований

1. Исследование острой токсичности новых синтетических соединений.

В целом все соединения исследуемого ряда проявили очень низкий уровень острой токсичности. Острая токсичность соединений БИВ - 4 и БИВ - 6 была ниже в 21, 2 раза, чем у левамизола. ЛД₅₀ трех соединений БИВ - 1, БИВ - 2, БИВ - 7 лежала в диапазоне от 790 до 851 мг/кг массы тела животного, что характеризовало соединения как малотоксичные. Лишь один препарат БИВ - 5 проявил острую токсичность 396 мг/кг, однако и он был менее токсичен, чем левамизол в 8, 4 раза (таблица 1).

Таблица 1

Острая токсичность соединений

*p<0,01

2 Показатели иммуностимулирующей активности новых синтетических соединений.

После проведенной интоксикации у животных наблюдалось нарушение психомоторных реакций, аппетита, слезоточивость глаз, внезапная гиперреактивность и агрессивность. Анализ крови показал лейкопению на фоне нейтрофилеза, лимфопении и моноцитопении. Достоверное снижение общего лейкоцитарного показвателя по сравнению с нормой произошло в 4, 2 раза. Наблюдался сдвиг лейкоцитарной формулы влево: выход метамиелоцитов и миелоцитов до 12%, резкое увеличение палочкоядерных нейтрофилов до 18%, снижение лимфоцитарного показателя до 24,1%. Кроме того, нейтрофилы характеризовались гиперсегментированностью ядер и токсической зернистостью. Была замечена базофильная токсическая зернистость в эритроцитах. На фоне лимфопении уровень Т - и В - лимфоцитов значительно снизился. Практически к нулевому показателю приблизились показатели Т - хелперов, Т - супрессоров/Т - киллеров. Все показатели крови говорили о сильной интоксикации организма и о приобретенном иммунодепрессивном синдроме. Фагоцитарная активность в соответствии с НСТ - показателем и индексом адгезии упала до 5%. Также наблюдалось почти полное отсутствие реакции бластообразования. Таким образом, на 10 день интоксикации ацетатом свинца у животных наблюдался выраженный иммунодепрессивный синдром. Получив выраженное иммунодефицитное состояние животных пролечили новыми исследуемыми соединениями.

По влиянию на лейкопоэз наиболее высокую активность проявило соединение БИВ - 3, оно на 14 сутки наблюдения увеличивало общий лейкоцитарный показатель, по сравнению с группой плацебо в 3, 8 раза и превосходило по активности левамизол в 3, 1 раза (Рис.1).. Лейкоцитарный показатель и показатели лейкоцитарной формулы практически приблизились к показателям здорового организма. Количество метамиелоцитов снизилось до 0,9%, миелоцитов до 2,9%, палочкоядерных нейтрофилов до 8,4%. Следующим по силе влияния на пролиферацию иммунных клеток было соединение БИВ - 7. Оно уступало по активности соединению БИВ - 3, но было активнее, чем все последующие соединения и препарат сравнения в 1, 5 раза.

После проведенного лечения на 14 сутки наблюдения соединение БИВ - 7 повысило общий показатель лейкоцитов в 1, 9 раза по сравнению с группой введения плацебо. Аналогично, как и после лечения предыдущим соединением в периферической крови наблюдалось незначительное количество миелоцитов и метамиелоцитов. Показатели лимфоцитов, эозинофилов, базофилов и моноцитов вернулись к нормальным показателям. Активность, сопоставимую с активностью левамизола проявили соединения БИВ-1, БИВ-4, БИВ-5. Не проявило иммуностимулирующей активности соединение БИВ-2. Животные погибли на 14-32 сутки после начала лечения исследуемым соединением.

В отношении лимфопоэза после проведенного лечения исследуемыми соединениями и левамизолом наиболее высокие результаты на 14 сутки наблюдались в группе лечения соединением БИВ - 3. Оно увеличивало количество Т - и В - лимфоцитов в 1, 7 и 1, 2 раза активнее, чем левамизол. Увеличилась популяция Т-хелперов и Т-супрессоров. Но, если посмотреть на активность соединений по влиянию в отдельности на каждую субпопуляцию лимфоцитов, то соединения БИВ-4, БИВ-7 проявили избирательное высокостимулирующее действие на пролиферацию Т-лимфоцитов и превосходили препарат сравнения в 1, 6 раза (рис. 2). У соединений БИВ-4 и БИВ-7 количество Т-хелперов было выше, чем у левамизола в 1, 3 и 1, 6 раза соответственно. Основываясь на количественных показателях лимфоцитов был подсчитан иммунорегуляторный индекс соединений. Наиболее высокий иммунорегуляторный индекс был у соединений БИВ-4 и БИВ-7, который превосходил препарат сравнения в 1,4 раза. Иммунорегуляторный индекс наравне с левамизолом был у соединения БИВ - 1.

Данные НСТ-теста коррелировали с показателями индекса адгезии (Рис. 3). Фагоцитоз полинуклеаров наиболее активно стимулировало соединение БИВ-4, превосходя левамизол в 3, 5 раза. Слегка превосходили препарат сравнения соединения БИВ-5, БИВ-7 (рис.3).

Новые синтетики также стимулировали процесс бласттрансформации у лимфоцитов в крови крыс (рис. 3). Наиболее высокой бласттрансформирующей активностью обладали соединения БИВ - 3, БИВ - 4, превосходя препарат сравнения в 1, 2 раза. Соединение БИВ - 7 проявляло сопоставимую с левамизолом активность.

Таким образом, исследуемые соединения в целом проявили очень низкий показатель острой токсичности. Наиболее активные соединения БИВ - 3 и БИВ - 7 обладали низким уровнем токсичности и были менее токсичны в 9, 5 и 16, 7 раза. Первичный фармакологический скрининг на иммуностимулирующую активность показал, что отличительно высокой активностью обладает соединение БИВ - 3. Его химическая структура являясь аналогом другим соединениям, в то же время отличалась наличием гидантаиновой группировки. БИВ-3 к 14 дню наблюдения восстановил общий лейкоцитарный показатель до уровня интактных животных. По влиянию на лимфопоэз оно проявляло высокую активность, стимулируя лимфопоэз Т -хелперов и Т - киллеров. Но по стимулированию фагоцитарной активности полинуклеаров БИВ - 3 уступал БИВ - 4.

Литература

1. Гигиена. Под общей редакцией академика РАМН Т. И. Румянцева. Учебник для вузов. М.: ГЭОТАР - МЕД, 2001.

2. Тулеуханов С.Т., Бактыбаева Л.К., Свамбаев Е.А., Гумарова Л.Ж. Влияние солей тяжелых металлов на картину периферической крови крыс. // Вестник КазНУ. Серия биологическая. 2006. №3 (29), с. 36-41.

3. Харкевич Д. А. Фармакология. Учебник для вузов. М.: ГЭОТАР - МЕД, 2002.

4. Стеценко О. Н., Борзова Н. В., Линднер Д. П., Иванова А. С. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на восстановление костного мозга, поврежденного действием гидрокортизона и циклофосфана. - Иммунология, 2005, №6, т.26, С. 365 - 368.

5. Ю В. К. Функциональнозамещенные моно- и бициклические пиперидины: синтез, превращения и свойства. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук, Алматы, 2006.

6. Редькин Ю. В., Соколова Т. Ф., Зубахин А. А. Способ выделения клеток крови для одновременной постановки реакций торможения миграции лейкоцитов, розеткообразования и бластной трансформации. Лабораторное дело, 1982, №2, С. 110 - 111.

7. Хаитов Р. М., Гущин И. С., Пинегин Б. В., Зебрев А. И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фармакол. Комитета. 1999. № 1. С. 31 - 36.

8. Давыдова В. И. Биохимические показатели крови и мочи у рабочих свинцово - цинкового производства. - Гигиена труда и профессиональных заболеваний, 1991, №8, С. 32 - 34.

Размещено на Allbest.ru