Анализ особенностей метилирования метафазных хромосом человека с помощью моноклональных антител

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Метилирование - это химическая модификация, катализируемая ферментом, реакция добавления метильных групп (CH3) на специфические сайты белков, ДНК и РНК.

Метилирование ДНК как инструмент исследования и средство терапии: ДНК-метилирование - широко распространенный, но не универсальный долгосрочный механизм регуляции экспрессии У эукариот - всегда в комбинации с другими эпигенетическими механизмами.

Специфическое воздействие in vivo затруднительно.

Ряд патологий вызван нарушением ДНК-метилирования, при этом различия в метилировании специфического локуса могут быть не только качественными, но и количественными.

Паттерны метилирования содержат большое количество уже известных и еще не выявленных диагностических маркеров.

Моноклональные АТ-МеС получены и апробированы на хромосомах млекопитающих в 1974 году. Первые эксперименты показали перспективность их использования для изучения особенностей метилирования интерфазных ядер и метафазных хромосом человека. Моноклональные антитела стали мощным инструментом в научных исследованиях и открыли большие перспективы для создания новых диагностических и лечебных средств в биологии, иммунологии и медицине. В последние годы широко разрабатываются и используются биологические препараты, созданные на их основе.

Цель:

Проанализировать особенности метилирования метафазных хромосом человека с помощью моноклональных антител.

Задачи:

1) раскрыть содержание понятия "метилирование", "метафазные хромосомы", "моноклональные антитела",

2) обобщить и кратко описать особенности метилирования метафазных хромосом,

3) изучить особенности метилирования метафазных хромосом человека с помощью моноклональных антител.

Хромосомы - самовоспроизводящиеся структуры клеточного ядра. Как у прокариотических, так и у эукариотических организмов гены располагаются группами на отдельных молекулах ДНК, которые при участии белков и других макромолекул клеток организуются в хромосомы.

Хромосомы лучше всего изучать во время метафазы митоза, т.к. в этой фазе они:

- располагаются в центре клетки, образуя метафазную пластинку;

- максимально конденсированы и легко различимы с использованием световой микроскопии;

- являются двухроматидными, а сестринские хроматиды соединены между собой в области центромеры, что позволяет различить их морфологию.

Морфологическими элементами метафазной хромосомы являются:

- 2 хроматиды;

- центромера;

- теломеры;

- вторичная перетяжка;

- спутник (сателлит);

- ломкие (фрагильные) участки.

Хроматида представлена одной линейной молекулой ДНК, ассоциированной с гистоновыми и негистоновыми белками и максимально конденсированной. Метафазная хромосома состоит из двух сестринских хроматид, являющихся результатом репликации ДНК в фазе S и, таким образом, генетически идентичных. Хроматиды одной хромосомы соединены в области центромеры и остаются в таком состоянии до анафазы.

Одним из прямых подходов, позволяющих непосредственно регистрировать статус метилирования хромосом, являются опыты с использованием специфических антител к 5-метилцитозину (АТ-МеС). Моноклональные АТ-МеС получены и апробированы на хромосомах млекопитающих в 1974 году.

Первые же эксперименты показали перспективность их использования для изучения особенностей метилирования интерфазных ядер и метафазных хромосом человека. Учитывая крайне скудную информацию об особенностях дифференциальной окраски хромосом человека с использованием антител к 5-метилцитозину, на первом этапе нами был исследован статус метилирования хромосом в ФГА-стимулированных лимфоцитах периферической крови у взрослых доноров.

Принцип метода и новый вариант дифференциальной окраски -- М-сегментация.

Техника иммуноцитохимического окрашивания метафазных пластинок с использованием моноклональных антител к 5-метилцитозину подробно изложена в Приложении. Отметим только, что одним из ключевых этапов в процессе связывания АТ-МеС с участками, содержащими метилированный цитозин, является денатурация хромосомной ДНК. При апробировании двух наиболее распространенных способов денатурации -- УФ-облучение и воздействие 2М HCl -- в качестве оптимальной была избрана кислотная обработка в течение 25-30 мин, так как она обеспечивала наиболее полную денатурацию хромосом, не изменяя их морфологические характеристики. Распределение флуоресцентных сигналов по длине хромосом оказалось неравномерным по длине хромосом и стабильно воспроизводилось во всех проанализированных 72 метафазных пластинках из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови от 7 доноров с нормальным кариотипом. При сравнении М-сегментации и QFH/AcD-исчерченности установлено, что большинство сайтов связывания АТ-МеС соответствуют R- и Т-сегментам.

Высокая плотность сайтов связывания антител отмечена также в районах прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 3, 9, 16 и в коротких плечах акроцентрических хромосом групп D и G. На основе распределения по длине хромосом флуоресцентных сигналов АТ-МеС, имеющих различную интенсивность, визуально оцененную в баллах, были составлены идиограммы. Интенсивный сигнал (4 балла) был выявлен в большинстве Т- и в некоторых R-сегментах, в прицентромерном гетерохроматине хромосом 1, 16 и в коротких плечах больших и малых акроцентриков. Средняя (3 балла) и слабая (2 балла) флуоресценция была характерна для большинства R-, некоторых Т-сегментов и для прицентромерного гетерохроматина хромосом 3 и 9. В семнадцати Rсегментах на хромосомах 2, 3, 4, 6, 8, 9, 13, 16 и во всех G-сегментах флуоресцентный сигнал был очень слабым (1 балл), а в центромерных участках отсутствовал (0 баллов). Типичная локализация и различия в интенсивности флуоресценции позволили идентифицировать легко узнаваемые маркеры (landmarks) для каждой пары аутосом. В качестве таких М-маркеров были определены районы с интенсивностью флуоресценции 3 и 4 балла. Исключение составил только участок 15q24, флуоресценция которого не превысила 2 балла. Большинство М-маркеров совпадали с Тсегментами, некоторые -- с отдельными R- и C-сегментами. Основные характеристики участков аутосом, выделенных в качестве постоянных морфологических маркеров М-сегментации хромосом в лимфоцитах. Специфика М-сегментации половых X- и Y-хромосом не рассматривалась в рамках проведенного исследования. Учитывая случайную инактивацию Ххромосомы в соматических клетках, содержащих две и более Х-хромосомы, особенности их метилирования являются предметом специального изучения. Как и в случае ник-трансляции in situ, опосредованной чувствительными к метилированию рестриктазами, М-сегменты, выявляемые на метафазных хромосомах с помощью специфических антител, характеризуются выраженными различиями в интенсивности флуоресценции. Последние могут быть обусловлены степенью спирализации хромосом, доступностью сайта-мишени для специфических антител, а также плотностью 5-метилцитозина в соответствующих участках.

Фактор спирализации был минимизирован путем отбора метафазных пластинок со средней степенью спирализации хромосом, соответствующей разрешению ~ 400 сегментов на гаплоидный геном. Условия экспериментов были подобраны таким образом, что хромосомы набора были в равной степени денатурированы по всей длине, что обеспечивало одинаковый доступ антител к сайтам связывания. Таким образом, различия интенсивности флуоресценции в условиях применения специфических антител в наших исследованиях, главным образом, определялись степенью метилирования CpG-динуклеотидов хромосомных сегментов. Напомним, что R-сегменты имеют ярко выраженную неоднородность нуклеотидного состава и подразделяются на относительно GC-бедные (L1 и L2) и GC-богатые районы (Н1, Н2 и Н3). Н3+-районы наиболее обогащены GCдинуклеотидами и соответствуют всем Т- и отдельным R-сегментам. Интенсивность флуоресценции АТ-МеС в Н3+-участках варьирует от 2 до 4 баллов, что свидетельствует о различной степени их метилирования. При этом большинство сегментов характеризуется интенсивной флуоресценцией (4 балла), в то время как в отдельных Н3+-сегментах она не превышает 3 баллов. Более того, единичные R-сегменты хромосом 9 и 15, соответствующие Н3+-участкам (9р13, 9q22, 9q32, 15q15, 15q24), характеризуются слабым флуоресцентным сигналом (2 балла). Как уже упоминалось, метилированный цитозин, в основном, в виде динуклеотидов CpG, находится в CpG-островках, распределенных в геноме человека неравномерно. В R-сегментах локализовано 80 % СpG-островков, расстояние между которыми составляет менее 100 т.п.н., в то время как в Gсегментах расстояние между этими островками превышает 1000 т. п. н. Согласно нашим наблюдениям, сегменты хромосом, обогащенные СpGостровками, имеют высокий уровень метилирования. Вместе с тем, некоторые сегменты хромосом 6, 9, 10, 13, 15, характеризующиеся высокой плотностью СpG-островков, обнаруживают слабый (2 балла -- 9p13, 9q22, 10q24, 13q22, 15q24) или даже очень слабый флуоресцентный сигнал (1 балл -- 6q15, 6q21, 6q23, 13q22). Примечательно, что два сегмента хромосомы 9 (9p13, 9q22) и один хромосомы 15 (15q24), характеризующиеся высоким содержанием изохора Н3+ и СpG-островков, имели низкий уровень флуоресценции, что, по всей вероятности, свидетельствовало об их гипометилированном состоянии. Известно, что GC-обогащенность кор- релирует с плотностью генов. Последняя может достигать 20-кратной разницы при сравнении разных R-сегментов метафазных хромосом. Можно предполагать, что слабая степень ме- тилирования некоторых участков хромосом, богатых СG-динуклеотидами и характеризующихся наибольшей плотностью генов, свидетельствует об их функциональной активности в исследуемом типе клеток на соответствующей стадии развития. Интересно отметить, что большинство Т-сегментов хромосом в клетках цитотрофобласта, которые на основании результатов ник-трансляции, опосредованной HpaII и ДНКазойI, были причислены к гипометилированным, оказались гиперметилированными в лимфоцитах периферической крови. Исключение составили сегменты 7q32 и 9q22, которые характеризовались гипометилированным состоянием в обоих типах клеток. Хромосом-специфичный уровень метилирования был отмечен так- же для блоков прицентромерного гетерохроматина. Интенсивность флуоресценции гетерохроматина хромосом 1 и 16 на всех проанали- зированных метафазах была высокой (4 балла) и не зависела от размеров блока. Вместе с тем, для района 9q12 был характерен сигнал меньшей интенсивности (3 балла). Известно, что в геноме человека гетерохроматин большей частью образован сателлитной ДНК I, II, III классов, распределение которых характеризуется определенной хромосом-специфичностью [229, 485]. В состав гетерохроматина хромосомы 9 преимущественно входят сателлиты III и в, более обогащенные CG-динуклеотидами, по сравнению с сатДНК прицентромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1 и 16. Не исключено, что гипометилированное состояние гетерохроматина хромосомы 9 важно для поддержания особой конформационной структуры этого района, необходимой для сохранения функциональной активности. Отличия в интенсивности флуоресценции АТ-МеС наблюдались в коротких плечах акроцентрических хромосом. Как уже обсуждалось выше, причиной этих различий являются полиморфизм сателлитных последовательностей ДНК, входящих в состав прицентромерного гетерохроматина и спутников, и различная активность локализованных в спутничных нитях рибосомных генов.

Таким образом, цитохимический анализ метафазных хромосом человека с использованием специфических антител к 5-метилцитозину позволил обнаружить новый вариант дифференциальной исчерченности, который можно рассматривать как М-сегментацию.

Таким образом, метилирование может влиять на активность генов. В частности, метильные группы могут физически препятствовать контакту фактора транскрипции (белка, контролирующего процесс синтеза информационной РНК на матрице ДНК) со специфичными участками ДНК. С другой стороны, они работают в связке с метилцитозин-связывающими белками, участвуя в процессе ремоделирования хроматина -- вещества, из которого состоят хромосомы, хранилища наследственной информации. Метилирование участвует во многих процессах, связанных с развитием и формированием всех органов и систем у человека. Изучение темы моноклональных антител является очень важной на сегодняшний день т.к. они имеют способность связываться с конкретными антигенами раковых клеток и могут стать терапевтическим средством для широкого спектра раковых заболеваний и находят все более широкое применение в биологии и медицине.

Литература

моноклональный хромосома метилирование

1. Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические аспекты. СПб: Издательство Н-Л, 2006.

Размещено на Allbest.ru