Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Преимущества и недостатки диагностики методом ПЦР.
Рубрика | Биология и естествознание |
Вид | статья |
Язык | русский |
Дата добавления | 25.02.2019 |
Размер файла | 100,1 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Хайруллина Е.В.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции - рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.
Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, доортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.
Ход реакции
1 . Денатурация, или "плавление" ДНК. Двухцепочечную ДНКматрицу нагревают до 94 - 96єС (или до 98єС, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
2. Отжиг - связывание праймеров с матричной ДНК. Когда цепи разошлись, температуру медленно понижают, чтобы парймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается 50-65єС. Время стадии - 20 - 60 секунд. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре).
3. Синтез (элонгация цепи). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве "затравки". Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72єС. Время синтеза зависит от типа ДНК-полимеразы и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7 - 10 минут. В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.
Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Рисунок 1.Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94--96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается [1].
Отрицательный результат ПЦР указывает на то, что в исследуемом материале на момент его сдачи не обнаружено никаких следов инфекционных агентов. Большинство случаев показывает отсутствие инфекции, которую пытались найти в исследуемой пробе.
Положительный результат ПЦР указывает на выявление следов инфекции в исследуемой биологической пробе. С большой точностью положительный результат указывает на наличие инфекции в данный момент времени.
Преимуществами диагностики методом ПЦР являются:
большая чувствительность теста позволяет определить даже единичные агенты возбудителя, что дает возможность выявить патологию на ранней стадии, при хронической и скрытой форме; универсальность метода позволяет использовать почти любой биоматериал для исследования от слюны до клеток кожи; большой охват - при исследовании одного образца возможно определить наличие нескольких разных возбудителей заболеваний; точность - высокий уровень этого метода обследования позволяет не выдавать ложных показателей; скорость - результат готов в среднем за пять часов, то есть пациент на другой день после сдачи биоматериала уже может забрать заключение; относительно невысокая цена - данный метод диагностики по стоимости не отличается от других лабораторных анализов крови;
используя этот метод, можно сделать доклиническую и ретроспективную диагностику. Первая выявляет патогенные микроорганизмы еще до проявления заболевания, а вторая проводится после перенесенной патологии, что позволяет не дать патологии развиться и вовремя ее вылечить, а также определить латентную форму заболевания, протекающую без явных симптомов.
Но совершенных методов диагностики не существует, поэтому и у ПЦР есть минусы: молекулярный биология нуклеиновый
высокие требования к соблюдению технологического процесса; высокие требования к профессионализму лаборантов [2].
Разновидности ПЦР:
"Вложенная" ПЦР (Nested PCR(англ.)) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. "Инвертированная" ПЦР (Inverse PCR(англ.)) - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RTPCR(англ.)) - используется дляамплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) - используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.
Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative realtime PCR) - в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) - с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров кДНК.
Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Polony PCR Colony) - акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) - модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых - Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая - ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК - используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы.
В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 25 п.н.).
Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов [1].
Библиографический список
1. Что такое ПЦР [Электронный ресурс].-режим доступа: https://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/1082075#.D0.A0.D0.B0.D0.B7.D0.BD.D0. BE.D0.B2.D0.B8.D0.B4.D0.BD.D0.BE.D1.81.D1.82.D0.B8_.D0.9F.D0.A6.D0.A 0/ (дата обращения 25.12.2017).
2. Что представляет собой диагностика методом ПЦР? Какие болезни определяет [Электронный ресурс].- режим доступа: http://simptomlechenie.ru/diagnostika-metodom-pcr-kakie-zabolevaniya-opredelyaet.html/(дата обращения 25.12.2017).
3. ПЦР диагностика - анализ на инфекции[Электронный ресурс].-режим доступа: http://www.medicalj.ru/diacrisis/d-immunology/1018-pcr-diagnostikaanaliz-na-infekcii /(дата обращения 25.12.2017).
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Раскрытие содержания генетической инженерии как системы использования методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования наследственных свойств организмов. Синтез ДНК и полимеразная цепная реакция. Ферменты генетической инженерии.
презентация [2,6 M], добавлен 05.02.2014История открытия полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разновидности ПЦР, ее проведение. Наличие в реакционной смеси ряда компонентов. Циклический и температурный режим. Основные принципы подбора праймеров. Подготовка пробы биологического материала.
курсовая работа [51,0 K], добавлен 16.06.2014Сущность полимеразной цепной реакции, ее сопоставление с реакцией атомного взрыва. Последовательность операций включения ДНК в плазмиду. Комплекс мер по умножению количества индивидуального белка и его подлинность. Физические основы электрофореза.
реферат [62,1 K], добавлен 11.12.2009Генетическая система бактерий. Полимеразная цепная реакция. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний. Метод молекулярной гибридизации. Особенности генетики вирусов. Системы репарации бактерий. Взаимодействие вирусных геномов.
презентация [2,6 M], добавлен 13.09.2015Процесс амплификации с отжигом праймеров с комплементарными последовательностями и достройкой полинуклеотидных цепей с праймеров ДНК-полимеразой. Проведение амплификации однокопийной последовательности ДНК методом секвенирования без ее клонирования.
учебное пособие [1004,2 K], добавлен 11.08.2009Метод "прыжков по хромосоме", его преимущества и недостатки. Создание библиотек "хромосомных прыжков" и клонов-связок. Получение ДНК-фрагментов желаемого размера методом тандемного лигирования молекул ДНК и расщепление циклизованных молекул ДНК.
учебное пособие [1,7 M], добавлен 11.08.2009Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Секвенирование как метод исследования нуклеиновых кислот. Определение нуклеотидовой последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта. Новейшие методы определения последовательности ДНК.
курсовая работа [385,7 K], добавлен 10.03.2016Общая характеристика науки биологии. Этапы развития биологии. Открытие фундаментальных законов наследственности. Клеточная теория, законы наследственности, достижения биохимии, биофизики и молекулярной биологии. Вопрос о функциях живого вещества.
контрольная работа [28,1 K], добавлен 25.02.2012Предмет изучения молекулярной биологии. Требования к решению задач на установление последовательности нуклеотидов в ДНК, иРНК, антикодонов тРНК, специфика вычисления количества водородных связей, длины ДНК и РНК. Биосинтез белка. Энергетический обмен.
презентация [111,0 K], добавлен 05.05.2014Биология, молекулярная эволюция и филогения осетровых рыб. Разнообразие островых рыб Амура. Полимеразная цепная реакция и автоматическое секвенирование ДНК с флуоресцентной меткой. Получение геномной ДНК и ее PCR-амплификация. Тесты для псевдогенов.
курсовая работа [680,8 K], добавлен 21.02.2014Каталитическая активность молекул нуклеиновой кислоты РНК, функции фермента. Процесс созревания мРНК и тРНК. Понятие и разновидности сплайсинга малых ядерных РНК, роль и свойства мяРНК. Механизм регуляции активности генов и клеточной дифференцировки.
курсовая работа [4,4 M], добавлен 09.06.2011Сшивка фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты по одноименным и разноименным "липким концам" и коннекторным методом. Организация генов про- и эукариот. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Подходы к клонированию ДНК.
реферат [33,4 K], добавлен 01.12.2016Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.
реферат [25,5 K], добавлен 31.08.2014Геном человека. Генетические продукты. Определение отцовства методом ДНК-диагностики. Дактилоскопическая идентификация человека. Гистологические и цитологические методы исследования в судебной медицине. Век биологии и генетики.
реферат [18,9 K], добавлен 18.04.2004- Эффективность и качество использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике гриппа
Рассмотрение сути метода полимеразной цепной реакции. Понятие амплификации как процесса увеличения числа копий дезоксирибонуклеиновой кислоты. Основные принципы подбора праймеров при создании тест-системы. Подготовка пробы биологического материала.
курсовая работа [610,8 K], добавлен 14.11.2014 Основная цель, которую преследовал Мендель. Явления доминирования и расщепления. ДНК как хранитель наследственной информации. Выделение из нуклеиновых кислот тимина и цитозина. Выявление в составе нуклеиновой кислоты фосфорной и пятичленного сахара.
реферат [23,8 K], добавлен 09.10.2009Микроорганизмы, имеющие более простое строение по сравнению с клетками животных и растений. Размеры, внутренние и поверхностные структуры бактерий и вирусов. Соединения белка и нуклеиновой кислоты, способные размножаться только в пораженной клетке.
презентация [2,0 M], добавлен 26.09.2011Открытие вирусов, их размеры, особенности строения и жизненный цикл. Синтез компонентов вирусной частицы - нуклеиновой кислоты и белков капсида. Вирусы растений, животных и человека как возбудители различных заболеваний. Эволюционное развитие вирусов.
контрольная работа [433,8 K], добавлен 15.03.2014История открытия вирусов, их детальное исследование после изобретения микроскопа. Характеристика вирусов: свойства, формы существования, строение, химический состав и процесс размножения. Гипотеза о происхождении вирусов из "беглой" нуклеиновой кислоты.
презентация [553,5 K], добавлен 18.01.2014Изучение живых клеток и их составных частей. Достижение молекулярной биологии - расшифровка генетического кода и выяснение механизма использования клеткой информации. Генетические механизмы и эволюция. Каталитическая РНК.
реферат [523,2 K], добавлен 10.04.2007