Подбор оптимальной среды высушивания для лиофилизации Listeria

Размещено на http://www.allbest.ru/

Подбор оптимальной среды высушивания для лиофилизации Listeria

Гранкина А.С.

Феоктистова Н.А.

ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ

Ульяновск, Россия

Цель работы - подобрать оптимальную среду высушивания для рода Listeria. лиофилизация бактерия посев listeria

В работе использован штамм L. monocytogenes MD из коллекции 19601970 гг.

Начальным этапом при лиофилизации бактерий является накопление бактериальной массы на плотных или жидких питательных средах.

Изучаемый штамм рода Listeria имеет температурный оптимум роста 25-37°С, непривередлив к составу питательных сред [1-9]. В связи с этим в качестве среды накопления был выбран мясопептонный агар (МПА).

Готовили суточную культуру бактерии, затем бактериологической петлей делали посевы штрихом (т.к. нанесение культуры штрихом более удобно, можно наблюдать культуральные свойства отдельных колоний, а так же стерильность культуры, при посеве газоном сливной рост не позволяет выявить постороннюю контаминацию) на МПА. Чашки Петри инкубировали в термостате 24 часа при 37°С.

Через сутки наблюдали чистые колонии без посторонней контаминации.

После суточного инкубирования чашек и микроскопии колоний проводили смыв бактериальной массы 4,5 мл МПБ. Для этого бактериологической петлей отслаивали культуру с агара и при помощи пипетки отсасывали получившуюся суспензию бактерий в стерильные пробирки.

По отзывам и рекомендациям из литературы, нами были подобраны компоненты и составлены среды для высушивания.

Стабилизаторы:

1. Сухое обезжиренное молоко (9%), лактоза (5%) , сахароза (5%) на 100 мл Н2О.

2. Лактоза (1%), сорбит (1%), сахароза (3%), желатин (2%) на 100 мл Н2О.

Компоненты для каждой среды смешивали в 100 мл дистиллированной воды, и растворяли на кипящей водяной бане. Стерилизацию проводили автоклавированием при 0,5 атм в течение 25-30 минут. Готовые среды хранили в холодильнике при температуре не выше 10°C.

Так как в процессе лиофилизации погибает большое количество клеток от 30 до 60% рекомендуемая концентрация микробной взвеси должна быть не менее 1 млрд м.к. / мл. (1Ч109 м.к./мл).

Через 30 минут после отстаивания клеток бактерий с помощью пипетки удаляли надосадок и полученную бактериальную массу смешивали со стабилизатором в пропорции 1:1.

Далее получившуюся суспензию разливали в ампулы по 1 мл, ставили их на предварительную заморозку в холодильную камеру при температуре 45°C на 24 часа.

Достав ампулы из холодильника, переносии их в камеру лиофильной сушки, предварительно положив мини холодильники под нижнюю полку камеры для поддержания еще большей минусовой температуры.

В общей сложности процесс лиофилизации длился 24 часа. Первые 1214 часов температура возрастала от -45°C до 0°C.

В промежутке времени 15-24 ч. Температура повышалась от 0°C до +18°C.

Досушивание препаратов проводили с помощью инфракрасной лампы для удаления остаточной влаги, доводя температуру датчика до 28°C.

Высушенные препараты запаивали под вакуумом и хранили в условиях бытового холодильника при температуре 4-6°С.

После высушивания и запайки ампул смотрели внешний вид препарата.

1. Окраска сухого препарата равномерная.

2. Сокращение объема, по сравнению с исходными ампулами перед высушиванием, не наблюдали.

3. Содержимое всех ампул с высушенным материалом лучше растворялось в первом стабилизаторе.

4. Появление пузырьков на поверхности материала, как результат наличия в замороженной массе некоторого количества жидкости, не наблюдали.

5. Крупную неравномерную пористость в стабилизаторе всех высушенных ампул не обнаружили.

6. Плохое отставание сухой массы от стенок ампулы было проявлено в стабилизаторе под №2.

В результате можно сказать, что по физическим свойствам стабилизатор под №1 лучше. Но для более точного ответа необходима проверка выживаемости культуры после лиофилизации.

Библиографический список

1. Васильев, Д.А.Разработка параметров количественного определения бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii на основе мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина, А.В. Мастиленко // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных».

Покров. - 2014. - С. 91-96.

2. Разработка системы фаготипирования листерий / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. - 2014. - сентябрь, специальный выпуск - С. 87-88.

3. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. - 2014. - сентябрь, специальный выпуск - С. 69-70.

4.Сульдина Е.В. Применение метода молекулярно-генетического анализа для видовой идентификации мяса/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 227-231.

5.Сульдина Е.В. Применение метода Real-time PCR для видовой идентификации мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова,С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 236-240.

6.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах методом

ДНК-диагностики/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В.

Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 231-235.

7.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мяса методом полимеразной цепной реакции в режиме «Реального» времени/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. 2012. -С. 241-244.

8. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом ПЦР в режиме реального времени / А.С. Гранкина, Е.В. Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 84-88.

9. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом классической ПЦР / А.С. Гранкина, Е.В.Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 89-93.

10. Сульдина Е.В. Выделение листериозных бактериофагов и изучение их основных биологических свойств / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Б.И. Шморгун, Д.А. Васильев // Аграрный научный журнал. Саратов. - 2015. № 3. С. 37-41.

11. Сульдина Е.В. Фаготипирование листерий / Е.В.Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва - 2014. с. 223.

12. Ковалева Е.Н. Вопросы биоконтроля пищевого листериоза / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина, И.Г. Швиденко, Б.И. Шморгун // Материалы VII Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва. - 2015. с. 157.

13. Сульдина Е.В. Количественное определение патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции "Инновации в пищевой технологии, биотехнологии и химии". Саратов. - 2017. - С. 202204.

14. Сульдина Е.В. Разработка параметров количественного определения патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания методом Real-Time PCR / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С.

412-413.

15. Сульдина Е.В. Оптимизация эффективности мультиплексной ПЦРтест-системы для детекции L. monocytogenes и L.ivanovii / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ

ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 425-426.

16. Гранкина А.C. Идентификация штаммов листерий коллекции 19601970 гг. методом ПЦР/ А.C. Гранкина, Е.В. Сульдина // Материалы

Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. -

Ульяновск. - 2017. - С. 66-71.

17. Ломакин А.А. Дифференциация бактерий видов Bordetella trematum и Bordetella petrii / Ломакин А.А., Мастиленко А.В., Васильева Ю.Б. и др.// Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. - Ульяновск. - 2017. - С. 83-86.

18. Сульдина Е.В. Выделение бактерий и бактериофагов Yersinia enterocolitica / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 3 (39). - С. 50-55.

19. Сульдина Е.В. Создание тест-системы на основе бактериофагов для детекции возбудителя пищевого листериоза и мониторинга листериозной инфекции // Молодежный инновационный форум Сборник аннотаций проектов. Ульяновск. - 2016. - С. 353-355.

20. Сульдина Е.В. Листериозные бактериофаги - как средство индикации и идентификации L. monocytogenes. /Сульдина Е.В., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. и др. // Материалы Третьей научно-практической конференции с международным участием Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. - 2016. с. 85.

21. Сульдина Е.В. Основные биологические свойства листериозных бактериофагов / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Материалы VI Международной научно-практической конференции Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Ульяновск. - 2015. - С. 125-127.

Размещено на Allbest.ru