Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Пензенский государственный университет

Кафедра "Общая биология и биохимия"

Направление подготовки - 06.03.01 Биология

Профиль подготовки - Биохимия

Реферат

по дисциплине "Введение в биотехнологию"

на тему: "Биотехнология рекомбинантных ДНК"

Выполнил студент: Зубанова М.В.

Проверил: к. б. н., проф. Соловьев В.Б.

Пенза, 2017

Содержание

• Введение
• 1. Биотехнология рекомбинантных ДНК
• 2. Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей
• 3. Секвенирование ДНК
• 4. Метод гибридизации нуклеиновых кислот
• 5. Метод генетической рекомбинации
• Заключение
• Список литературы


Введение

Генетическая инженерия - ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности и способы создания лабораторным путем (invitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм.

Генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисциплины - создание генетических программ, основная задача которых - создание invitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой ("чужеродной") ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласно определению национальных институтов здоровья США, "рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке".[2]

1. Биотехнология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. Используя технологию рекомбинантных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерии. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие задачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получать многие белки, участвующие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма.[1]

2. Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1. используемые для получения фрагментов ДНК;

2. синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;

3. соединяющие фрагменты ДНК;

4. позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;

5. применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Согласно номенклатуре, предложенной Х. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие - первые буквы вида. Например, фермент из Escherichiacoli обозначают как Есо или из Haemophilusinfluenzae --Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т.д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными с тупыми либо липкими концами (рис. 1).

Рис. 1. Разрыв ДНК с образованием рестрикционных фрагментов.

Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагмента коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами (участками) без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач.[1]

3. Секвенирование ДНК

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время объем информации о последовательностях ДНК столь велик, что для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах ей обходимы новые технологии и компьютерная техника. нуклеотид полипептид аминокислотный ген

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполнении и результативны. Результаты секвенирования позволяют также на основе генетического кода определить аминокислотную последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене. Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использованием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его результатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК.

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь. В этом случае обычно используют дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза, представленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифицированный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК- полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез invitro молекулы ДНК в присутствии затравки (праймера) и небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде "лесенки". Если для получения таких фрагментов применять меченую ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использованием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электрофоретический анализ проводить на четырех дорожках геля, то можно определить последовательность нуклеотидов. В настоящее время используют модифицированный метод, сводящийся к флуоресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе движения по одной дорожке геля.[1]

4. Метод гибридизации нуклеиновых кислот

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100°С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК ("плавлением"). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит к восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или "отжиг"). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для решения эволюционных и филогенетических проблем.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить.

Одноцепочечную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Размеры его варьируют от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч нуклеотидов. Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое количество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК-зонду, присутствует в геноме клетки.

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизации с РНК - для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для выявления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК - зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии.[1]

5. Метод генетической рекомбинации

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации invitro. Этот подход был разработан на бактериях, он основан на важном свойстве ДНК - способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса: общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию.

В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий.

В процессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые особым сайт-специфическим ферментом, что приводит к трансформации распределения нуклеотидных последовательностей в геноме.

Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомологичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих такие одноцепочечные разрывы, относят: химические агенты, некоторые виды излучения, специфические белки. Например, у Escherichiacoli обнаружен белок rec BCD, который вызывает в молекулах ДНК одноцепочечные разрывы. Белок rec BCD представляет собой ДНК- зависимую АТРазу, которая действует как ДНК-хеликаза, перемещающаяся по спирали ДНК и вызывающая ее расплетение. Под влиянием этого белка, обладающего нуклеазной и хеликазнойакnивностью, на двойной спирали ДНК возникает разрыв с образованием одноцепочечногоучастка ("ус").

Белок rec BCD присоединяется к двойной спирали ДНК с одного конца (5') и со скоростью около 300 нуклеотидов в секунду движется вдоль спирали ДНК за счет гидролиза АТР. Одновременно с белком движется и возникшая петля ДНК. Когда петля на спирали достигает участка, называемого сайтом узнавания, одна из цепей разрывается с освобождением небольшого одноцепочечного участка "ус". Возникший "ус" инициирует дальнейшую генетическую рекомбинацию.

В процессе общей генетической рекомбинации центральная роль отводится комплементарным взаимодействиям нуклеотидных последовательностей. Кроме того, этот процесс требует участия особого белка гесА. Белок гесА прочно связывается в виде крупных кластеров с одиночными цепями ДНК, одновременно удерживая и двойную спираль. За счет двух сайтов данный белок имеет еще один участок - для связывания и гидролиза АТР, т.е. он представляет собой ДНК-зависимую АТРазу. Благодаря особенностям белка гесА осуществляются одноцепочечный обмен между двумя двойными спиралями с удалением некоторого количества нуклеотидов и локальный ресинтез ДНК.

Разрыв в одной из цепей ДНК высвобождает эту цепь, и он внедряется во вторую спираль, образуя короткий спаренный участок. После начального обмена гомологичные нуклеотидные последовательности двух взаимодействующих спиралей устанавливаются в строго соответствии одна с другой, в связи с чем происходит расширение области слияния и быстрый обмен между спиралями. Для этого процесса, разные организмы используют не одинаковые механизмы, большинство из которых включает в качестве промежуточного этапа обмен с перекрещиванием цепей между двумя спиралями ДНК.

Структура, образующаяся при обмене с перекрещиванием цепей, содержит две перекрещенные и две не перекрещенные цепи. Она способна существовать в различных изомерных формах. Изомеризация меняет положение двух пар цепей: две ранее перекрещивающиеся цепи становятся неперекрещивающимися и наоборот. Для того чтобы восстановили две отдельные спирали ДНК и тем самым прекратился процесс слияния, в каждой из двух перекрещённых цепей должен произойти разрыв.[1]

Заключение

Таким образом, технология рекомбинантных ДНК - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. В биотехнологии существует несколько методов технологии рекомбинантных ДНК - расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами; сиквенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК; гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания; клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус); генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы.

В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК-синтезаторах (приборах для автоматического химического синтеза ДНК) практически в неограниченном количестве, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать.

Эксперименты с рекомбинантными ДНК используют крупномасштабно в промышленном производстве БАВ.[2]

Список литературы

1. "Основы биотехнологии" Учебное пособие./ Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. 3-е издание, Москва: Издательский центр "Академия", 2006 г, 208 стр.

2. http://otherreferats.allbest.ru/biology/00059330_0.html

Размещено на Allbest.ru