Влияние защитных сред на выживаемость штаммов бактерий при лиофилизации

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВЛИЯНИЕ ЗАЩИТНЫХ СРЕД НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ПРИ ЛИОФИЛИЗАЦИИ

IMPACT PROTECTIVE MEDIA ON THE SURVIVAL OF STRAINS OF BACTERIA LYOPHILIZATION

Голякевич З.С., Калдыркаев А.И., Феоктистова Н.А.

Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия

имени П.А. Столыпина, Россия

Аннотация

Состав среды оказывает важное влияние на выживаемость штаммов бактерий. Чтобы снизить воздействие множества повреждающих факторов в процессе замораживания используют защитные вещества и среды (криопротекторы). Микроорганизмы, особенно относящиеся к неустойчивым видам, при высушивании в суспензиях, не содержащих защитных веществ, подвержены значительным изменениям, которые сопровождаются не только утратой жизнеспособности, но и разрушением их клеточной структуры.

Ключевые слова: лиофилизация, защитная среда, штаммы бактерий.

Цель

Изучить влияние стабилизатора на грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий.

Материалы и методы

Штаммы бактерий: Alcaligenes sp. B-5269; Acinetobacter baumannii B-10246, Pseudomonas putida 18 (B-1827), Escherichia coli B-25422, Bacillus mycoides 537, Bacillus сereus 96.

Питательные среды: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, сухое обезжиренное молоко ГОСТ Р 52791-2007, сахароза, лактоза, сорбит, желатин пищевой ГОСТ 11293-89.

Хорошими защитными свойствами обладает обезжиренное молока Микроорганизмы при высушивании в молоке сохраняют высокую выживаемость: Staphylococcus и Е. coli - до 70% (Lambin и др., 1958), фитопатогенные бактерии -до 60-80% (Е. В. Самосудова, 1965),

Past, pestis -до 60% (Heckly и др., 1958). Культура Hemoph. pertussis, по сообщению Flosdorf и Kimball (1940), при высушивании в молоке сохраняла жизнеспособность и все свои первоначальные свойства при хранении в течение более 2 лет.

Сахарозо-желатиновая среда считается одним из лучших стабилизаторов при высушивании вирусов. По данным А.А. Смородинцева и др. (1958), активность противопаротитной живой вакцины при высушивании в этой среде снижалась незначительно и была практически стабильной при хранении сухих препаратов в условиях температуры + 24°С.

Нами было подобрано 4 состава сред представленных в таблице №1. Основными компонентами сред послужили полисахарид агар-агар, сахара лактоза и сахароза, белковые компоненты сухое обезжиренное молоко и желатин.

Таблица 1

Состав сконструированных защитных сред (стабилизаторы)

Подсчет титра культур бактерий до лиофилизации

выживаемость штамм бактерия лиофилизация

Первоначально мы исследовали титр бактериальной массы, полученной при смыве с чашек Петри до смешивания ее со стабилизатором, в соотношении 1:1. При подсчете выросших колоний результат половинили с учетом того если бы исследовали 1 мл суспензии стабилизатора и бактерий.

Подсчет титра культур бактерий после лиофилизации

Концентрацию микробных клеток определяли методом титрования растворенной суспензии лиофилизата. В ампулу шприцом вносили 1 мл стерильного 0,9% водного раствора хлорида натрия для регидратации. Через 30 минут после полной регидратации (растворении), содержимое пробирки в объеме 1 мл переносили в пробирку для раститровки. С раститрованных разведений делали посевы на чашки с МПА в объеме 0,2 мл и распределяли шпателем по поверхности среды. Инкубирование проводили при 37 °C в течении 24-48 часов. Учет результатов проводили в 1 и 2 сутки.

Результат подсчета концентрации клеток грамположительных штаммов представлены в таблице №2.

Таблица 2

Анализ выживаемости клеток после лиофилизации грамположительных бактерий

Вывод

В процессе лиофилизации культур было выявлены некоторые недостатки в частности низкая выживаемость грамотрицательных культур от 7,1 до 18,7 % при высушивании на всех четырех средах. Что является причиной в настоящий момент не ясно. В дальнейшем предлагаем отбирать культуры в конце логарифмической стадии роста или в начале стационарной фазы. А также добавить в МПА дополнительные питательные компоненты твин-80 и олеиновые кислоты для повышения жизнеспособности бактерий.

Список литературы

1. Бекер М. Е. Торможение жизнедеятельности клеток / М. Е. Бекер, А. И. Рапопорт, Л. В. Калакуцкий [и др.]. - Рига: Зинатне, 1987. - 240 с

2. Бибен И.А. Лиофилизация пробиотической культуры / И.А Бибен.// Уральский научный вестник. 2016. Т. 4. № 1. С. 35-39.

3. Брюханов, А. Л. Длительное хранение строго анаэробных микроорганизмов вглицерине / А. Л. Брюханов, А. И. Нетрусов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - № 2. - С. 2000-2003.

4. Будыка Д. А. Биотехнология стабилизации живых микроорганизмов в биомассе и в препарате чумной вакцины/ Д. А. Будыка, Н. В. Абзаева // Инфекция и иммунитет. - 2016. - Т. 6, № 1. - с. 87-92.

5. Бузолева, Л. С. Некультивируемые формы бактерий Yersinia pseudotuberculosisпри периодическом культивировании / Л. С. Бузолева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - Т. 129. - № 4. - С. 444-447.

6. Васильева З.В. Сухая дрожжевая питательная среда для диагностики чумного микроба / З.В Васильева с соавт. // Проблемы природной очаговости чумы: Тез. докл. к 4 советско-монгольской конф. специалистов противочумных учреждений.- 1980. - ч.3.- С. 60 - 61.

7. Волков, В. Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах стабильности микроорганизмов к замораживанию и высушиванию // Микробиология. - 1994. - Т. 63. - Вып. 1. - С. 5-16.

8. Lapage, S. P. Preservation of microorganisms / S. P. Lapage, K. F. Redway // Handb. Microbiol. Clevelend. - Ohio (USA), 2011. - V. 1. - P. 713-724.

9. Malik, K. A. Bacterial culture collection: Their importance to biotechnology and microbiology / K. A. Malik, D. Claus // Biotech. and Genetic Engenering Rev. - 1997. - V. 5. - P. 137-197.

10. Malik, K. A. Liquid-drying of microorganisms using a simple apparatus / K. A. Malik // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1992. - V. 8. -Р. 80-82.

11. Калдыркаев А.И. Изучение биологических свойств выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis/ А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова //- Ульяновск: УГСХА 2010. - С.65-70.

12. Калдыркаев А.И. Выделение бактерий вида Bacillus subtilis из объектов санитарного надзора/ А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова// - Ульяновск: УГСХА, 2010. - С.72-76.

13. Калдыркаев А.И. Изучение чувствительности бактерий рода Bacillus к различным концентрациям хлорида натрия/ А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, С.В. Мерчина // - Ульяновск: УГСХА, 2011. - С.185-188.

14. Калдыркаев А.И. Методы выделения бактериофагов бактерий Bacillus / А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина,, Н.А. Феоктистова // -Ставрополь: изд-во «Энтропос», 2011. - № 4. - С.88-89.

15. Калдыркаев А.И. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова // - Оренбург: ОГАУ, 2011. - № 4(32). - С. 288-291.

16. Калдыркаев А.И. Биохимические свойства бактерий Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин, Д.А.Васильев // Саратов, 2013. - С. 186-188.

17. Калдыркаев А.И. Биоиндикация бактерий Вacillus mycoides в объектах санитарного надзора / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, М.А. Лыдина, Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев, И.Г. Швиденко // Ульяновск - 2013. - № 3 (23). - С. 52-56.

18. Калдыркаев А.И. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, А.В. Алешкин // Ульяновск, НИИЦМиБ, 2013. - 98 с.

19. Калдыркаев А.И. Распространение Вacillus cereus и Вacillus mycoides в объектах санитарного надзора / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова // Ульяновск - 2014. - № 1 (25). - С. 68-76.

Размещено на Allbest.ru