ДНК-зонды и их использование в вирусологии
Использование метода ДНК-зондов для обнаружения нуклеиновых кислот (а также вирусных) в любых материалах, включая патологический материал от больных животных. Последовательность нуклеотидов в цепи ДНК. Методика обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты.
Рубрика | Биология и естествознание |
Вид | статья |
Язык | русский |
Дата добавления | 22.03.2019 |
Размер файла | 58,2 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия
ДНК-зонды и их использование в вирусологии
Галина Я.С., Николаева О.Н.
Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты (в том числе и вирусные) в любых материалах, включая патологический материал от больных животных. Он основан на способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот соединяться в двухцепочечные, если они взаимно комплементарны. Каждая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой цепь нуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями. Любой же нуклеотид можно рассматривать как структуру, состоящую из трех частей:
-фосфорной кислоты (H3PO4);
-сахара (рибозы или дезоксирибозы);
-азотистого основания (аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил); В зависимости от вида входящего в состав нуклеотидов сахара нуклеиновые кислоты делятся на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК) [2].
Нуклеотиды одного вида нуклеиновой кислоты по своему составу различаются только азотистыми основаниями, которых четыре вида (А, Т, Г, Ц) для ДНК и (А, У, Г, Ц) для РНК.
Пуриновые основания (А и Г) способны связываться с пиримидиновыми (Т, Ц и У) водородными связями. Поэтому и соответствующие нуклеотиды могут связываться между собой парами А-Т и Г-Ц. Это свойство называется комплементарностью. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновые кислоты) способны связываться водородными связями в одну двухцепочечную, если последовательность нуклеотидов одной точно соответствует последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары А-Т и Г-Ц. Такие две молекулы ДНК называются взаимно комплементарными. Ими могут быть не только две молекулы ДНК или две молекулы РН, но и ДНК с РНК (при этом все пары А-Т образуется А-У) Например, две молекулы ДНК, имеющие следующие последовательности нуклеотидов:
1) А А Г Ц А Т Г Г Ц Т…….Ц А А А Г Т;
2) Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А…….Г Т Т Т Ц А; являются взаимно комплементарными. Если смесь таких нуклеиновых кислот подержать при 55?С, то примерно через 2 ч образуются двухцепочные молекулы ДНК (рисунок 1).
нуклеиновый кислота патологический животное
Рисунок 1 Последовательность нуклеотидов в цепи ДНК
Поскольку исходные одноцепочные молекулы могут происходить из разных источников, это процесс удвоения молекул называется молекулярной гибридизацией. Нагрев материала, содержащего двухцепочные ДНК, до 80*С или обработка его щелочью приводят к разделению двухцепочных молекул на одноцепочные, что называется денатурацией.
Любой вирус включает одну специфичную для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту в материале от больного животного, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двухцепочная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как-либо помеченной.
Такая меченая одноцепочная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку или в виде атомов радиоактивного фосфора (Р32), или в виде биотина, дающего изменение цвета, что позволяет обнаруживать зонд, а значит, и вирусную нуклеиновую кислоту, с которой зонд соединился в результате молекулярной гибридизации.
Методика обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом материале включает следующие этапы:
1) получение ДНК-зонда и его метка;
2) подготовка патологического материала к исследованию;
3) молекулярная гибридизация и удаление одноцепочечных нуклеиновых кислот;
4) обнаружение двухцепочных нуклеиновых кислот, включивших в себя зонд (по метке);
5) интерпретация результатов.
Получение ДНК-зонда - наиболее трудная задача. Она сводится к тому, что ДНК соответствующего вируса, на который хотят получить ДНК-зонд, разрезают на фрагменты (с помощью рестриктаз). Методом электрофореза выделяют тот фрагмент, который неизменно обнаруживается в ДНК вирусов разного происхождения и является наиболее консервативным.
Из бактерии кишечной палочки выделяют те плазмиды, которые содержат ген фермента, разрушающего какой-либо антибиотик (например, ген пенициллиназы). Плазмидные ДНК с вирусными вставками вводят в бактерии, которые затем клонируют в селективной среде, содержащей антибиотик, к которому бактерии стали нечувствительными. Накапливают массу бактерий и из них выделяют плазмидную ДНК (путем удаления белка).
Выделенную плазмидную ДНК, содержащую вирусные вставки, метят радиоактивным фосфором (Р32) путем ник-трансляции и денатурируют путем нагрева до 80°С. Образовавшиеся одноцепочные молекулы ДНК будут иметь фрагменты, комплементарные фрагментам одной из нитей ДНК вируса. Это и есть ДНК-зонд.
Для получения ДНК-зонда на вирусную РНК выбирают на основе анализа генетической карты вируса необходимый фрагмент РНК, выделяют его, а затем путем обратной транскрипции получают ДНК-фрагмент, который и встраивают в плазмиду. Обычно ДНК-зонд готовят на каждый вирус заранее, нарабатывают его и хранят до использования.
С помощью ДНК-зонда можно обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты в любом материале от больных животных. Для этой цели пригоден как свежий материал (ткани, смывы, кровь), так и высушенный, мороженный и даже частично разложившийся.
Из подлежащего исследованию материала выделяют ДНК, для чего его гомогенизируют, суспензируют, центрифугируют и надосадочную обрабатывают препаратами, разрушающими белки (сначала протеиназой К, затем фенолом хлороформом). После полного удаления белков осаждают ДНК при температуре -70°С, осадок отмывают спиртом и подвергают денатурации путем кипячения или обработки щелочью.
Полученные пробы из разных исследуемых материалов наносят на микропористую капроновую или нейлоновую мембрану(фильтр), расчерченную простым карандашом на квадраты (для каждого материала свой номер квадрата). Также наносят отрицательный и положительный контроли. Зонд наносят на стекло, которое затем накладывают на фильтр так, чтобы получился контакт зонда с исследуемым материалом, и 20 мин выдерживают при температуре 80°С, после чего температуру снижают до 55°С, при которой идет гибридизация (около 2 часов). Затем фильтр отделяют от стекла, промывают, сушат и удаляют с него все несвязавшиеся одноцепочные молекулы ДНК, обрабатывая додецилсульфатом и цитратом натрия. Методом авторадиографии устанавливают, в каких квадратах выявляется радиоактивность, и визуально оценивают ее интенсивность. Потемнение фотопленки, контактирующей с определенными квадратами, свидетельствуют о наличии в материалах этих квадратов искомой нуклеиновой кислоты вируса.
Использование радиоактивной метки для зонда является довольно большим недостатком метода, и поэтому разрабатываются другие методы метки зонда, в том числе присоединение к зонду метки, изменяющие цвет субстрата. Метод молекулярных зондов перспективен, так как позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты любых вирусов, для которых получен зонд. Однако исследования этим методом технически довольно сложны и трудно выполнимы.
Кратко метод ДНК-зондов сводится к следующему:
1. Получение одноцепочного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНК-зонда) и его метка.
2. Выделение и патологического материала нуклеиновых кислот и их денатурация (расплетение двухцепочных молекул на одноцепочные).
3. Контакт образовавшихся одноцепочных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55?С, приводящий к образованию двухцепочных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности.
4. Удаление всех негибридизированных одноцепочных молекул нуклеиновых кислот.
5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.
Достоинства: Высокие чувствительность и специфичность, универсальность, отсутствие необходимости в стерильной работе и математической обработке материалов.
Недостатки: Относительная технологическая сложность, и трудность получения ДНК-зонда [1].
Библиографический список
1 . Белоусова, Р. В. "Практикум по ветеринарной вирусологии" [Текст] : учеб. пособие для студ. вузов по спец. 111201 "Ветеринария" / Р. В. Белоусова, Н. И. Троценко, Э. А. Преображенская . - 3-е изд., перераб. и доп. - Москва : КолосС, 2006. - 150-153 с.
2. Госманов, Р. Г. "Ветеринарная вирусология" [Текст] : учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. - 2-е изд., перераб. и доп. - Москва : КолосС, 2006 г. - 284 - 286 с.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая - ДНК, рибонуклеиновая - РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.
реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Секвенирование как метод исследования нуклеиновых кислот. Определение нуклеотидовой последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта. Новейшие методы определения последовательности ДНК.
курсовая работа [385,7 K], добавлен 10.03.2016Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).
презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.
курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.
контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012Сущность, состав нуклеотидов, их физические характеристики. Механизм редупликации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), транскрипция ее с переносом наследственной информации на РНК и механизм трансляции — синтез белка, направляемый этой информацией.
реферат [461,8 K], добавлен 11.12.2009Основная цель, которую преследовал Мендель. Явления доминирования и расщепления. ДНК как хранитель наследственной информации. Выделение из нуклеиновых кислот тимина и цитозина. Выявление в составе нуклеиновой кислоты фосфорной и пятичленного сахара.
реферат [23,8 K], добавлен 09.10.2009Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.
презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014Открытие вирусов, их размеры, особенности строения и жизненный цикл. Синтез компонентов вирусной частицы - нуклеиновой кислоты и белков капсида. Вирусы растений, животных и человека как возбудители различных заболеваний. Эволюционное развитие вирусов.
контрольная работа [433,8 K], добавлен 15.03.2014Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.
презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013Понятие генетического кода как единой системы записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов. Этапы реализации, свойства и расшифровка хромосомы в клетке. Работа по секвенсированию генома человека.
реферат [89,1 K], добавлен 18.01.2011Анализ стадий и типов фотохимических реакций. Исследование механизма действия ультрафиолетового излучения на белки и нуклеиновую кислоту. Люминесцентная микроскопия. Описание микроскопов серии "Люмам". Применение люминесцентных меток и зондов в медицине.
презентация [1009,8 K], добавлен 10.04.2015История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.
презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014Понятие и структура генетического кода как способа записи информации о последовательности аминокислот белков через последовательность нуклеотидов ДНК и РНК. История и способы его расшифровки, главные свойства. Использование синонимичных кодонов.
презентация [2,2 M], добавлен 14.04.2014Классификация экзопланет, методы обнаружения внесолнечных планет. Спектрометрическое измерение радиальной скорости звезды. Возникновение гравитационного микролинзирования. Изучение периодичности затмения двойных звезд и возникновения полярного сияния.
реферат [29,4 K], добавлен 14.03.2015Понятие и особенности строения нуклеиновых кислот, их составные элементы и их внутреннее взаимодействие. Значение данных соединений в организме, история их открытия и основные этапы исследований. Длина молекул ДНК. Сущность принципа комплементарности.
презентация [1,5 M], добавлен 27.12.2010История открытия нуклеиновых кислот. Основные виды РНК. Методы цитологического распознавания ДНК и РНК. Закономерности количественного содержания азотистых оснований в молекуле ДНК, правила Чаргаффа. Строение молекул РНК. Структура азотистых оснований.
презентация [1,4 M], добавлен 13.01.2011Характеристика оксикоричневых кислот и этиленовых связей. Основные виды ароматических органических кислот: бензойная, салициловая, галловая. Общее описание Родиолы розовой. Применение препарата "Экстракт родиолы жидкий". Анализ цикориевой кислоты.
курсовая работа [755,2 K], добавлен 06.04.2012История открытия дезоксирибонуклеиновой кислоты - биологического полимера, состоящего из двух спирально закрученных цепочек. Первичная структура и конформации компонентов нуклеиновых кислот. Макромолекулярная структура ДНК, полиморфизм двойной спирали.
презентация [1,1 M], добавлен 07.11.2013Первичная, вторичная и третичная структуры ДНК. Свойства генетического кода. История открытия нуклеиновых кислот, их биохимические и физико-химические свойства. Матричная, рибосомальная, транспортная РНК. Процесс репликации, транскрипции и трансляции.
реферат [4,1 M], добавлен 19.05.2015