Исследование реакции бактериальной люминесценции под воздействием электромагнитного излучения миллиметрового и инфракрасного диапазонов

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России

ГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет

Исследование реакции бактериальной люминесценции под воздействием электромагнитного излучения миллиметрового и инфракрасного диапазонов

Кузнецов Денис Бахтиерович, Одегова Татьяна Федоровна,

Несчисляев Валерий Александрович, Гейн Владимир Леонидович,

Лунегов Игорь Владимирович, Вольхин Игорь Львович

г. Пермь

Аннотация

Показано, что воздействие электромагнитным излучением миллиметрового и инфракрасного диапазонов вызывает как стимулирующий, так и ингибирующий эффект в отношении биолюминесценции штамма Escherichia coli lum⁺. Проведено сравнительное изучение различных режимов воздействия электромагнитного излучения на реакции бактериального свечения. Выявлена высокая чувствительность биосенсора к излучениям. Установлены варианты оптимальных режимов излучения для активации биолюминесценции тест-штамма.

Ключевые слова: биолюминесценция, СВЧ-излучение, ИК-излучение, многослойная адсорбция, вода.

В последнее время возрос интерес к исследованиям и практическому использованию различных видов электромагнитных излучений в химии и химической технологии, в частности, при проведении реакций гетерогенного катализа (см. обзор [1]) и модификации полимерных материалов [2].

Известно, что СВЧ-излучение оказывает влияние на ионные группировки и перераспределение воды между гидратными и ион-ионными формами [3].

Исследования воздействия СВЧ-излучения на живые организмы показали, что оно может применяться как средство дебактеризации пищевых продуктов [4, 5].

Работы, посвященные исследованиям нетеплового воздействия СВЧ- и ИК-излучениям на микроорганизмы [6-8], показали, что в основе молекулярного механизма влияния на клетки лежит активация многослойной адсорбции молекул воды на гидрофильной поверхности за счет смещения деформации электронной плотности молекул и изменения дипольного момента молекул.

При запуске процесса многослойной адсорбции происходит вытеснение ионов Н⁺ за пределы адсорбированных слоев в область с повышенной концентрацией Н⁺, таким образом, возникает градиент концентрации протонов (Дм_н⁺), являющийся одним из трех конвертируемых форм энергии [9].

Материалы и методы

Подготовка проб. Подготовка к проведению измерений включала регидратацию и приготовление рабочего разведения лиофилизированного индикаторного штамма люминесцентных бактерий (проба) E. coli lum⁺ с помощью воды очищенной имеющей рН 7.0±0.2 и охлажденной до температуры (6±2) °С. Затем разведенную индикаторную культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (22±2) °С.

Экспериментальные установки. В качестве объектов исследования выступали пробы, облучаемые инфракрасным излучением с длиной волны л = 850-890 нм и СВЧ-излучением миллиметрового диапазона с л = 8.14; 4.9 и 5.6 мм.

Схема экспериментальной установки для СВЧ-облучения проб с длиной волны л = 8.14 мм показана на рис. 1.

Рис. 1. Схема установки для облучения проб на л = 8.14 мм

Источником излучения служил генератор Г 4-156 на диоде Ганна 1, обеспечивающий генерацию плоскополяризованного излучения мощностью порядка 20 мВт в режиме непрерывной генерации. СВЧ-сигнал с выхода генератора через развязывающий ферритовый вентиль 2, аттенюатор 3, согласующий Е-Н трансформатор 4 поступал на рупорную СВЧ-антенну 5 с раскрывом прямоугольной формы 72Ч34 мм.

Линза 6 формировала пучок СВЧ-излучения (волна Н ₁₀) и направляла его на полимерную (полиэтиленовую) пробирку круглого сечения с пробой, установленную на пенопластовой подставке 7, прозрачной для данного излучения. Вектор напряженности электрического поля был ориентирован вертикально. Сечение СВЧ-пучка на уровне половинной мощности и пробирка с пробой представлены в левой части рис. 1.

Суммарные потери энергии: потери в антенно-волноводном тракте, рассеяние за пределами сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки составляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом поток мощности СВЧ-излучения, воздействовавший на исследуемую пробу, составлял порядка 0.4 мВт/см ². Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см, что с учетом применения СВЧ-линзы обеспечивало работу в дальней волновой зоне антенны.

На рис. 2а изображена схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с л = 5.6 мм и 4.9 мм. В качестве генератора 1 был использован аппарат МИЛТА-КВЧ НПО "Космического приборостроения" (Россия) с выходной мощностью 10 мВт. СВЧ-излучение (волна Н ₁₁) распространялось по волноводу круг-лого сечения 2 и в виде расходящейся волны облучало пробирку с пробой 3.

Рис. 2. Схема установки для облучения проб: а - СВЧ-излучением с л = 5.6 мм и 4,9 мм; б - ИК-излучением с л = 850-890 нм

Расстояние между раскрывом волновода и пробиркой было выбрано порядка 1 см, что с одной стороны обеспечивало работу в дальней зоне , где d - диаметр раскрыва волновода, для л = 5.6 мм d = 4.5 мм и R = 7.2 мм; для л = 4.9 мм d = 4.0 мм и R = 6.5 мм, с другой стороны пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое по нашим расчетам составляло порядка 1 см.

Вектор напряженности электрического поля был ориентирован горизонтально. Внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности волна Н ₁₁ по структуре близка к волне Н₁₀.

В качестве источника излучения ИК-диапазона использовался аппарат МИЛТА-Ф-8-01 НПО "Космического приборостроения" (Россия), включающий в себя ИК-лазер и ИК-светодиоды, работающие в диапазоне л = 850-890 нм.

Импульсная мощность излучения лазера составляла 21 Вт, а непрерывная мощность излучения светодиодов (4 шт) - 100 мВт. На рис. 2б представлена схема установка для облучения проб ИК-излучением, состоявшая из камеры 1 с размещенными в ней ИК-лазером 2 и светодиодами 3.

Пробирка с пробой размешалась внутри камеры 1 так, что дно прилегало к излучающей поверхности лазера и крепилась сверху на отражающей алюминиевой опоре 5.

Измерение биолюминисценции. Определение биолюминесценции под воздействием излучения в отношении энтеробактерий проводили с помощью экспресс-теста ингибирования биолюминесценции индикаторного штамма Escherichia coli lum⁺ [10]. Уровень гашения (стимуляции) свечения индикаторной культуры определяли с помощью люминометра Биотокс-10 ООО "НЕРА-С" (Россия) через фиксированные промежутки времени после облучения: 10 мин, 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч. Эффект воз-действия излучения выражали в виде цифрового показателя

И_АА=,

где х ₁ и х ₂ - интенсивности свечения индикаторного штамма без и после облучения соответственно [10]. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения MS Excel.

Результаты и их обсуждение

1. Эксперименты по воздействию СВЧ и лазерного ИК-излучения на биолюминисценцию тест-штамма

При проведении биолюминесцентного теста было выявлено несколько вариантов развития реакции ингибирования и/или стимулирования свечения индикаторного штамма E. coli lum⁺ после воздействия на него электромагнитного излучения (ЭМИ) (рис. 3-5).

Установлено, что СВЧ-излучение сразу повышает люминесценцию сенсора, особенно на л = 4.9 мм более 80% (рис. 3). При использовании лазерного ИК-излучения после кратко-срочного периода начального ингибирования (85% при 10 мин экспозиции (рис. 7), 17% на частоте лазера 0.6 и 5 кГц, 7% в режиме без модуляции при 5 мин экспозиции (рис. 6) и 9.5% при 2 мин, 0.6 кГц (рис. 5)) наступала фаза стимуляции свечения сенсора.

Рис. 3. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum⁺. Время экспозиции 60 мин.

При двухминутном облучении пробы немодулированным лазерным излучением наблюдались незначительные изменения в свечении относительно контрольного образца (рис. 5), аналогичная картина была и при облучении пробы в течение часа СВЧ-излучением на л = 8.14 мм (рис. 4).

При уменьшении времени экспозиции до 20 мин при облучении на л = 8.14 мм уровень биолюминисценции значительно увеличился через 5 часов.

При облучении образца в течение 10 мин модулированным лазерным излучением наблюдаются два максимума свечения, с величиной И_АА = -41 и -33.5 (рис. 7).

При экспозиции в течение 5 мин также наблюдаются два максимума И_АА = -40.5 и -27.3 (штрихпунктирная линия на рис. 6) без модуляции и И_АА = -7.6 и -41.2 на частоте модуляции лазера 0.6 кГц (сплошная линия на рис. 6) и И_АА = -15.6 и -33.5 на 5 кГц (пунктирная линия на рис. 6).

Рис. 4. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum⁺. Время экспозиции 60 мин, длина волны 8.14 мм.

Рис. 5. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum⁺. Время экспозиции 2 мин.

Рис. 6. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum⁺. Время экспозиции 5 мин.

Рис. 7. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum⁺. Время экспозиции 10 мин.

При 2-х минутной экспозиции с частотой модуляции лазерного излучения 5 кГц наблюдается один максимум И_АА = -64.(пунктирная линия на рис. 5).

В опыте с СВЧ-излучением на л = 4.9 мм уровень свечения в течение первых 3-х часов монотонно снижался до И_АА = -33, а затем оставался постоянным.

На л = 5.6 мм в течение первых 2-х частов наблюдалось незначительное снижение И_АА, которое затем монотонно повышалось до И_АА = -55, спустя 24 ч после экспозиции (рис. 3).

Влияние ИК- и СВЧ-излучения на штамм E. coli lum⁺ на протяжении первых часов экс-позиции было различным - после воздействия ИК-излучением наблюдалось вначале ингибирование или соответствие И_АА контрольного образца, а при воздействии СВЧ-излучением имела место стимуляция свечения. Было показано, что после 24 ч пробы, обработанные ИК-излучением сохраняли стимуляцию свечения, аналогичное явление наблюдалось и после воздействия СВЧ-излучения с л = 4.9 и 5.6 мм (рис. 3).

СВЧ-излучение с л = 8.14 мм с временем экспозиции 60 мин, приводило к спаду интенсивности свечения до уровня контрольного образца (рис. 4). электромагнитный излучение бактериальный биолюминесценция

2. Обсуждение воздействия модуляции лазерного ИК-излучения на биолюминисценцию тест-штамма

Согласно полученным данным по влиянию лазерного ИК-излучения с различной часто-той модуляции совместно с некогерентным ИК-излучением светодиодов на уровень биолюминесценции можно констатировать, что молекулы-акцепторы пробы имеют порог насыщения, после которого наступает точка бифуркации.

Различные порции энергии, сообщаемые молекулам-акцепторам, в зависимости от частоты модуляции, приводят к различным эффектам.

Причем, чем меньше время облучения, тем больше должна быть частота модуляции, чтобы добиться стимуляции люминесценции и наоборот, чем больше время экспозиции, тем частота модуляции должна быть меньше (рис. 5-7).

Взаимодействие системы с внешним излучением ИК-диапазона (взаимодействие эндо-генных и экзогенных флуктуаций), ее погружение в неравновесные условия может стать исходным пунктом в формировании новых динамических состояний - диссипативных структур.

Диссипативная структура отвечает форме супермолекулярной организации, возникающей в результате коллективных взаимодействий элементов системы (молекул).

При заданных граничных условиях в сильно нелинейной системе могут существовать не одно, а несколько стационарных состояний. Переход из одного состояния в другое играет важную роль в механизмах управления, встречающихся в биологических системах.

Нативные среды представляют собой молекулы воды в граничных условиях нелинейной сильно неравновесной системы и могут находиться в нескольких состояниях (стабильных и метастабильных), крайние из которых можно условно обозначить: НОН_n (некогерентное) и НОН*_n (когерентное).

При этом условие неравновесности состояний является источником организации материи [11].

В проведенных экспериментах с люминесцентным тест-штаммом диссипативными структурами выступали адсорбированные слои воды на гидрофильной поверхности как б-спирали люциферазы и других гидрофильных поверхностей.

3. Обсуждение воздействия ЭМИ с различной длиной волны в миллиметровом СВЧ-диапазоне на люминесценцию

Анализ динамики биолюминесценции тест-штамма после различных влияний ЭМИ позволяет сделать вывод о его значительном адаптационном потенциале и о специфичности раз-вития реакции стимуляции, обусловленной временем, длиной волны и режимами излучения.

Сопоставляя полученные результаты, следует отметить наибольшую чувствительность тест-штамма к СВЧ-излучению на л = 4.9 и 5.6 мм с экспозицией 60 мин и ИК-излучению с 2-х минутной экспозицией при частоте модуляции лазерного излучения 5 кГц и 5-ти минут-ной в режиме непрерывной генерации.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что воздействие СВЧ- и ИК-излучения на биолюминисценцию связано с избирательным поглощением электромагнитного излучения. Низкоэнергетические внешние воздействия существенно влияют на биохимические процессы, включая весь энергетический обмен микроорганизмов в целом.

При этом происходят молекулярные структурные перестройки, связанные с перераспределением электронной плотности молекул-акцепторов, сопровождающиеся каскадными реакциями с накоплением ионов Н⁺ в "кислотных резервуарах" путем вытеснения из адсорбированных слоев молекул воды на гидрофильных поверхностях. На рис. 8 показано как под воздействием квантов ЭМИ hн₁ на б-спирали белковых молекул происходит усиленная адсорбция молекул воды (выноска в увеличенном масштабе). В результате образуются многослойные надмолекулярные комплексы, при этом происходит диссоциация части молекул воды, сопровождающаяся вытеснением протонов с образованием градиента их концентрации Дм_н⁺. Энергия ЭМИ переходит в энергию диполь-дипольного взаимодействия и накапливается в адсорбированных слоях воды и в градиенте Дм_н⁺. Вытесненные протоны восстанавливают FMN (структурная формула приведена в правом верхнем углу рис. 8) до FMNH₂. Затем FMNH₂ отдает протон и два электрона через переносчик люмиредоксин, восстанавливая цитохром Р-450 (на рисунке не показаны). При этом выделяющаяся избыточная энергия уносится квантами светового излучения hн₂.

Рис. 8. Механизм воздействия ЭМИ на биолюминесценцию

Предложенный механизм объясняет длительное сохранение эффекта воздействия ЭМИ на реакцию люминесценции. Однако данное предположение требует дополнительной проверки.

Заключение

Полученные в настоящем исследовании результаты согласуются с результатами других авторов и свидетельствуют о целесообразности исследований по использованию СВЧ- и ИК-излучений при проведении технологических процессов на биофармацевтическом производстве.

Выводы:

1. Миллиметровое (4.9; 5.6; 8.14 мм) и лазерное инфракрасное (л = 850-890 нм) нетепловые излучения оказывают выраженный стимулирующий эффект на люминесценцию сенсора - индикаторного штамма E. coli lum⁺ . Влияние данных электро-магнитных излучений носит пролонгированный характер.

2. Время облучения (2, 5 и 10 мин) ИК-излучением и частота импульсного режима лазерного излучения (режим непрерывной генерации, и модуляции с частотой 0.6 кГц, 5 кГц) раз-лично влияют на биолюминесценцию тест-штамма - E. coli lum⁺.

3. В первый час после облучения тест-штамма - E. coli lum⁺ лазерным ИК-излучением (л = 850-890 нм) на 5 и 10 мин экспозиции наблюдается ингибирование люминесценции, которое постепенно переходит в стимуляцию.

4. Для увеличения стимуляции люминесценции тест-штамма - E. coli lum⁺ лазерным ИК-излучением (л = 850-890 нм) при меньшем (чем 5 мин) времени экспозиции требуется большая частота лазерной модуляции, и наоборот, чем больше времени экспозиции, тем меньше нужна частота его модуляции.

Литература

1. Абакачева Е.М., Сулейманов Д.Ф., Шулаев Н.С. Исследование физико-механических свойств полимерных материалов, модифицированных в электромагнитном поле СВЧ-диапазона. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.24. №1. С.95-98.

2. Бикбулатов И.Х., Даминев Р.Р., Шулаев Н.С., Шулаева Е.А. Применение электромагнитного излучения СВЧ диапазона в химической технологии. Бутлеровские сообщения. 2009. Т.18. №8. С.1-28.

3. Кузнецов Д.Б. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы. Фундаментальные исследования. 2013. №4. Ч.2. C.414-418.

4. Кузнецов Д.Б. Перспективы применения электромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации. Фундаментальные исследования. 2012. №10. Ч.2. С.400-404.

5. Кузнецов Д.Б. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы. Современные проблемы науки и образования. 2013. №1; URL: http://www.science-education.ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013).

6. Несчисляев В.А., Пшеничнов Р.А., Арчакова Е.Г., Чистохина Л.П., Фадеева И.В. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Патент на изобретение № 2187801 от 20.08.2002 г. Заявка № 2000118391. Приоритет № 2000118391/14 от 10.07.00 г. Бюл. № 23.

7. Пригожин И. Стенгерс И. "Порядок из хаоса" Новый диалог человека с природой. Перевод с английского Данилова Ю.А. под редакцией Аршинова В.И. М.: Прогресс. 1986. 432с.

8. Путько В.Ф., Головина К.В., Пурыгин В.А., Васильева Т.И., Советкин Д.А., Пурыгин П.П. Исследование воздействия СВЧ электромагнитного поля на микрофлору и насекомых какао-порошка. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. С.79-82.

9. Путько В.Ф., Головина К.В., Пурыгин В.А., Васильева Т.И., Советкин Д.А., Пурыгин П.П. Физические способы дебактеризации какао-бобов и какао-порошка. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. С.83-85.

10. Романовский Ю М, Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии живой клетки. Протонная АТФ-синтаза - вращающийся молекулярный мотор УФН 180. 2010. С.931-956.

11. Филимонова З.А., Лященко А.К. Сравнение диэлектрических характеристик водных и водно-формамидных растворов нитратов калия и натрия в диапазоне СВЧ. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.27. №14. С.74-80.

Размещено на Allbest.ru