Общая микробиология

Размещено на http://www.allbest.ru/

Раздел 1. Общая микробиология

1. Медицинская микробиология. Предмет, методы, задачи

Медицинская микробиология изучает патогенные и условно-патогенные для человека микроорганизмы, разрабатывает методы диагностики, профилактики и лечения вызываемых ими инфекционных заболеваний.

Предметом изучения микробиологии являются бактерии, плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, риккетсии, микоплазмы, вирусы.

Задачи-- изучение структуры и свойств патогенных микробов, взаимоотношения их с организмом человека, совершенствование методов диагностики, разработка новых, лечебных и профилактических препаратов, ликвидация и предупреждение инфекционных болезней.

К основным методам микробиологии относятся:

* микроскопический (бактериоскопический)

* бактериологический (культуральный)

* серологический

* биологический

* молекулярно-биологический

2. Начальный период развития микробиологии (А. Левенгук)

Мир микробов открыл Антоний Ван Левенгук. Его увлечением было изготовление линз, которые он называл микроскопиями. Левенгук увидел и описал все формы микробов: кокки, палочковидные и извитые.

В дальнейшем благодаря развитию микроскопической техники во второй половине XIX века и работам французского химика Луи Пастера (1822-1895) по изучению процессов брожения мир микроскопических существ вновь начинает привлекать к себе внимание исследователей.

3. Работы Л. Пастера и Р. Коха. Их значение в становлении и развитии микробиологии

Луи Пастер - французский ученый-химик; основоположник микробиологии, иммунологии, биотехнологии; изучал различные виды брожения, доказал существование анаэробных организмов. Роберт Кох. Им были введены в практику плотные питательные среды для выращивания микробов; Ввел окраску анилиновыми красителями. Изучал возбудителей сибирской язвы, туберкулеза, холеры и др. заразных болезней; В 1905 - нобелевская премия за открытие и выделение возбудителя туберкулеза. Пауль Эрлих. Ввел в практику лечение четырехдневной малярии красителем метиленовым синим, разработал метод определения активности антитоксических сывороток и изучения взаимодействия антиген-антитело in vitro.. За создание теории гуморального иммунитета был удостоен Нобелевской премии в 1908 г.

И.И. Мечников - возникновение современной иммунологии. За открытие фагоцитарной теории иммунитета в 1908 г. И.И. Мечникову была присуждена Нобелевская премия. Нашему отечественному ученому Д.И. Ивановскому принадлежит честь открытия вирусов.

4. Основные принципы систематики бактерий. Таксономические категории. Критерии вида

Систематика включает три части: классификацию, таксономию и идентификацию. В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства. Различают следующие таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны -- группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам.

Наибольшую известность получила фенотипическая классификация бактерий, основанная на строении их клеточной стенки.

Крупнейшими таксономическими группами в ней стали 4 отдела: Gracilicutes (грамотрицательные), Firmicutes (грамположительные), Tenericutes (микоплазмы; отдел с единственным классом Mollicutes) и Mendosicutes (археи).

Согласно современной систематике, патогенные (болезнетворные) бактерии относятся к надцарству прокариотов (Procaryotae), царству эукариот (Eucaryotae), грибы -- к царству микота (Mycota), простейшие -- к царству Protozoa, вирусы -- к царству Vira.

Вид -- совокупность микроорганизмов, имеющих общий корень происхождения и максимально близкие фенотипические признаки и свойства. (Вид -- эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих единый тип организации, который в стандартных условиях проявляется сходными фенотипическими признаками: морфологическими, физиологическими, биохимическими и др.)

5. Морфология бактерий. Основные формы, постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки

Термин	Определение
1	2
Прокариоты	Одноклеточные организмы, которые имеют двухнитевую кольцевую ДНК, не имеют сформированного ядра, типичных клеточных структур, митоза.
Кокки	Бактерии шарообразной формы
Палочковидные бактерии	Бактерии цилиндрической формы
Извитые бактерии	Бактерии изогнутой формы с одним или несколькими завитками.
Постоянные структурные элементы бактериальных клеток
Нуклеоид	Аналог ядра у бактерий, двойная кольцевая нить ДНК
Цитоплазма	Зернистая коллоидная система, которая содержит разные органеллы, органические и неорганические соединения; в ней протекают процессы метаболизма
Цитоплазматическая мембрана	Ограничивает цитоплазму, имеет сложное химическое строение, играет активную роль в процессах метаболизма
Мезосомы	Аналог митохондрий, производное от цитоплазматической мембраны, принимает участие в энергетическом метаболизме и делении клеток.
Клеточная стенка	Биогетерополимер со сложным химическим составом; внешняя оболочка бактерий.
Рибосомы	Белоксинтезирующие системы
Непостоянные структурные элементы бактериальной клетки
Капсулы	Защитный слизистый слой, который покрывает клеточную стенку
Споры	Форма существования бактерий в неблагоприятных условиях для сохранения генетической информации
Жгутики	Поверхностные структуры у некоторых палочковидных бактерий в виде тонких нитей, обеспечивают активную подвижность.
Пили (фимбрии, реснички)	Тонкие полые короткие нити, покрывающие поверхность бактериальных клеток, обусловливают их адгезию
Секс-пили	Принимают участие в конъюгации бактерий
Включения	Запасные питательные вещества (волютин, гликоген и др.)

6. Основные характеристики светового микроскопа (разрешающая способность, общее увеличение). Принцип иммерсионного микроскопа

При работе с иммерсионными объективами (х90 или х100) для устранения светорассеяния расстояние между фронтальной линзой объектива и препаратом заполняют иммерсионным (кедровым) маслом, показатель преломления лучей света которого близок к показателю преломления лучей света, проходящего через стекло.

Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, если в работе используют окуляр х15, а под тубусом находится объектив х90, то увеличение рассматриваемого с помощью микроскопа объекта составит х1350.

Конденсор служит для лучшего освещения препарата. Он собирает световые лучи в пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат. Ирис-диафрагма располагается под конденсором и служит для регулировки потока света, поступающего в конденсор. При работе с иммерсионными объективами степень освещения препарата должна быть максимальной, поэтому шторку ирис-диафрагмы открывают, а конденсор поднимают в крайнее верхнее положение.

Общее увеличение не характеризует качества изображения, которое может быть четким и нечетким.

Четкость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. той наименьшей величиной объектов или их деталей, которые можно увидеть с помощью этого прибора.

Повысить разрешающую способность микроскопа можно путем:

- снижения длины волны света, проходящего через объект;

- использования иммерсионной системы;

- повышения апертурного угла до предельного (до 900).

7. Особенности фазово-контрастной и темнопольной микроскопии

Микроскопия в темном поле

При микроскопии этим методом используют специальный конденсор темного поля, центр которого затемнен. Поэтому центральный пучок световых лучей не попадает в объектив и поле зрения микроскопа остается темным. Объект освещается только лучами, попадающими на него под углом. Объект становится видимым как светящаяся точка на темном фоне. Метод темного поля позволяет получить представление о внешней форме живых неокрашенных объектов и их движении. Микроскопия в темном поле позволяет увеличить разрешающую способность объектива примерно в 10 раз и рассматривать объекты, размеры которых находятся за пределами обычного микроскопа.

Фазово-контрастная микроскопия

Дает возможность изучать живые объекты без окраски и фиксирования. В биологических препаратах чередуются места, которые в разной степени поглощают свет. Проходя через них, световые волны изменяют свою амплитуду. Такие участки объекта называют амплитудными, и под микроскопом они выглядят более темными. Прозрачные в видимом свете структурные элементы объектов пропускают лучи одинаковой длины и амплитуды, но смещают их фазу. Величина смещения зависит от толщины и показателя преломления структур, но видимых изменений практически не дает. Такие препараты являются неконтрастными.

С помощью фазово-контрастного устройства фазовые изменения световых волн, проходящих через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, благодаря чему детали рассматриваемых объектов становятся видимыми и контрастными.

Фазово-контрастное устройство дает возможность изучать структуры клеток: жгутики и оболочки бактерий, ядра и митохондрии дрожжей и грибов.

8. Основные характеристики электронного микроскопа. Особенности люминесцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия позволяет изучать клетки в живом виде, выявлять мембранные структуры и получать высококонтрастные цветные изображения микроорганизмов. Сущность явления люминесценции заключается в том, что некоторые молекулы структурных элементов клетки (пигменты, витамины, алкалоиды и др.) способны поглощать часть энергии падающего света определенной длины волны, переходить в электронно-возбужденное состояние и испускать свет с другой длиной волны. Источником возбуждения могут быть ультрафиолетовые лучи (300-400 нм) и видимый свет коротковолновой области спектра (400-460 нм).

Клетки микроорганизмов обладают слабой собственной (первичной) люминесценцией. Ее можно усилить предварительным окрашиванием препаратов нетоксическими красителями - флуорохромами (акридин оранжевый, нейтральный красный, аурамин, флуоресцин и др.). В результате возникает вторичная люминесценция. Для ее возбуждения достаточно использовать сине-фиолетовую часть спектра. В результате возникает высококонтрастное цветное изображение рассматриваемого объекта.

Электронная микроскопия

Максимальная разрешающая способность оптических микроскопов составляет около 0,2 мкм и зависит от длины волны используемых лучей света. Увеличить разрешение в 100 и более раз можно, если вместо световых или ультрафиолетовых лучей применять поток движущихся электронов, обладающих волновыми свойствами (длина волны около 0,04 нм).

Поток электронов движется в безвоздушном пространстве от источника электронов (раскаленная нить вольфрамовой пушки) по направлению к флуоресцентному экрану и вызывает равномерное свечение его. Если же на пути электронов поместить какой-либо объект, то в зависимости от его плотности электроны будут больше или меньше задерживаться, а соответствующие места на экране окажутся более или менее затемненными. Этот простой принцип работы современного электронного микроскопа дополнен принципом отклонения электронных лучей в магнитном поле подобно тому, как световые лучи отклоняются увеличивающими стеклянными линзами. При этом используются электромагнитные линзы.

9. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий. Протопласты, сферопласты и L-формы бактерий

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше (14--18 нм) и состоит из двух слоев. Первый - представлен одним или двумя рядами пептидотликана. В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты. Второй слой - бислой фосфолипидов, пронизанный транспортными белками, в нем крепиться липополисахарид (ЛПС).

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генциановый фиолетовый в комплексе с йодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем. Кроме этого, последующая обработка мазка бактерий спиртом вызывает суживание пор в пептидогликане и тем самым задерживает краситель в клеточной стенке. Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, что обусловлено меньшим количеством пептидогликана (5--10 % массы клеточной стенки); они обесцвечиваются спиртом и при обработке фуксином приобретают красный цвет.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма и других соединений образуются клетки с измененной формой: протопласты -- бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты -- бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. После удаления ингибитора клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, т. е. приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму

L-трансформация бактерий

Бактерии сферо- и протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием АБ или других факторов и способные размножаться, называются L- формами. Поскольку этот феномен был обнаружен в институте имени Листера, то таким необычным вариантам бактерий дали название L-форм, такую изменчивость бактерий назвали L-трансформацией. Она может быть обратимой и необратимой.

L-трансформации могут подвергаться, по-видимому, все бактерии, имеющие клеточную стенку, а все образующиеся L-формы, независимо от вида бактерий, из которого они возникли, обладают следующими общими для них особенностями:

1.Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.

2.Сходные культуральные свойства: анаэробные или микроаэрофильные условия роста, потребность в холестерине и сывороточном белке, рост на плотных средах в виде характерных колоний двух типов-- А и В. Колонии типа А растут на поверхности агара, имеют очень мелкие размеры. Они состоят главным образом из гранулярных структур, лишенных клеточной стенки, и очень похожи на микоплазмы. Колонии типа В состоят из центральной зоны, врастающей в агар, и прозрачной фестончатой периферии. Они похожи по внешнему виду на колонии типа глазуньи, образуемые микоплазмами, но более крупные и грубые.

3.Постепенное (по мере нарушения синтеза клеточной стенки) превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры.

4.Образование стабильных и нестабильных L-форм (в зависимости от степени полноты утраты способности синтезировать клеточную стенку).

5.Изменение антигенных свойств (утрата К- и 0-антигенов как следствие нарушения синтеза клеточной стенки).

6.Снижение вирулентности по сравнению с исходными родительскими формами в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии, эндотоксина и т. п.).

7.Способность длительно персистировать (переживать) в организме. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к различным химиопрепаратам и антителам.

8.Способность при неполной утрате синтеза клеточной стенки возвращаться в исходную бактериальную форму.

Исключительное начение L-трансформации патогенных бактерий заключается в том, что она является частой причиной перехода острых форм заболеваний в хронические и их обострений.

10. Актиномицеты

Актиномицеты обладают некоторыми признаками, общими как с бактериями, так и с грибами. Как бактерии они содержат ядро типа нуклеоида, состоят из одной клетки, покрытой оболочкой, грамположительны. В то же время они имеют форму ветвящейся нити, которая характерна для нитевидных грибов. Нити актиномицетов, переплетаясь, как и грибы, образуют видимый глазом мицелий. Часть актиномицетов (стрептомицеты) размножается спорами, поэтому они занимают как бы промежуточное положение между бактериями и грибами. По классификации Берджи актиномицеты выделены в самостоятельную группу 17, порядок Actinomycetales, в который входят три семейства.

Семейство Actinomycetaceae. Нитевидные клетки актиномицетов часто распадаются на отдельные фрагменты, напоминающие бациллы. Размножаются они путем фрагментации нитей, спор не образуют. Большинство актиномицетов -- сапрофиты, живущие за счет разложения органических веществ в почве. Нокардии могут вызывать сходные с туберкулезом заболевания человека и животных -- нокардиозы, а актиномицеты -- актиномикозы.

Семейство Streptomycetaceae. Имеют наибольшее сходство с грибами. Образуют длинный разветвленный воздушный мицелий, состоящий из тонких нефрагментированных нитей. Представители стрептомицетов являются продуцентами антибиотика стрептомицина. Некоторые из них вызывают заболевания животных и сельскохозяйственных растений.

Семейство Mycobacterium. В патологии человека наиболее важную роль играют микроорганизмы рода Mycobacterium. Микобактерии могут образовывать слабоветвящийся короткий мицелий, склонный к распаду на отдельные фрагменты. Чаще микобактерии имеют вид палочек, поэтому их относят к истинным бактериям. Размножаются они поперечным делением. Среди микобактерий имеются возбудители очень тяжелых заболеваний человека: туберкулеза и лепры (проказа).

Культуральные свойства

Облигатные и факультативные анаэробы. Растут медленно, посевы следует культивировать 7 суток. Температурный оптимум роста 37С.

Биохимическая активность

Хемоорганотрофы. Ферментируют углеводы с образованием кислоты без газа, продукты ферментации -- уксусная, муравьиная, молочная и янтарная кислоты. Наличие каталазы и способность восстанавливать нитраты в нитриты, индол не образуют.

Чувствительность к антимикробным препаратам

Чувствительны к пенициллинам, тетрациклину, эритромицину, но резистентны к антимикотикам.

Актиномикоз -- хроническая оппортунистическая инфекция человека и животных, вызываемая анаэробными и факультативно-анаэробными актиномицетами, которая характеризуется гранулематозным воспалением.

Микробиологическая диагностика

Материал для исследования - мокрота, ликвор, гной из свищей, биопсия тканей. Для диагностики используют бактериоскопический, бактериологический, серологический и аллергологический методы.

11. Спирохеты

Спирохеты - тонкие спирально извитые нити, изогнутые вокруг центральной оси, которая, является пучком слившихся фибрилл. Они относятся к порядку Spirochaetales. Они отличаются друг от друга характером и числом завитков, длиной клеток, а также другими морфологическими и физиологическими признаками.

Патогенные виды относятся к трем родам: Treponema, Borrelia, Leptospira.

Спирохеты, особенно трепонемы, в отличие от других бактерий плохо воспринимают анилиновые красители. Их, так же как простейших, окрашивают краской Романовского - Гимзы. Все спирохеты - грамотрицательные микроорганизмы.

Treponema 8-12 завитков, мелкие, равномерные Плавное, сгибательно-поступательное Бледно-розовый

Borellia 3-10, крупные, неравномерные Толчкообразное, сгибательно-поступательноеФиолетовый

Leptospira Многочисленные первичные, вторичные завитки в виде буквы S Очень активное, вращательно-поступательное Розово-синий

12. Риккетсии

Занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. С бактериями они сходны по морфологии. Внутриклеточное размножение и паразитизм на энергетическом уровне сближают их с вирусами. Жгутиков и капсул нет. По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и не обнаруживаются в оптическом микроскопе.

В инфекционной патологии основное значение имеют риккетсии группы сыпного тифа (R.prowazekii -- возбудитель сыпного тифа и R.typhi -- возбудитель крысиного сыпного тифа) и группы клещевых пятнистых лихорадок (КПЛ) -- R.rickettsii -- возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор (в Америке), R.conorii -- возбудитель марсельской лихорадки (преимущественно в Средиземноморском регионе, а также в бассейнах Черного и Каспийского морей), R.sibirica -- возбудитель клещевого риккетсиоза или клещевого сыпного тифа (Северная и Центральная Азия, включая регионы юга Сибири и Дальнего Востока), R.akari -- возбудитель осповидного (везикулезного) риккетсиоза, R.australis -- возбудитель австралийского риккетсиоза, R.japonica -- возбудитель японской клещевой пятнистой лихорадки.

13. Хламидии

Мелкие грамотрицательные, неподвижные, облигатно паразитические бактерии, ретикулярные тельца (РТ) которых могут быть разнообразной формы - овальной, полулунной, в виде биполярных палочек и коккобацилл и имеют размер от 300 до 1000 нм, а элементарные тельца (ЭТ) овальной формы могут иметь размер в диаметре 250 - 500 нм. ЭТ хламидий обладают инфекционными свойствами, антигеноактивны, способны проникать в чувствительную клетку, где и происходит уникальный цикл развития хламидий. Предшествующие ЭТ хламидий более крупные РТ не имеют постоянного размера и структуры. Патогенным видом является Chlamidia trachomatis - возбудитель антропонозных хламидиных инфекций, первично поражающих слизистые оболочки (трахома, урогенитальный хламидиоз, венерическая лимфогранулема); - это один из самых распространенных и и наиболее актуальных возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем.

14. Микоплазмы

М. - прокариоты малых размеров, Имеют только ЦПМ, покрыты снаружи капсулоподобным слоем. Неподвижны, не образуют спор и не способны синтезировать пептидогликан. Это полиморфные МО, по форме представляют собой сферические или грушевидные структуры. Клетки М., в отличие от других прокариот, не имеют клеточной стенки. Морфологию М. изучают в фазово-контрастном микроскопе. По Гр окрашиваются медленно, Гр-.

Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum ответственны за развитие патологий респираторного и урогенитального трактов, иммунной, эндокринной и нервной систем, а также опорно-двигательного аппарата. Кроме того, mycoplasma genitalium -- паразитическая бактерия, которая живёт в половых и дыхательных системах приматов. Mycoplasma genitalium была впервые выделена из образца отделяемого уретры пациентов с негонококковым уретритом. Она может быть найдена в реснитчатых клетках эпителия мочеполового и дыхательного трактов.

15. Простейшие

Простейшие -- эукариотические одноклеточные микроорганизмы, составляющие подцарство Protozoa царства животных (Animalia). Простейшие включают 7 типов, из которых четыре типа (Sarcomastigophora, Apicomplexa, Ciliophora, Microspora) имеют представителей, вызывающих заболевания у человека. Размеры простейших колеблются в среднем от 5 до 30 мкм.

Снаружи простейшие окружены мембраной (пелликулой) -- аналогом цитоплазматической мембраны клеток животных. Некоторые простейшие имеют опорные фибриллы.

Цитоплазма и ядро соответствуют по строению эукариотическим клеткам: цитоплазма состоит из эндоплазматического ретикулума, митохондрий, лизосом, многочисленных рибосом и др.;

Передвигаются простейшие посредством жгутиков, ресничек и путем образования псевдоподий.

Простейшие могут питаться в результате фагоцитоза или образования особых структур. Многие простейшие при неблагоприятных условиях образуют цисты -- покоящиеся стадии, устойчивые к изменению температуры, влажности и др.

Простейшие окрашиваются по Романовскому--Гимзе (ядро -- красного, цитоплазма -- синего цвета).

Идентификация патогенных простейших основана на морфологических свойствах возбудителя. Большее значение при этом имеет правильное взятие клинического материала и фиксация препарата. Цисты выявляют при окраске раствором Люголя. При исследовании крови готовят толстые мазки из больших объемов крови, а для облегчения морфологической дифференцировки готовят тонкие мазки.

Класс I - Flagellata(жгутиковые). Патогенные представители: трихомонады, поражающие мочеполовые органы человек, лямблии (гиардии), поражающие кишечник, лейшмании- возбудители кожных и висцеральных природно-очаговых лейшманиозов, трипаносомы- возбудители африканской сонной болезни. Класс II - Sporozoa(споровики). Род Plasmodium.

Для человека патогенны четыре вида, вызывающие малярию. Plasmodium vivax- возбудитель трехдневной малярии, Р.malariae-возбудитель четырехдневной малярии, Р.falciparum- возбудитель тропической малярии, Р.ovale- возбудитель малярии овале (трехдневной). Класс III - Sarcodina (саркодовые). Патогенные для человека виды включены в тип Sarcomastigophora подтип Sarcodina класс Lobosea отряд Amoebia. Единственный патогенный для человека вид - Entamoeba histolytica, вызывает амебную дизентерию (амебиаз) - заболевание, напоминающее дизентерию, с частым жидким стулом, иногда с примесью слизи и крови, болями в животе, тенезмами, лихорадкой. Класс IV - Infusoria(инфузории).

Патогенным представителем являются Balantidium coli - возбудитель балантидиаза. Для заболевания характерны диарея с изъявлениями толстой кишки.

16. Питание бактерий. Механизмы транспорта питательных веществ в бактериальную клетку

Поступление в бактериальную клетку питательных веществ представляет собой сложный физико-химический процесс, которому способствует ряд факторов: разница в концентрации веществ, величина молекул, их растворимость в воде или липидах, рН среды, проницаемость клеточных мембран и т. д. В проникновении питательных веществ в клетку различают четыре возможных механизма.

1. Наиболее простой способ -- пассивная диффузия, при которой поступление вещества в клетку происходит из-за различия градиента концентрации (разницы концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны).

2. Одним из таких механизмов является облегченная диффузия-- процесс специфический и осуществляется особыми мембранными белками, переносчиками, получившими название п е р м е а з. Они связывают молекулу вещества, переносят в неизмененном виде к внутренней поверхности цитоплазматической мембраны и высвобождают в цитоплазму.

3. Третий возможный механизм транспорта веществ поучил название активного переноса. В активном переносе веществ участвуют пермеазы. Поскольку концентрация вещества в клетке может в несколько тысяч раз превышать ее во внешней среде, активный перенос обязательно сопровождается затратой энергии.

4. при четвертом возможном механизме переноса питательных веществ наблюдается транслокация радикалов -- активный перенос химически измененных молекул, которые в целом виде не способны проходить через мембрану. В переносе радикалов участвуют пермеазы.

17. Классификация бактерий по типам питания и источникам энергии

По усвоению углерода бактерии можно разделить на два типа:

1. аутотрофы (литотрофы)

2. гетеротрофы. (органотрофы)

Аутотрофы (от autos -- сам, trophe -- пища) способны получать углерод из неорганических соединений и даже из углекислоты. Энергию, необходимую для синтеза органических веществ, аутотрофы получают при окислении минеральных соединений. К аутотрофным бактериям относятся нитрифицирующие (находящиеся в почве), серобактерии (живущие в теплых источниках с содержанием сероводорода), железобактерии (размножающиеся в воде с закисным железом) и др.

Гетеротрофы (от heteros-- другой, trophe -- пища) используют в качестве источника углерода органические соединения. Универсальным источником углерода служат различные углеводы (их часто добавляют в питательные среды), белки и др. Гетеротрофы играют значительную роль в уничтожении различных мертвых органических остатков. Такие бактерии называются сапрофитами (от sapros -- гнилой, phyton -- растение). Микробы, способные существовать за счет органических соединений организма животных и в клетках растений, получили название паразитических (parasitos -- нахлебник). Среди патогенных микроорганизмов выделяют так называемые облигатные паразиты, которые способны жить только в живых клетках или тканях. К таким микробам относятся риккетсии, вирусы и некоторые простейшие.

По источникам энергии различают

1. фототрофы -- бактерии, для которых источником энергии является солнечный свет,

2. хемотрофы -- бактерии, которые получают энергию за счет химического окисления веществ.

18. Факторы роста. Аутотрофы и прототрофы

При составлении питательных сред необходимо добавлять вещества, получившие название факторов роста. Это различные витамины, аминокислоты (без которых невозможен синтез белка), пиридиновые и пиримидиновые основания (предшественники нуклеиновых кислот) и др.

Микроорганизмы, нуждающиеся в каком-то одном или нескольких факторах роста, называются ауксотрофными в отличие от прототрофных бактерий, которые в данных соединениях не нуждаются и способны сами их синтезировать.

Классификация факторов стимулирующих рост бактерий Факторы, стимулирующие рост бактерий, разделяют на три категории.

Вещества, присутствие которых обязательно для роста бактерий. Это может быть определённая аминокислота, например гистидин, для штамма Salmonella thyphimurium - (гистидин-отрицательный), ауксотрофного по гистидину, либо набор витаминов (лактофлавин, тиамин, биотин, фолиеван и пантотеновая кислота).

Факторы, отсутствие которых не вызывает полной остановки роста культуры. Обычно это определённые витамины, входящие в состав простетических групп ферментов и необходимые в очень малых количествах.
Факторы, синтезируемые самими микроорганизмами и добавление которых в среду ускоряет рост, но это условие не обязательно (например, в синтетическую среду культивирования Escherichia coli можно добавить дрожжевой автолизат для интенсификации роста, но и на простой минеральной среде с глюкозой бактерия будет расти).

Пусковые факторы роста выделяют в особую категорию. Они имеют существенное значение для начала роста культуры. Позднее клетки культуры синтезируют все необходимые для их роста продукты самостоятельно. В качестве примера можно привести необходимость следовых количеств гистидина для роста ревертантов Salmonella his- и их обратной мутации в his+ (гистидинположительный).

Витамины как факторы роста. Никотиновая кислота или ее амид является фактором роста для многих микроорганизмов -- дифтерийной палочки, золотистого стафилококка, дизентерийных бактерий и др. Она входит в состав коферментов никотин амиддинуклеотида и никотин ампддинуклеотидфосфата, которые являются переносчиками водорода и необходимы для осуществления в клетках окислительно восстановительных реакций. Гемин -- составная часть гемоглобина представляет собой железопорфирин. Он входит в структуру некоторых дыхательных ферментов (цитохром, цитохромоксидаза, каталаза, иероксидаза). Пантотеновая кислота -- фактор роста и размножения для многих бактерий пропионовокислых, стрептококков, пневмококков, дифтерийной палочки и др. Она действует на рост некоторых бактерий при концентрации порядка 0,0002 мкг в 1 мл среды. Пантотеновая кислота участвует в синтезе коэнзима А, который играет важную роль в ходе клеточных реакций с участием уксусной кислоты (ацетилирование), в частности в образовании жирных кислот, фосфолипидов, холина и пр. Тиамин представляет собой сложное соединение, в которое входят пиримидин и тиазол. Биологическое значение тиамина определяется тем, что он входит в состав тиаминниро фосфата -- кофермента кокарбоксилазы, играющего важную роль в углеводном обмене и обеспечивающего декарбоксилирование а кетокислот. Рибофлавин (витамин Вг) как фактор роста необходим для некоторых молочнокислых бактерий, столбнячной палочки (CI. tetani), возбудителя газовой гангрены (CI. perfringens), гемолитического стрептококка (Str. haemolyticus) и др.

Биологическое значение рибофлавина как фактора роста обусловливается его участием в окислительно восстановительных процессах. Пиридоксин и его производные пиридоксаль и пиридоксамин играют важную роль в обмене и декарбоксилирования аминокислот.

19. Ферменты бактерий

У бактерий по характеру вызываемых ими превращений обнаруживаются следующие основные группы ферментов:

· гидролазы, вызывающие расщепление протеинов, углеводов, липидов путем присоединения молекул воды;

· оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции;

· трансферазы, осуществляющие перенос отдельных атомов, от молекулы к молекуле;

· лиазы, отщепляющие химические группы негидролитическим путем;

· изомеразы, участвующие в углеводном обмене;

· лигазы, способствующие биосинтетическим реакциям клетки.

Ферменты бактерий классифицируются на экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются бактериальной клеткой в окружающую среду для внеклеточного переваривания. Этот процесс осуществляется с помощью гидролаз, которые расщепляют макромолекулы питательных веществ до простых соединений -- глюкозы, аминокислот, жирных кислот. Такие соединения могут свободно проходить через оболочку клетки и с помощью пермеаз передаваться в цитоплазму клетки для участия в метаболизме, являясь источниками углерода и энергии. Некоторые экзоферменты выполняют защитную функцию, например, пенициллиназа, выделяемая многими бактериями, делает клетку недосягаемой для антибиотика -- пенициллина.

Ферменты бактерий классифицируются также на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называются такие ферменты, которые синтезируются клеткой независимо от наличия субстрата в среде, индуцибельные ферменты образуются бактериями только при наличии в среде соответствующего индуцирующего соединения, т. е. субстрата данного фермента. Например, в геноме кишечной палочки заложена способность разлагать лактозу, но только при наличии в среде лактозы клеткой синтезируется фермент, катализирующий ее гидролиз.

Патогенные бактерии обладают наряду с ферментами обмена также ферментами агрессии, являющимися факторами вирулентности. К таким ферментам относятся

· гиалуронидаза,

· дезоксирибонуклеаза,

· коллагеназа,

· нейраминидаза, и др.

Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.

Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза.

20. Пигменты бактерий

Пигменты бактерий - это специфические фоторецепторные молекулы, вторичные метаболиты, образующиеся на свету и придающие бактериям окраску.

Классификация пигментов по растворимости:

Ш жирорастворимые (каротиноидные, хиноновые, азахиноновые);

Ш водорастворимые (фенозиновые, пиразиновые) - хромопарные (способны диффундировать в окружающую среду и окрашивать не только колонии, но и питательные среды);

Ш спирторастворимые (каротиноидные, пирроловые);

Ш нерастворимые ни в воде, ни в сильных кислотах (меланиновые).

Значение пигментов:

Ш защита от действия видимого света и УФ-лучей;

Ш ассимилируют углекислый газ;

Ш обезвреживают токсичные кислородные радикалы;

Ш участвуют в синтезе витаминов;

Ш обладают антибиотическим действием и свойствами биологически активных веществ;

Ш цвет пигмента используют в идентификации бактерий.

21. Основные типы биологического окисления субстрата бактериями. Аэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы, анаэробы. Примеры

Синтез биополимеров бактериальной клетки требует энергии. Она образуется в ходе биологического окисления и запасается в виде молекул макроэргов -- АТФ и АДФ.

Органеллами дыхания у большинства бактерий являются производные цитоплазматической мембраны -- мезосомы, на которых локализуются специальные дыхательные ферменты типа цитохромоксидаз. Тип биологического окисления является одним из ключевых признаков, позволяющих дифференцировать различные микроорганизмы. По этому признаку выделяют 3 группы бактерий:

* 1-я группа -- облигатные аэробы

* 2-я группа -- облигатные анаэробы

* 3-я группа -- факультативные анаэробы -- бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствие кислорода и использовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения. Среди них могут быть:

* факультативно-анаэробные бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии);

* аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии, которые могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его, а получают энергию исключительно с помощью брожения (молочнокислые бактерии).

Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях -- брожением.

В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различают брожение: спиртовое; молочнокислое; пропионовокислое; муравьинокислое, маслянокислое; уксуснокислое.
Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий, осуществляющих брожение, -- облигатные анаэробы.

22. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий

Под ростом бактерий понимают увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординированного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур. Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозначают термином "размножение". Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).

Выделяют 4 фазы роста:

* 1-я -- начальная, или лаг-фаза, или фаза задержки размножения, -- характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;

* 2-я -- логарифмическая, или лог-фаза, или экспоненциальная фаза, -- характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;

* 3-я -- стационарная фаза -- наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток.

* 4-я -- фаза отмирания (логарифмической гибели) -- характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции. Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток.

23. Питательные среды для культивирования бактерий. Требования. Классификация

Требования, предъявляемые к средам

· быть питательными, то есть содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей.

· иметь оптимальную концентрацию водородных ионов -- pH, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2--7,4). Исключение составляют холерный вибрион -- его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5--9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2--6,8).

· быть изотоничными для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида.

· быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.

· плотные средым должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.

· быть по возможности унифицированным, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.

Желательно, чтобы среды были прозрачными -- удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Классификация

· По исходным компонентам:

o натуральные среды -- готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, асцит, костная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)

o синтетические среды -- готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.

· По консистенции(степени плотности):

o жидкие

o полужидкие

o плотные

Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым прибавляют агар-агар или желатин. Кроме того, в качестве плотных сред применяют коагулировавшие яичные или сывороточные белки, картофель, среды с силикагелем. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество -- при их росте среда разжижается.

· По составу:

o простые: мясопептонный бульон(МПБ), мясопептонный агар(МПА), питательный желатин,

o сложные -- готовят, прибавляя к простым средам аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие вещества.

· По назначению:

Первая группа - универсальные (простые) среды. К ним принадлежат мясо-пептонний бульйон (МПБ) и мясо-пептонний агар (МПА). За своим составом, наличием питательных веществ они пригодны для культивирования многих видов бактерий.

Вторая группа - специальные среды. Они используются в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агары, сывороточный бульйон, асцитический бульйон, асцит-агар и другие.

Третья группа - элективные среды, на которых микроорганизмы определенного вида растут быстрее, более интенсивно, опережают в своем развитии другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является елективним средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера - для возбудителей дифтерии.

Четвертая группа - селективные среды, которые благодаря добавлению определенных компонентов (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. да, среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновий агар - для коринебактерій и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).

Пятая группа - дифференциально-диагностичнеские среды. Это большая группа сред, которые позволяют определить определенные биохимические свойства микроорганизмов и проводить их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Ендо, Левина, Плоскирева, Гисса).

24. Основные питательные среды. Состав и назначение

Мясная вода. Мелко нарубленное мясо, освобожденное от жира и сухожилий, смешивают с двойным по весу количеством воды (500 г+1 л воды), настаивают 24 часа при комнатной температуре, фильтруют через кусок полотна и тщательно отжимают мясо, оставшееся на нем. Мясная вода представляет собой красноватую жидкость кислой реакции. Она содержит растворимые белковые вещества (альбумины), экстрактивные вещества и некоторые соли. Мясную воду кипятят до свертывания белка и фильтруют через бумажный фильтр. При необходимости сохранить мясную воду ее разливают по флаконам или бутылкам и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут.

Приготовление мясо-пептонного бульона. Бульон готовят из мясной воды, к которой для повышения питательных свойств прибавляют пептон (1%) и хлористый натрий (0,5%), т. е. на 1 л мясной воды берут 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Смесь кипятят 10--15 минут при постоянном помешивании. При этом пептон и соль растворяются. Полученный бульон имеет кислую реакцию, при которой большинство патогенных микробов не дает роста. Необходимо поэтому сделать реакцию слабо щелочной.

Приготовление мясо-пептонного агара. К мясо-пептонному бульону прибавляют от 2 до 4% (в зависимости от сорта) мелко нарезанного агар-агара и кипятят до полного растворения. Затем дают остыть до 50° и прибавляют для просветления яичный белок (на 1 л агар берут взбитый и размешанный с небольшим количеством воды белок одного яйца), хорошо взбалтывают и помещают на 4--5 минут в автоклав. Белок во время кипячения свертывается и увлекает за собой взвешенные частицы. Полученную мутную жидкость фильтруют в горячем виде через вату, смоченную горячей водой. Питательные среды на переваре Хоттингера. Основной раствор Хоттингера с успехом заменяет мясную воду. Нарезают небольшими кусочками 1 кг мяса, помещают в сосуд, содержащий 1,5 л кипящей воды и кипятят 15--20 минут. Затем мясо вылавливают и измельчают в мясорубке. Остывшую до 40--45° жидкость переливают в бутыль и прибавляют 1,5 г соды, 3--5 г панкреатина и 15--20 г хлороформа, тотчас же закрывают резиновой пробкой и встряхивают. К этой жидкости прибавляют измельченное мясо, желчь (20 мл желчи на 1 кг фарша), встряхивают и оставляют бутыль стоять при комнатной температуре на 5 суток или дольше (жидкость в бутыли ежедневно по нескольку раз в день взбалтывают), пока содержимое ее не превратится в прозрачную, насыщенно желтую жидкость с мелким осадком на дне. Достаточность переваривания определяют реакцией на триптофан. Затем жидкость фильтруют, разливают по флаконам и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут. Для приготовления бульона этот основной раствор разводят дистиллированной водой в 3--5 или 10 раз. Степень разведения зависит от того, для каких микроорганизмов предназначается данная среда, и от качества полученного раствора Хоттингера. К уже разведенному перевару Хоттингера прибавляют 0,7% хлорида натрия и 0,1 /о фосфорнокислого калия (К2НРО4), кипятят, устанавливают желаемую реакцию, снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, еще раз проверяют реакцию, разливают по пробиркам и флаконам и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 20 минут.

Растворяя в таком бульоне агар или желатину, получают соответствующую твердую среду.

25. Элективные питательные среды. Состав и назначение

Сахарный бульон и сахарный агар готовят путем прибавления к обычному бульону или расплавленному простому агару того или иного углевода в количестве от 0,5 до 1%. Углевод растворяют в небольшом количестве воды, а затем прибавляют к питательной среде. Стерилизацию сахарного бульона и агара производят в аппарате Коха 3 дня подряд по 1 часу.

Агар с кровью, сывороткой или с асцитической жидкостью готовят при соблюдении строгой асептики. К готовому слабо-щелочному расплавленному и вновь охлажденному до 45° агару, разлитому в пробирки или флаконы, прибавляют 20--25% стерильной сыворотки или асцитической жидкости или 5--25% стерильной дефибринированной крови. После тщательного перемешивания (избегать образования пузырей и пены) агар в пробирках скашивают, а содержимое флаконов разливают по чашкам Гейденрейха. Бульон с сывороткой, асцитической жидкостью или кровью готовят таким же способом, как агар, но без нагревания. Для контроля стерильности бульон ставят в термостат на 48 часов при 37°.

26. Дифференциально-диагностические питательные среды. Состав и назначение

Среда Эндо. Готовится непосредственно перед употреблением. К 100 мл мясо-пептонного агара или агара на бульоне Хоттингера (pH 7,6) стерильно добавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, охлаждают до 70° и добавляют смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина и 1,25 мл свежеприготовленного 10% раствора сернистокислого натрия, взбалтывают и разливают по чашкам. Для подсушивания открытые чашки помещают на 30 минут в термостат при 37°.

На среде Эндо кишечная палочка дает колонии красного цвета с металлическим оттенком, а бактерии тифозно-паратифозной и дизентерийной группы -- бесцветные колонии.

Пестрый ряд углеводов (среда Гисса). К 100 мл воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г поваренной соли. Пептон и соль растворяют в горячей воде в течение нескольких минут и фильтруют через бумажный фильтр (раствор должен быть совершенно прозрачным). Устанавливают pH 7,0. В указанной среде растворяют 1% одного из применяемых углеводов, на дно пробирок опускают поплавки для улавливания газа (свидетельствующего о глубоком расщеплении сахаров) и прибавляют индикатор. В качестве индикатора употребляют:

а) лакмусовую настойку -- 5 мл на 100 мл среды. В кислой среде лакмусовая настойка показывает покраснение, в щелочной -- посинение;

б) азолитмин, который представляет собой очищенный препарат лакмуса, его калийную соль (на 1 л среды добавляют 0,25 г азолитмина);

в) бромтимол блау -- на 1 л среды 1 мл 1,6% спиртового раствора индикатора (среда приобретает зеленый цвет, синеет при образовании щелочи, желтеет при образовании кислоты);

г) индикатор Андреде, который состоит из 1 г кислого фуксина, 400 мл дистиллированной воды и 64 мл нормального раствора едкого натра. К питательной среде добавляют 1% индикатора. Среда в пробирке должна приобрести соломенно-желтый цвет без розового оттенка. В кислой среде цвет среды меняется на красный.

Индикатор добавляют для того, чтобы определить изменения реакции питательной среды, происходящей под влиянием ферментации углеводов, т. е. для выявления биохимической активности микробов. Последнее имеет большое значение для микробиологической диагностики ряда инфекционных заболеваний (брюшной тиф, дизентерия, холера и др.). Среды с углеводами и индикатором разливают в стерильные пробирки и стерилизуют дробно при 100° в течение 3 дней.

27. Вирусологические методы. Назначение, принцип

Вирусологический метод

Основные этапы:

1. Забор исследуемого материала.

2.Выбор по принципу цитотропизма и получение чувствительной тест-системы, определение ее жизнеспособности.

3. Заражение выбранной системы.

4.Индикация вируса на основании обнаружения его нуклеиновой кислоты, антигенов, гемагглютинина, ЦПД, включений.

5. Идентификация и титрование вируса проводится на основании:

а) определения антигенов вируса с помощью иммунологических реакций (РИФ, ИФА, РПГА, РСК, РН, ВИЭФ и др.); б) патогистологического исследования органов и тканей; в) ЦПД; г) клинических симптомов, биологических проб (кератоконьюнктивальная и др.).

Методы индикации вирусов

При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:

1. Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) - возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений;

2. Приобретение заражённой культурой клеток способности к гемадсорбции - к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя;

3. Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек, являющихся «негативными колониями» вирусов;

4. Внутриклеточные включения

5. РГА

Методы идентификации вирусов

1.Реакция нейтрализации

2.Реакция торможения гемадсорбции

3.Реакция торможения гемагглютинации

28. Методы культивирования микоплазм, риккетсий, хламидий, вирусов

Риккетсии - облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных.

Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37° С 10-14 дней или на Тироде-сывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37° С 6-10 дней.

Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе.

Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий.

...