Секрет Фиалки удивительной (Viola mirabilis L.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ

Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение города Москвы “Школа им. Н.М. Карамзина”

Секрет Фиалки удивительной (Viola mirabilis L.)

Рябов Дмитрий

Алешкина Марина

Научный руководитель:

Федорова А. В.

2017-2018 учебный год

План исследовательской работы

Введение

Материалы и методы

Выделение ДНК

Постановка ПЦР- полимеразной цепной реакции, амплификация фрагменов хлоропластной ДНК и ISSR-фрагментов

Визуализация продуктов амплификации. Очистка продуктов амплификации и секвенирование нуклеотидных последовательностей

Результаты и выводы

Список использованной литературы

Приложения

Введение

Фиалка удивительная (Viola mirabilis L.) вид фиалок из семейства Фиалковые (Violaceae), описанный Карлом Линнеем в 1753 году. Это теневыносливое влаголюбивое лесное растение, растет в лиственных лесах (преимущественно дубравах) и смешанных лесах, зарослях кустарника на достаточно богатой, умеренно увлажненной и хорошо аэрируемой почве. Распространена в Европе и ряде регионов Азии. В России встречается на всей территории европейской части (кроме арктических районов и Нижней Волги), в Предкавказье и Сибири. Известна во всех областях Средней России, чаще в нечерноземной полосе. Удивительной эта фиалка названа потому, что ее весенние хазмогамные цветки, развивающиеся в пазухах розеточных листьев, как правило, бесплодны, а плоды развиваются из летних клейстогамных цветков - на удлиненных летних побегах. В нечерноземной полосе это всегда так. В Белгородской области научным сотрудником ГБС им. Н.В. Цицина РАН Решетниковой Н.М. были неоднократно собраны экземпляры Фиалки удивительной, развивающие плоды из весенних цветков. Она предположила, что этот вид получает возможность скрещиваться с произрастающими рядом другими видами. А именно с Фиалкой приятной (V. suavis W. Beck.) и Фиалкой донской (V. tanaitica Grosset.). Предполагаемые гибриды Фиалки удивительной и Фиалки приятной (V. mirabilis L. Ч V. suavis) , по-видимому, в Белгородской области встречается довольно часто. Предполагаемые гибридные растения образуют обширные клоны и довольно длинные подземные корневища, как Ф. приятная (V. suavis), но имеют рыжеватые чешуи в основании розеточных побегов, как Ф. удивительная (V. mirabilis). Листья гибридных растений на одном и том же побеге могут иметь форму, как у типичной V. mirabilis и быть вытянутыми, продолговато-яйцевидными как у Ф. приятной (V. suavis).

Как правило, присутствуют только розеточные побеги (в пазухах которых иногда наблюдаются цветки), удлиненные стеблевые побеги развиваются редко - и коробочки на них выглядят недоразвитыми.

Также существует вероятность образования гибридов между Ф.удивительной и Ф. донской (V. tanaitica). Предположительно гибридные их растения имели крупные прилистники, небольшие листья - как у Ф.донской (V. tanaitica). Формой листьев, сближением на удлиненных побегах близ верхушки листьями у клейстогамных цветков и рыжими прикорневыми чешуями они напоминали Ф. удивительную (V. mirabilis), но характерное для этого вида опушение стебля и черешков листьев двумя продольными полосками волосков у них отсутствовало.

По-видимому, нужно обратить специальное внимание на образ жизни и гибридизацию Ф. удивительной (V. mirabilis) на юге России. Одних данных по морфологическим признакам часто бывает недостаточно, чтобы подтвердить или опровергнуть гибридогенное происхождение исследуемых образцов. В связи с этим мы попробуем решить эту проблему с использованием молекулярно-генетических методов. Одновременно научимся специфическим методикам работы в молекулярной лаборатории.

Цель работы: подтвердить или опровергнуть гибридогенное происхождение образцов фиалок по гербарным сборам, предоставленным Решетниковой Н.М. (ГБС РАН).

Задачи:

1. научиться правильно подбирать материал для исследования;

2. освоить методики работы в молекулярной лаборатории при работе с растительным материалом;

3. подобрать условия успешного протекания полимеразной цепной реакции;

4. изучить основные методики статистической обработки полученных данных в специальных программах;

5. на основе полученных данных научиться правильно формулировать выводы по исследуемой проблеме;

фиалка полимеразный цепной амплификация

Материалы и методы

Исследовательская работа проводится на базе молекулярной лаборатории отдела Гербарий Главного ботанического сада имени Н.В. Цицина РАН. Для исследования нами был отобран растительный материал по гербарным сборам Решетниковой Н. М. из нескольких точек с территории Белгородской области. Были отобраны экземпляры, определенные Решетниковой Н. М., как чистые родительские виды Ф. удивительной и Ф. приятной, а также предполагаемые гибриды между ними. Для расширения выборки мы добавили еще несколько образцов каждого вида, собранных с территории Калужской, Смоленской, Волгоградской, Саратовской, Ярославской, Тульской, Белгородской областей в разные годы, а также с территории Чувашии, Донецкой области Украины, Молдавии (образцы хранятся в Гербарии Главного ботанического сада им. Н.В.Цицина РАН). А также для проверки гибридного статуса и в качестве внешней группы мы включили в работу еще один вид -- Ф. донская и два предположительных гибрида между ней и Ф. удивительной (из сборов Решетниковой Н.М.).

Всего для исследования было отобрано 36 образцов: 11 образцов Ф. удивительной (обозначены VM), 10 образцов Ф. приятной (обозначены VS), 8 образцов предполагаемых гибридов между ними (обозначены VX), 5 образцов Ф. донской (обозначены VT) и 2 образца вероятных гибридов между Ф. донской и Ф. удивительной (обозначены VTX).

Таблица 1. Основные морфологические признаки исследуемых видов.

Выделение ДНК

Из сухих листьев всех образцов нами была выделена общая ДНК с использованием двух методов: стандартного метода выделения ДНК с применением цетилтриметиламмоний бромида (CTAB) [Doyle, Doyle, 1987] и с помощью набора для экстракции растительной ДНК Nucleospin Plant Extraction Kit (“Machery-Nagel”). Для разрушения клеточных стенок и мембран растительный материал измельчали с помощью металлических шариков с добавлением песка в гомогенизаторе (3 минуты) в 2,0 мл пробирках Эппендорф, куда добавляли по 200-600 мкл нагретого до 60?С CTAB- буфера (2х CTAB- буфер, 1% Na2SO3 + 1% PVP). Далее пробирки инкубировали в термостате при температуре 60?С в течении 30 минут, периодически перемешивая содержимое. После инкубации в пробирки добавляли 2/3 объема (~550 мкл) 24:1 хлороформ - изоаминола и вортексировали (перемешивали) 1 минуту до состояния эмульсии. Эмульсию расслаивали центрифугированием в течение 5 минут при 13400 оборотов в минуту. Верхнюю фазу аккуратно переносили в чистую пробирку, стараясь не захватить интерфазу, содержащую клеточный дебрис, и повторяли обработку суспензии смесью хлороформа и изоамилового спирта с последующим центрифугированием суспензии в течение 5 минут при 13400 оборотов в минуту. После этого верхнюю фазу снова аккуратно переносили в чистую пробирку Эппендорф 1,5 мл. Осаждение ДНК из раствора осуществляли чистым ice-cold изопропанолом (~ 400 мкл). Смесь аккуратно переворачивали и оставляли на 15 минут в морозильнике при температуре - 80 ?С. В осадок выпадала цитавлоновая соль ДНК. Осадок ДНК центрифугировали в течении 5 минут при 13400 оборотах в минуту.

Затем из пробирок дозатором переменного объема аккуратно отбирали жидкую фазу и промывали осадок ДНК 100 мкл 72% этанолом в течение 10 минут. Осадок подсушивали в термостате при температуре 37?С и растворяли в 50 мкл стерильной деионизированной воде.

При минимальном количестве исходного материала (менее 20 мкг) препараты тотальной ДНК получали с использованием набора для экстракции растительной ДНК Nucleospin Plant Extraction Kit (“Machery-Nagel”, Германия), следуя стандартному протоколу производителя.

Наличие и качество ДНК проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия. Образцы экстрагированной (выделенной) ДНК хранили при - 40 ?С. Для дальнейших манипуляций с ДНК делали разведение всех образцов 1:19.

Постановка ПЦР- полимеразной цепной реакции, амплификация фрагменов хлоропластной ДНК и ISSR-фрагментов

Для установления видовой принадлежности исследуемых растений, а также для выявления гибридной природы некоторых из них мы решили использовать два подхода к решению проблемы:

1. анализ нуклеотидных последовательностей двух межгенных спейсеров (интронов) хлоропластной ДНК -- trnH-psbA и trnV-ndhC . Нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров в ходе эволюции изменяются гораздо быстрее, чем последовательности генов, соответственно, в них накапливаются некоторое количество замен, вставок или делеций, что делает эти участки удобным объектом в исследованиях.

Первый участок является высоко изменчивым (размером около 500 пар нуклеотидов) у многих покрытосеменных растений и часто используется для идентификации большого числа видов растений. Второй интрон trnV-ndhC до этого момента еще никогда не использовался для анализа у фиалок. Нам было интересно узнать, насколько он окажется изменчивым в группе фиалок.

2. ISSR- метод (ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)). Этот метод используется для выявления уровня внутри и межвидового полиморфизма растений. Это анонимный подход анализа полиморфизма многочисленных участков, рассеянных по различным регионам ДНК, зарекомендовал себя, как малозатратный, хорошо воспроизводимый метод, который может быть успешно использован как для выявления внутри и межвидового полиморфизма, так и для идентификации видов в популяции. В ISSR- анализе растений наиболее часто используют динуклеотидные (двухбуквенные) и тринуклеотидные (трехбуквенные) типы повторов микросателлитной ДНК, которые характерны для ядерного генома. Для постановки ПЦР используется только 1 праймер, который работает на обеих цепях ДНК, и амплифицируется фрагмент межмикросателлитной ДНК длиной от 100 до 2000 п.н. Гипервариабельные ISSR представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК. Для амплификации межмикросаттелитных участков генома были использованы следующие праймеры производства компаний “Диалат” и “Синтол”:

Таблица 2. ISSR-праймеры.

ПЦР осуществляли в амплификаторе MJ Research PTC-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) Условия ПЦР: предварительная денатурация 95 С - 3 мин; 35 циклов: денатурация при 94 С - 30 с, отжиг при соответствующей температуре - 30 с, элонгация при 72 С - 40 с + прибавление 2 с на каждый цикл, заключительная элонгация в течении 4 минут.

Температуру плавления для каждого праймера предварительно рассчитывали по формуле Т = 4 х (G+C) + 2 x (A+T), окончательную температуру отжига праймеров выбирали на основе результатов реакций с градиентом температур отжига. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10-20 нг ДНК, 20 пикомоль праймера и 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5X Mag^DDMIX-2025 (200 мкМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl₂, 1,5 ед. Taq-полимеразы и буфер). Для амплификации хлоропластных участков trnV-ndhC и trnH-psbA были использовали праймеры, синтезированные в ПКЗАО “Синтол”:

trnV(UAC)2X GTC TAC GGT TCG ART CCG TA

ndhC TAT TAT TAG AAA TGU CCA RAA AAT ATC ATA TTC

trnH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC

psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C

Условия ПЦР: предварительная денатурация 94 С - 3 мин; 30 циклов: 94 С - 30 с, отжиг при 56 С - 40 с, элонгация при 62 С - 20 с; 2 цикла: 56С - 40 с, 62 С - 1мин 20 с.

Визуализация продуктов амплификации

Разделение продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1 % и 1,7% агарозном (Amresco)геле в 0,5-кратном трис-боратном буфере с окрашиванием бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при 125 В в течении 15 или 80 минут в горизонтальной камере Sub- Cell® Model 192(Bio-rad) и фотографировали с помощью системы гель-документирования GelDoc-It® Imaging System (США). Для определения размеров фрагментов использовали маркер длины Gene Ruler 100+ п.н. (Fermentas).

Очистка продуктов амплификации и секвенирование нуклеотидных последовательностей

Так как общая выделенная ДНК была, видимо, загрязнена присутствием какой-то чужеродной ДНК (вероятно, грибов), вместе с нужными нам фрагментами участков trnH-psbA и trnV-ndhC амплифицировались еще фрагменты, более легкие по весу (Приложение 4). Поэтому очистку амплификатов мы проводили с помощью коммерческого набора CleanUp mini на колонках (производитель “Евроген”). Из агарозного геля мы скальпелем вырезали нужный фрагмент, взвешивали его и очищали согласно протоколу производителя. Концентрацию очищенных образцов определяли с помощью флюорометра Qubit.

После этого образцы в необходимой концентрации вместе с праймерами высушивались в пробирках и отдавались на секвенирование.

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems на базе ЦКП “Геном” (Институт Молекулярной Биологии РАН им. В. А. Энгельгардта) и в ПКЗАО “Синтол” (Москва).

Полученные нуклеотидные последовательности будут проанализированы с помощью специальных биологических статистических программ (BioEdit, TCS, NewHybrids, Structure).

Результаты и выводы

Так как работа технически рассчитана на длительное время и требует больших усилий в статистической обработке полученных данных, говорить с уверенностью об окончательных результатах мы пока не можем. На данный момент нами проделана бОльшая часть работы по проблеме исследования: освоены методики выделения ДНК из растительного материала, проведения ПЦР, очистки пцр-продуктов; подобраны праймеры для ПЦР, амплифицированы и отсеквенированы фрагменты хлоропластной ДНК, получены электрофоретические спектры ISSR-маркеров. На основе полученных данных мы уже можем сказать о том, что выбранные для работы межгенные спейсеры trnH-psbA и trnV-ndhC, оказались очень вариабельными (изменчивыми).Длина выравнивания последовательности спейсера trnV-ndhC для фиалок составила 731 п.н., а спейсера trnH-psbA -- 558 п.н. В приложении 1 и 2 показаны некоторые вариабельные части в выравниваниях по двум участкам хлоропластной ДНК. Из-за небольших неточностей в прочтении последовательностей секвенатором, все последовательности будут выверены нами вручную. После проверки точности прочтения все последовательности будут депонированы в международную базу ГенБанк. По фотографиям агарозных гелей ISSR- фрагментов (Приложение 3) можно визуально четко отделить предполагаемые родительские виды (Ф.удивительная (VM), Ф. приятная (VS), Ф. донская (VT)). Дальнейший прямой подсчет фрагментов ISSR-маркеров с помощью программы CrossChecker с последующим составлением бинарной матрицы (наличия/отсутствия фрагментов) позволит нам подтвердить или опровергнуть предположения Решетниковой Н.М. о гибридогенном происхождении образцов фиалок, собранных ею с территории Белгородской области.

Список использованной литературы

1. Решетникова Н.М. Дополнения к флоре Средней России и Белгородской области (по материалам 2015-16 гг.)// Бюл. МОИП. Отд. биол., 2018. Т.123 (в печати).

2. Федорова А.В., Шанцер И.А., Мещерский И.Г. Гибридизация между Rosa rubiginosa L. и R. villosa L. в условиях заповедника “Белогорье” (урочище “Стенки изгорья”) и природа R. oskolensis Buzunova et Grigorj. // Бюл. Главн. бот. сада. 2012. Вып. 198, №4. С. 33-40.

3. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. -- 1987. -- Vol. 19. -- P. 11--15.

4. Fedorova A.V., Schanzer I.A., Kagalo A.A. Local differentiation and hybridization in wild rose populations in Western Ukraine. // Wulfenia. Vol. 17. 2010. P. 99-115.

5. Hall T.A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. // Nucl. Acids Symp. Ser. 41:95-98.

Приложения 1 и 2

Приложение 3. Электрофоретические спектры ISSR- фрагментов.

Приложение 4. Амплифицированные участки хлоропластной ДНК у фиалок.

Размещено на Allbest.ru