Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГАОУ ВО «Волгоградский государственный университет»

Факультет естественных наук

Кафедра биоинженерии и биоинформатики

Курсовая работа

Анализ генов, экспрессия которых связана с ответом клеток P. caudatum на окислительный стресс

Свиридова Ирина Андреевна



Введение

Актуальность. Существование человека в условиях современной техногенной цивилизации, загрязнение окружающей среды неизбежно приводит к постоянному возникновению стрессовых ситуаций, что, в свою очередь, вызывает развитие серьезных функциональных расстройств организма. Негативная окружающая среда, вызывающая стрессы, может стимулировать накопление в организме человека свободных радикалов кислорода. Активные формы кислорода образуются и в процессе нормального метаболизма, но в неблагоприятных условиях (загрязнение воздуха, недоброкачественная пища, облучение, тяжелые металлы, некоторые виды лекарств и т.д.) их количество значительно возрастает. Это приводит к гибели клеток и развитию патогенных заболеваний.

Регуляция процесса клеточной гибели является одной из главных проблем цитологии, поскольку решение проблемы увеличения срока жизни клетки имеет прямое отношение к поддержанию гомеостаза многоклеточного организма и, следовательно, к биомедицинским задачам коррекции этого процесса в случае различных заболеваний.

В природных водах активные формы кислорода образуются в процессе каталитического инициирования, растворения активных газов из атмосферы, радиационно-химического инициирования, фотохимического инициирования, биогенной эмиссии, в результате кавитационных эффектов.

Для оценки качества среды обитания применяются методы биоиндикации и биотестирования. В методиках биотестирования в качестве основного показателя используется физиологическая или поведенческая реакция на загрязнение воды определённого вида живых организмов. Наиболее распростараненным тест-организмом является инфузория-туфелька (P.caudatum). Инфузории являются подходящей моделью организма для наблюдения влияния физических и химических факторов на биологические сообщества т.к. широко распространены во всех средах обитания и могут выполнять функции как одной клетки, так и целостного организма. Более того, они быстро реагируют на токсичные и нетоксичные химические вещества, что обуславливается малым временем генерации и тонкой клеточной мембраной без внешней клеточной стенки.

Применение методов биоинформационного анализа позволит исследовать ответ эукариотических организмов на окислительный стресс на генном уровне.

Степень разработанности проблемы. Cеквенирование генома P. caudatum позволило улучшить наше понимание биологии этого организма. Однако на данный момент в литературе отсутствуют данные о наличии у P.caudatum генов каталаз и пероксидаз, а также об их чувствительности к перекиси водорода, одной из активных форм кислорода.

Объект исследования - тест - организм Paramecium caudatum.

Предмет исследования - гены инфузорий, экспрессия которых связана с ответом на окислительный стресс.

Целью работы было составление списка генов P.caudatum, которые могут достоверно или предположительно участвовать в регуляции ответа на окислительный стресс.

Задачи исследования:

1. Изучение литературы по данной теме.

2. Поиск генов инфузорий, реагирующих на окислительный стресс.

3. Анализ найденных генов P.caudatum.

Методологические основы исследования. Исследование носит аналитический характер. В работе проводился анализ литературы по данной проблеме: были использованы научные статьи и публикации, посвящённые рассматриваемому объекту, материалы из Национального центра биотехнологической информации (NCBI), который включает в себя базы данных PubMed, PubMed Central. Также были использованы данные из базы UniProt и банков белковых последовательностей Swiss-Prot.



Глава 1. Обзор литературы

1.1 Paramecium caudatum как тест-организм

Наиболее типичной моделью для оценки загрязнения природных вод выступают простейшие животные, в частности инфузории-туфельки. Paramecium caudatum относится к классу Ресничных инфузорий. Это наиболее сложно устроенные простейшие, очень чувствительные к изменениям химического состава среды.

Парамеции могут быть легко культивируемы в лабораторных условиях, что делает их идеальным модельным организмом, хорошо подходящим для биологического исследования [16].

Средой обитания инфузории туфельки являются пресные водоемы со стоячей водой и наличием в воде разлагающихся органических веществ. Размеры парамеции хвостатой -- 0,2-0,3 мм. Форма тела напоминает подошву туфли. Пелликула (наружный плотный слой цитоплазмы) включает находящиеся под наружной мембраной плоские мембранные цистерны, альвеолы, микротрубочки и другие элементы цитоскелета [3].

Органами движения парамеций служат реснички (10-15 тыс.), расположенные на поверхности клетки продольными рядами. Трихоцисты - мелкие веретеновидные тельца, расположенные между ресничками, являются органоидами защиты. По стенкам ротовой впадины, или перистома, расположены реснички, собранные в две группы. Они загоняют в глотку вместе с потоком воды основную пищу инфузорий -- бактерии. Наряду с бактериями они могут заглатывать и любые другие взвешенные в воде частицы независимо от их питательности. Мелкие пищевые частицы проникают через рот в небольшую трубковидную глотку и попадают в фагосому, в которой подвергаются перевариванию. Непереваренные остатки пищи выбрасываются наружу в задней части тела через цитопиг, или порошицу. Парамеции дышат всей поверхностью клетки. Продукты азотистого обмена выводятся через поверхность клетки и частично через сократительную вакуоль. Излишки воды выводятся из клетки за счет работы сократительных вакуолей, выполняющих осморегуляторную функцию [7].

Инфузории имеют два рода ядер: большое эллипсоидальное ядро называется макронуклеус, регулирующее клеточный метаболизм и одно маленькое ядро - микронуклеус, участвующее в половом процессе.

Макронуклеусы богаты ДНК и обладают высокой плоидностью в отличие от диплоидного микронуклеуса. В макронуклеусах происходит синтез РНК. ДНК макронуклеуса способна и к репликации. В микронуклеусах же происходит лишь репликация ДНК перед делением, а синтез РНК не осуществляется.

У инфузории-туфельки есть бесполое и половое размножение. При бесполом размножении ядра делятся на две части, и в каждой новой инфузории оказывается по одному большому и по одному малому ядру. Каждая из двух дочерних получает часть органоидов, а другие образуются заново.

При недостатке пищи или изменении температуры инфузории переходят к половому размножению, а затем могут превратиться в цисту.

При половом процессе увеличения числа особей не происходит. Две инфузории временно соединяются друг с другом. На месте соприкосновения оболочка растворяется, и между животными образуется соединительный мостик. Большое ядро каждой инфузории исчезает. Малое ядро дважды делится. В каждой инфузории образуются четыре дочерних ядра. Три из них разрушаются, а четвёртое снова делится. В результате в каждой остаётся по два ядра. По цитоплазматическому мостику происходит обмен ядрами, и там сливается с оставшимся ядром. Вновь образовавшиеся ядра формируют большое и малое ядра, и инфузории расходятся. Такой половой процесс называется конъюгацией. Он длится около 12 часов. Половой процесс ведёт к обновлению, обмену между особями и перераспределению наследственного (генетического) материала, что увеличивает жизнестойкость организмов. (Рис.1)

Рис.1. Конъюгация у инфузорий (по Хаусману):

1 - соединение конъюгантов, 2-4 - деление микронуклеуса на четыре ядра, 5 - редукция трех ядер из четырех, 6 - деление оставшегося ядра на стационарное и мигрирующее ядро и обмен мигрирующими ядрами, 7 - слияние ядер и образование синкариона, 8 - расхождение конъюгантов, 9 - реорганизация ядерного аппарата при делении клеток после конъюгации; Ma - макронуклеус, Mu - микронуклеус

Основные преимущества применения данного тест - организма:

1. Культивировать этих простейших легко, они удобны в использовании, эффективны при ограниченном времени.

2. Характерная особенность инфузорий -- относительно быстрая изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным условиям. Они приспосабливаются и к разному минеральному и органическому составу среды, а также к присутствию растворенных газов. Paramecium caudatum может жить как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

3. В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения.

4. Инфузории, как и человек, - эукариотические организмы, поэтому их реакция на токсиканты может быть сопоставлена с реакцией человека.

5. С помощью инфузорий возможна оценка токсичности не только водорастворимых соединений, но и соединений, растворимых в ряде органических растворителей;

6. Короткий жизненный цикл и скорость размножения инфузорий позволяют проследить их реакцию на воздействие токсиканта в ряду поколений.

В биотестах на инфузориях фиксируют изменение подвижности, гибель и скорость размножения. Однако наблюдать за изменением подвижности недостаточно для оценки токсичности. Это связано с тем, что на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, поэтому подвижность только незначительно отражает те изменения, которые происходят при отравлении токсичными веществами. Гибель отдельных клеток -- достаточно надежный показатель, но с его помощью невозможно выявить низкие концентрации токсикантов. Оценка скорости размножения -- биотест с большей чувствительностью, по нему можно определять и небольшие концентрации вредных веществ [2].

1.2 Механизм окислительного стресса

Все аэробные организмы, в том числе и человек, эволюционно приспособлены к существованию в воздушной среде с 21 %-ным содержанием кислорода. Кислород - один из наиболее распространенных элементов на нашей планете. Земная кора на 62,5 % состоит из этого элемента. Кислород занимает важнейшее место во всех биологических процессах. Окислительные реакции, протекающие в организмах, являются главным источником энергии. Свободные радикалы кислорода могут действовать как вторичные клеточные мессенджеры, участвуя в метаболизме арахидоновой кислоты и простогландинов. Процесс фагоцитоза протекает с участием радикалов кислорода и оксида азота. С другой стороны, еще с конца 19 века известно, что чистый кислород токсичен для животных и человека [1].

Термин “окислительный стресс” стал часто использоваться в 1970-х годах, но его концептуальные истоки можно проследить до 1950-х, когда исследователи обдумывали токсическое воздействие ионизирующего излучения, свободных радикалов, и аналогичные токсические эффекты молекулярного кислорода, а также потенциальный вклад таких процессов к явлению старения. Признание в 1968 году, что биологические системы могут производить значительные количества супероксида свободных радикалов O2*? посредством нормальных метаболических путей и ферментов, супероксиддисмутазы (СОД), эволюционировала с очевидной единственной целью - защитить аэробных организмов от предполагаемой токсичности этого свободного радикала. Эти ферментативные средства производства (через ксантиноксидазы) и устранения супероксида (через СОД) способствовали проведению дополнительных исследований в ряде областей физиологии и патологии [12].

Активные формы кислорода (АФК) образуются в организме и клетке при одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода до воды.

Особенность АФК - их высокая реакционная способность. Этим они отличаются от молекулярного кислорода, который не вступает в прямые неферментативные реакции. К АФК относятся гидроксильный (*ОН), алкоксильный (RO*), пероксильный (ROO*) радикалы, супероксидный анион-радикал (О2*-), а также синглетный кислород (1О2), который по сути не является свободным радикалом. Из других АФК важную роль играют перекиси и радикалы липидов, а также оксид азота.

Для образования АФК кислород должен быть активирован. Такая активация возникает двумя путями. Первый - фотодинамический, который заканчивается образованием синглетного кислорода. Второй сопровождается формированием супероксид-аниона и гидроксильного радикала.

В присутствии ионов переходных металлов (медь и железо) супероксиданион взаимодействует с перекисью водорода с образованием гидроксиланиона:

Источником синглетного кислорода может служить супероксид-анион при спонтанной дисмутации двух молекул, в результате которой образуется пероксид водорода.

Реакция пероксида водорода или гидроксильного радикала с избыточным О2*- также может продуцировать синглетный кислород:

Синглетный кислород может также образовываться после спонтанной дисмутации перекиси водорода:

Вероятно, что синглетный кислород может формироваться в процессе расщепления перекиси водорода пероксидазой [1].

Из всех радикалов АФК перекись водорода является самой устойчивой в растворах молекулой. Она образуется при восстановлении супероксид-аниона в реакции дисмута- ции и может возникать не только радикальным, но и безрадикальным путем.

Все АФК могут претерпевать взаимные превращения, которые зависят от присутствия металла с переменной валентностью или от конкретного фермента. АФК также могут вызывать образование вторичных реактивных продуктов, таких как липидные пероксиды.

АФК способны взаимодействовать с различными клеточными макромолекулами, такими как ДНК, белки и липиды мембран, что приводит к возникновению большого числа окисленных продуктов (Рис.2)

Рис. 2. Пути разрушения генетического материала клетки в результате окислительного стресса (Halliwell, 1998; 1999)

Благодаря системе антиоксидантной защиты (АОЗ) обеспечивается поддержание физиологически допустимых концентраций АФК в клетке. АОЗ включает низкомолекулярные соединения, которые связывают железо, являются «ловушками» электронов или обрывают цепную реакцию образования липоперекисей. Предупреждение кислородо- и липотоксичности осуществляется также ферментативно. СОД контролирует спонтанную дисмутацию О2*- и образование Н2О2. В водной среде функционируют глутатион пероксидаза митохондрий и каталаза пероксисом, использующие в качестве субстрата НООН, в липидном матриксе - Se-зависимая глутатион пероксидаза, использующая липоперекиси LOOH . К АОЗ можно причислить систему устранения повреждений, вызванных АФК. К ней относятся система репарации ядерной ДНК и плазматической мембраны (Se-зависимая фосфолипид глутатион пероксидаза) и система деградации поврежденных структур. Деградации подвергаются белки, клеточные органеллы и сами клетки. Апоптоз, индуцируемый АФК, можно рассматривать как элемент АОЗ, препятствующий нарастанию окислительного стресса.

В результате интенсификации сельского хозяйства, связанной с привлечением в круговорот природы огромного количества опасных для здоровья человека и животных химических веществ, многие из которых являются ксенобиотиками, по цепи воздух - грунт - растение - животное - человек мигрирует около 70 тыс. ксенобиотиков, преобладающее большинство которых фактически не проверенные на канцерогенность, мутагенность и терратогенность.

Использование пиретроидов, как инсектицидных и антипаразитарных препаратов в настоящее время составляет более 30% инсектицидов, используемых в глобальном масштабе.

В самом деле, синтетические пиретроиды являются синтетическими химическими аналогами и производными, они представляют собой третий по величине класс химических инсектицидов после органофосфатов и chloronicotinyl инсектицидов. Пиретроиды были разделены на два типа (тип I и тип II) на основе их химической структуры и токсичных проявлений. К пиретроидам I типа относятся те, которые не имеют б-циано группу и приводят к синдрому тремора (синдром Т), а пиретроиды II типа содержат б- циано фрагмент и приводят к хореоатетозу. Их общий сайт действия - биологические мембраны путем изменения транспорта натрия, но они также влияют на хлорид и кальциевые каналы [8].

Несколько исследований показали, что этот класс инсектицидов чрезвычайно токсичен для ряда non-traget организмов (организмы, на которые не рассчитано влияние пестицида), такие как: пчелы, рыбы и водные беспозвоночные.

Экологические загрязнители влияют на водную экосистему, вызывая окислительные повреждения чувствительных и специфичных биомаркеров и вызывая смерть клеток, через повышение внутриклеточного содержания активных форм кислорода (АФК) и активации системы антиоксидантной защиты.

Инфузории, в частности P.caudatum, используются в качестве превосходных инструментов для биомониторинга окружающей среды, либо как биоиндикаторов загрязнения или биопробы, для оценки эффекта токсичных соединений.

1.3 Обзор статей, посвященных действию окислительного стресса на парамеций

В настоящее время существует ряд исследований, посвященных воздействию окислительного стресса на клетки позвоночных и беспозвоночных животных, включая инфузории.

Так, например, в работе « Cypermethrin-Induces Oxidative Stress to the Freshwater Ciliate Model: Paramecium tetraurelia» было исследовано воздействие инсектицида циперметрина, который принадлежит к химической семье пиретроидов II типа, на культуру клеток Paramecium tetraurelia. В исследовании проводилась оценка кинетики роста, время генерации и процент ответа клеток в культуре инфузорий после инкубирования с тестируемыми концентрациями инсектицида в аликвотах 10мл, концентрации были 0,05, 0,5, 1 и 2 мкг / л. Результаты их исследования показали значительное уменьшение пролиферации клетки, снижение количества поколения и увеличение времени генерации, а также была отмечена высокая индукция биомаркеров оксилительного стресса, таких как: белки, содержание GSH, GST и CAT [8].

Работа австрийских ученых [12] представляет собой первую оценку фото-окислительного стресса в мутуалистическом симбиозе водоросли-инфузории. Авторы проверили гипотезу о том, что эффект фото-окислительного стресса больше в симбиотических представителях пресноводных инфузорий Paramecium bursaria чем в апосимбиотичных (т.е. без хлореллы). Уровень окислительного стресса был определен путем оценки активных форм кислорода (АФК) с двумя флуоресцентными зондами (гидроэтидин и дигидроэргодамин123) с помощью проточной цитометрии в экспоненциальной и стационарной фазах роста обоих штаммов. Результаты показали, что апосимбиотические инфузории имели более высокие уровни PAR-индуцированного окислительного стресса, чем симбиотические. После воздействия ультрафиолетового излучения, апосимбиотические инфузории в стационарной фазе имели самые высокие уровни АФК, несмотря на увеличение активности SOD. Напротив, в результате воздействия ультрафиолетового излучения снизилась активность каталазы в обоих штаммах. окислительный стресс эукариотический генный

В работе «Identification of Two Nickel Ion-Induced Genes, NCI16 and PcGST1, in Paramecium caudatum» рассмотрено токсичное действие ионов никеля на культуру клеток P.caudatum, а также воздействие никеля на внутриклеточное накопление АФК в парамециях. Воздействие 10 мкМ NiSO4 вызывало значительное увеличение концентрации H2O2 в P.caudatum [17].

В статье «A lecture note on the effect of antioxidant compounds on oxidative stress in unicellular aquatic organisms» описан токсичный эффект вызванный воздействием солей тяжелых металлов и перекиси водорода, индуцирующей перекисное оксиление липидов, который был изучен на культуре клеток Paramecium caudatum. Окислительный стресс был индуцирован хлоридом кадмия, ацетатом свинца и перекисью водорода (H2O2). Эффект токсичных агентов был изучен в нескольких концентрациях (0.05, 0.025, 0.005, 0.0025 и 0.00125 мг/л); эффект веществ со свойствами антиоксидантов (аскорбиновая кислота, пирацетам) был изучен в концентрациях 1, 10, 50 мкМ, и 1 мМ. В результате эксперимента с данными концентрациями токсичсеких агентов, действующих на культуру клеток инфузорий в течение 24 часов, значительная часть клеток выживала. Через 5 дней парамеции, инкубированные в перекиси водорода, погибли.

Авторы исследования также выяснили, что антиоксидантное действие пирацетама было менее выражено, по сравнению с защитным действием аскорбиновой кислоты. Тем не менее, на 15-й день живучесть видов с инъекцией пирацетама в среде с инфузориями достигла 100% [15].

Основным направлением работы «Effect of novel phosphoramidate on growth and respiratory metabolism of Paramecium aurelia» была разработка простого и надежного метода оценки для определения токсического действия инсектицидов в лабораторных условиях. В ходе эксперимента клетки культуры P. Aurelia подвергали воздействию Phosphoramidate В. После 18 ч воздействия сильнейшей концентрации токсичного агента (4 и 8 мкм) наблюдалось значительное замедление дыхательной активности клеток. Это доказало,что Phosphoramidate B создает окислительный стресс [13].

Результаты изученных статей показывают, что в ответ на окислительный стресс в клетках парамеций повышается активность ферментов антиоксидантной защиты (SOD, CAT,GSH,GST и др.), что, в свою очередь, вызвано экспрессией генов, кодирующих данные ферменты.



Глава 2. Методология биоинформационного анализа

На основе анализа литературы, результаты которого приведены в первой главе, для отбора генов, которые могут быть вовлечены в регуляцию клеточного ответа на окислительный стресс, были выбраны следующие критерии выбора генов из информационных источников:

1. Наличие точной информации об участии гена в регуляции окислительного стресса у эукариотических организмов.

2. Белок-фермент, который кодирует данный ген, имеет высокую частоту встречаемости в описании процессов окислительного стресса, как у высших, так и у простейших животных.

3. Наличие непосредственных подтверждений того, что данный ген снижает патогенное действие окислительного стресса у инфузорий.

Поиск генов, имеющих отношение к проблеме, и кодируемых ими белков осуществлялся в следующей последовательности:

- Выбор смысловой группировки (oxidative stress, response to oxidative stress, oxidative stress in ciliates, oxidative stress Paramecium caudatum, antioxidant protection);

- Формирование выборки белков-ферментов, участвующих в окислительном стрессе и преобразование ее в выборку генов, кодирующих данные белки;

- Переход к Uniprot и функциональная аннотация выбранных генов (биологическая функция и регуляция);

- Последующий анализ генов с помощью различных биоинформационных инструментов.

Для биоинформационного анализа было сформировано четыре группы генов:

1. гены непосредственно P. caudatum

2. гены родственных парамеций (P. tetraurelia).

3. гены других организмов (неродственных)

4. гены, для которых не имеется достаточной информации или она противоречива.

Для биоинформационного поиска генов и кодируемых ими белков были использованы:

1.библиографические базы данных: HighWire Press (HighWire), PubMed, PubMed Central (PMC), Europe PubMed Central (Europe PMC), National Center for Biotechnology Information (NCBI;

2.базы данных первичных последовательностей: European Molecular Biology Laboratory (EMBL) , GeneBank ;

3.банки белковых последовательностей: UniProt;

4.инструменты поиска гомологов: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), HomoloGene.



Глава 3. Результаты исследования

В результате биоинформационного поиска все найденные гены P.caudatum, достоверно или предположительно участвующие в регуляции ответа на окислительный стресс, были разделены на четыре группы:

1. Гены, для которых достоверно установлено изменение их экспрессии в ответ на окислительный стресс [Таблица 1];

2. Гены, для которых у близкородственных видов достоверно доказана их вовлеченность в регуляцию ответа на окислительный стресс [Таблица 2];

3. Гены, для гомологов которых у неблизкородственных организмов достоверно установлено участие в регуляции исследуемого клеточного ответа [Таблица 3];

4. Гены, для которых достоверно известно об их участии в клеточном ответе на окислительный стресс, но информация недостаточна или противоречива [Таблица 4].

I группа генов

Таблица 1

Ген	Обозначение продукта гена	Функция	Как изменяется экспрессия	Индуктор	Ссылка
PcGST1	Glutathione -S-transferase	Защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ с помощью их восстановления, присоединения к субстрату молекулы GSH.	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента	H2O2	1. "Identification of Two Nickel Ion-Induced Genes, NCI16 and PcGST1, in Paramecium caudatum." Takenaka Y.
cox1	Cytochrome c oxidase subunit 1	Катализирует восстановление кислорода до воды. 4 ferrocytochrome c + O2 + 4H+=4 ferricytochrome c + 2 H2O	Повышается, оценка экспрессии по мРНК	АФК	1. "The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium." Barth D.,
cox2	Cytochrome c oxidase subunit 2	Активность цитохром- с-оксидазы. Первая линия обороны клетки от токсического действия активных форм кислорода идёт за счёт цитохром-с-оксидазы, которая осуществляет восстановление кислорода до воды.	Повышается	АФК	1."The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium." Barth D., Berendonk T.U.

II группа генов

Таблица 2

Обозначение гена в близкородственном организме	Обозначение продукта гена	Вид организма	Функция	Как изменяется экспрессия
GSPATT00035687001	Superoxide dismutase	Paramecium tetraurelia	Уничтожает радикалы, которые, как правило, производится внутри клеток и которые являются токсичными для биологических систем. Каталитическая активность 2 superoxide + 2 H+= O2 + H2O2	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента
GSPATT00011189001	Glutathione peroxidase	Paramecium tetraurelia	Молекулярная функция: - активность глутатион пероксидазы Биологический процес: ответ на окислительный стресс.	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента
GSPATT00017256001	Catalase	Paramecium tetraurelia	Встречается почти во всех аэробных организмов и служит для защиты клеток от токсического действия перекиси водорода 2 H2O2 = O2 + 2 H2O	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента
GSPATT00025534001	Peroxiredoxin	Paramecium tetraurelia	Активность пероксидоксина, катализ реакции 2 R'-SH + ROOH = R'-S-S-R' + H2O + ROH.	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента.

III группа генов

Таблица 3

Обозначение гена	Обозначение продукта гена	Ген - гомолог в неблизко-родственном организме	Вид организма	Функция	Как изменяется экспрессия
GSPATT00033095001	Proteinkinase	Oxsr1	Rattus norvegicus (Крыса)	Любой процесс, который инициирует активность неактивной протеинкиназы. При окислительном стрессе протеинкиназы опосредованно влияют на реализацию программы апоптоза, участвуя в регуляции продукции ряда цитокинов.	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента.
GSPATT00025998001	Glutaredoxin	Glrx	Mus musculus (Мышь)	Активность протеин-дисульфид редуктазы (глутатион)	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента
EPI24	сeruloplasmin	Cp	Rattus norvegicus (Крыса)	Является важным компонентом регуляции обмена и образования свободных радикалов. Регулирует активность феррооксидазы,катализ реакции: 4 Fе+ 2 + 4 Н+ + О2 = 4 Fе+ 3 + 2 Н2О.	Повышается, оценка экспрессии по изменению активности фермента.
GSPATT00010402001	?	Nfe2l2	Mus musculus (Мышь)	Центральный регулятор системы ответа на окислительный стресс	Повышается, оценка экспрессии по мРНК

IV группа генов

Данные представляют собой перспективную группу генов, которые подходят для дальнейшего планирования других исследований.

Таблица 4

Обозначение гена	Продукт гена	Функция
stk2 homolog	Serine/threonine protein kinase 2 homolog	Активность серин/треонин протеинкиназы. Регулирование транскрипции РНК-полимеразы II способствует ответу на окислительный стресс
cob	Apocytochrome b	Активность оксидоредуктазы
nad9	NADH dehydrogenase subunit 9	Активность оксидоредуктазы
NCI16	Предположительно кодирует 4-трансмембранный домен белка (?16 кДа) неизвестной функции	?*

?* - в настоящий момент отсутствуют полные данные по рассматриваемому параметру



Заключение

В работе была исследована зависимость экспрессии генов P. caudatum от воздействия на клетку активных форм кислорода, порождающих окислительный стресс, произведен поиск таких генов и последующий анализ. В результате было выявлено 15 генов, достоверно и предположительно участвующих в регуляции клеточного ответа P.caudatum на окислительный стресс.

Все гены были сформированы в четыре группы:

1. В первую группу вошли гены: cox1, cox2, PcGST1, - эти гены находятся в геноме P.caudatum, и изменение их экспрессии в ответ на окислительный стресс подтверждено научными исследованиями.

2. Во вторую группу вошли гены: GSPATT00035687001, GSPATT00025998001, GSPATT00017256001, GSPATT00025534001, - все эти гены были выявлены в геноме близкородственного организма -Paramecium tetraurelia, их гомологи с высокой вероятностью присутствуют в геноме P.caudatum. Для данных генов достоверно известно их участие в регуляции клеточного ответа на окислительный стресс.

3. Третья группа содержит гены P. tetraurelia, для гомологов которых у неблизкородственных организмов достоверно установлено участие в регуляции исследуемого клеточного ответа: GSPATT00033095001, GSPATT00025998001, EPI24, GSPATT00010402001.

4. Для генов, определенных в четвертую группу, достоверно известно об их участии в регуляции ответа на действие окислительного стресса в клетках P.caudatum, но не имеется достаточной информации о них либо она противоречива: stk2 homolog, cob, nad9, NCI16.



Список использованных источников

1. Гуськов, Е.П. Генетика окислительного стресса / Е.П. Гуськов, Т.П. Шкурат, Т.В. Вардуни, Е.В. Машкина, И.О. Покудина, Е.И. Шиманская, Г.Е. Гуськов, Н.И. Беличенко, А.А. Александрова. - Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВЩ ЮФУ, 2009.- С. 156.

2. Использование тест-объектов в токсикологическом эксперименте // Учебные издания ВГУЭС от 03.01.16.

3. Кузнецов, А.Е. Научные основы экобиотехнологии / А.Е. Кузнецов, Н.Б. Градова. - М.: Мир, 2006. - С. 504.

4. Пименов, А.Ю. Регуляция транскрипции белоккодирующих генов макронуклеуса инфузорий-спиротрих / А.Ю. Пименов, И.Н. Сковородкин, И.Б. Райхель, С.О. Скарлато // Цитология. - 2008. - Т. 50, N 10. - С. 835-842.

5. Чупахина, Г. Н Природные антиоксиданты (экологический аспект) / Г.Н. Чупахина, П.В. Масленников, Л.Н. Скрыпник. - Калининград: Изд-во БФУ им. И. Канта, 2011. - C. 111.

6. Шарова, И.Х. Зоология беспозвоночных. М.: ВЛАДОС, 2002. - 591 c.

7. Amamra, R. Cypermethrin-Induces Oxidative Stress to the Freshwater Ciliate Model: Paramecium tetraurelia / Ryma Amamra, Mohamed Reda Djebar, Nedjoud Grara, Ouissem Moumeni, Hadjer Otmani, Amel Alayat, Houria Berrebbah. // Annual Research & Review in Biology. - 2015. - Article no.ARRB.2015.042. - P. 385-399.

8. Barth, D. The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium / Dana Barth, Thomas U Berendonk. // BMC Genomics. - 201. - P. 272.

9. Croute, F. Studies on catalase, glutathione peroxidase and superoxidismutase activities in aging cells of Paramecium tetraurelia / F. Croute, S. Vidal, D. Dupouy, J.P. Soleilhavoup, G. Serre // Mechanisms of Ageing and Development. - 1985. -Volume 29, Issue 1. - P. 53-62.

10. Gertler, C. A mesocosm study of the changes in marine flagellate and ciliate communities in a crude oil bioremediation trial. Microbial ecology / C. Gertler, D.J. Nдther, G. Gerdts, M.C. Malpass, P.N Golyshin. 2010. - P.180-191.

11. Hцrtnag, P. H. Photo-oxidative stress in symbiotic and aposymbiotic strains of the ciliate Paramecium bursaria / Paul H. Hцrtnagla, Ruben Sommaruga. // Photochem. Photobiol. Sci., 2007. - P. 842-847.

12. Houneida B. Effect of novel phosphoramidate on growth and respiratory metabolism of Paramecium aurelia / Benbouzid Houneida, H. Berrebah, M. Berredjem, M.R. Djebar. // Journal of Natural Science, Biology and Medicine. - 2012 Jan-Jun. - P. 48-51.

13. Hybertson, B.M. Oxidative stress in health and disease: The therapeutic potential of Nrf2 activation / Brooks M. Hybertson, Bifeng Gao, Swapan K. Bose, Joe M. McCord. // Molecular Aspects of Medicine. - 2011. - Volume 32, Issues 4-6. - P. 234-246.

14. Karpukhina, O.V. A lecture note on the effect of antioxidant compounds on oxidative stress in unicellular aquatic organisms / O.V. Karpukhina, K.Z. Gumargalieva, A.N. Inozemtsev. // Physics and Chemistry of Classical Materials. - Apple Academic Press, 2014. - P. 21-26.

15. Takenaka, Y. Identification of Two Nickel Ion-Induced Genes, NCI16 and PcGST1, in Paramecium caudatum / Yasuhiro Takenaka, Nobuyuki Haga, Ikuo Inoue, Takanari Nakano, Masaaki Ikeda, Shigehiro Katayama, Takuya Awataa. // Eukaryot Cell. - 2014 Sep. - P. 1181-1190.

Размещено на Allbest.ru

...