Трансгенные и химерные организмы

По признанию многих авторитетных ученых всего мира XXI века. будет веком биотехнологии и генетики. Однако не следует думать, что биотехнология -- детище лишь современной науки.

История взаимоотношений человека и природы -- это извечная история попыток человека изменить геномы растений и животных в нужную ей сторону. Даже тогда, когда человек не имел ни малейшего понятия о существовании наследственных факторов, интуитивно путем гибридизации и селекции организмов с нужными свойствами. Она меняла наследственность животных и культурных растений.

Все современные сорта фруктов, овощей, злаков, ягод имеют измененные геномы, то есть не те геномы, которые имеют их дикие предки, если они уже вымерли.

До середины XX века. селекционерам приходилось ждать, когда случайные комбинации генов дадут полезные свойства, потом отбирать такие организмы и закреплять нужные комбинации генов в потомстве. В первой половине XX века. появились методы, благодаря которым стало возможно искусственно получать большое количество случайных мутаций (например, с помощью облучения радиацией или действия химических мутагенов), чтобы потом отбирать из мутантов организмы с наиболее ценными свойствами. Современные генетические технологии пошли еще дальше. Они дают возможность получить желаемый результат гораздо быстрее и при этом избежать множества промежуточных и побочных форм, поскольку современная наука и технология способны изменять геном целенаправленно. Это удается благодаря генно - инженерным технологиям, с помощью которых можно взять определенные структурные гены из генома одного вида и ввести их в генетический аппарат другого вида, вызвав таким образом в этом организме синтез нужного человеку белка.

Биотехнология -- дисциплина, изучающая возможности использования живых организмов для решения технологических задач. Она использует знания генетики, молекулярной биологии, биохимии, эмбриологии, клеточной биологии, а также прикладных дисциплин -- химической, физической и информационной технологий, робототехники.

Термин биотехнология в 1917 г. предложил венгерский инженер К. Ерекі, когда описывал процесс производства свинины.

Одним из наиболее перспективных направлений биотехнологии считают генную инженерию -- манипуляции с генетическим аппаратом и определенными генами, позволяющие с помощью молекулярно-биологических методов искусственно конструировать новые генотипические комбинации или даже образовывать новые геномы.

Наиболее молодое направление современной биотехнологии -- получение трансгенных организмов, то есть организмов, которые содержат трансгены (от лат. транс -- через и греч. генос) -- гены бактерий, грибов, растений или животных, чужеродные для данного вида организмов. Живые организмы, измененные благодаря генно-инженерным манипуляциям, получили название генетически модифицированных организмов (ГМО). Ценность генной инженерии в том, что ее методы помогают осуществить давнюю мечту селекционеров: придать организму признаки, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами.

Генная инженерия родилась в 1972 г. в Стэнфордском университете в США, когда Пол Берг впервые объединил в пробирке фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и обезьяньего вируса. Полученная рекомбинантная ДНК была введена в бактерию, стала первым трансгенными организмом.

Ещё одна область современной биотехнологии -- клеточная инженерия. В отличие от генной инженерии, которая конструирует новые рекомбинантные ДНК, клеточная инженерия создаёт рекомбинантные клетки и их культуры.

1.Создание химер. История метода

Предположение о том, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, было высказано еще в начале ХIX века в связи с открытие многоядерных клеток. В историческом аспекте представляет интерес то обстоятельство, что открытие поликарионов как бы подтверждало ошибочное представление Шлейдена, который считал, что новые клетки зарождаются в виде пузырьков внутри цитоплазматической мембраны родительских клеток. Разделявший эту точку зрения Рудольф Вирхов представил в 1851 г. рисунок многоядерной опухолевой клетки в полной уверенности, что ядра являются эндогенными зачатками новых клеток. Кроме того, открытие поликарионов подлило масла в огонь борьбы с клеточной теорией. Противники ее выдвинули гипотезу, согласно которой организм представляет собой единую тканевую массу с непрерывной цитоплазмой, а существование поликарионов рассматривали как подтверждение этой гипотезы. Со временем восторжествовала клеточная теория, а существование поликарионов отнесли к разряду интересных исключений.

Гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах нашего столетия. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Исходные линии отличались по числу и морфологии хромосом, а также по способности к образованию опухоли при введении их мышам. Гибридные клетки содержали число хромосом, отличное от исходных клеточных линий, а также содержали поверхностные антигены клеток обеих родительских линий. Далее было установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных. В качестве агента, индуцирующего слияние выступал инактивированный вирус HVJ, называемый также вирусом Сендай. С этих пор вирус Сендай стал широко использоваться в экспериментах по слиянию клеток.

При изучении межвидовых гибридных клеток, способных к пролиферации были сделаны два очень важных наблюдения:

- в гибридах могут проявиться оба генома;

- в долгоживущих межвидовых гибридах элиминируются хромосомы одного вида.

Слияние клеток не обязательно должно быть чем-то стимулировано. Как in vivo, так и in vitro оно может проходить и без добавления специальных агентов. Несмотря на то, что все слияния такого рода можно считать спонтанными, некоторые из них постоянно происходят в процессе онтогенеза, а следовательно, эволюционно запрограммированы. До сих пор нерешенной остается одна из труднейших загадок биологии, состоящая в том, что мембраны, находящиеся внутри клетки сливаются часто, тогда как мембраны, разграничивающие клетки, сливаются редко. Например, пузырьки аппарата Гольджи сливаются друг с другом, образуя клеточные пластинки при цитокинезе у растений, мембраны эндоплазматического ретикулума - с элементами аппарата Гольджи при переносе вновь синтезированных белков и т.д.

В то же время нормальные клетки в естественных условиях крайне редко сливаются друг с другом. Исключение составляет процесс оплодотворения. Кроме того, в качестве подобного рода исключения выступает процесс плазмогамии у высших грибов, когда одноядерные гаплоидные клетки сливаются, образуя двуядерные (дикарионы). Такие клетки размножаются митотически, оставаясь двуядерными, и в результате образуют всем хорошо известные плодовые тела.

В естественных условиях слияние клеток происходит и у млекопитающих. Например, клетки могут сливаться при формировании мышечных трубочек. Еще в XIX веке было показано, что миофибриллы поперечно-полосатых мышц образуются в поликарионах - крупных удлиненных многоядерных клетках. Поликарионы - продукт слияния одноядерных миобластов. Слияние опухолевых клеток - довольно обычное явление, при этом опухолевые клетки in vivo иногда сливаются и с нормальными. Эксперименты по спонтанному слиянию клеток проводились и in vitro. При проведении подобных экспериментов получают так называемых "химерных" или аллофеных мышей - животных, в тканях которых содержатся клетки различных генотипов (Рис. 1)

Рис. 1 Получение аллотрофных мышей

Методы создания химер

1. Агрегационный - был предложен практически одновременно и независимо друг от друга Тарковским в Варшаве и Минц в Филадельфии (1961-1962 гг.).

Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши, достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух животных с различными генотипами (например, от мышей с белой черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т.е. состоят из "белых" и "черных" клеток.

Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными. Такие белки называются изоферментами, и их можно разделить с помощью электрофореза. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.

2. Инъекционный - был разработан Р. Гарднером в 1968 г.

Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.

Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: M. muskulus и M. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту M. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона M. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку M. muskulus и благополучно развивались там, а в организме M. caroli погибали спустя две недели.

Межвидовые химерные зародыши между мышью и крысой путем агрегации были получены только в 70-х годах. Первые химерные животные были получены только в 1973 году Р. Гарднером и М. Джонсоном. Успех этих экспериментов позволил приступить в 80-х годах к созданию химерных сельскохозяйственных животных. Выяснилось, что агрегационный метод неприемлем для получения химер крупного рогатого скота. Химер телят Bos indicus + Bos taurus удалось получить только инъекционным методом.

В 1984 году были получены межвидовые химеры между овцой и козой - овцекозы, причем практически одновременно в Англии и ФРГ. Использовались оба метода. Половым путем овцы и козы не скрещиваются, так как имеют разный набор хромосом: коза 2n = 60, овца 2n = 54. В ФРГ в 1985 году были получены химерные телята после агрегации половинок 32-клеточных эмбрионов от коров швицкой (бурой) и голштино-фризской пород. В фенотипе химер сочетались обе масти - бурая и черно-пестрая.

Химерные животные не передают потомкам генетическую мозаичность. У них происходит расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются. Но на протяжении 1 поколения хозяйственно ценные признаки поддерживаются, поэтому можно, например, сочетать как молочную, так и мясную продуктивность.

Химерность довольно часто встречается и у растений. Как правило, она существует в скрытом виде, не проявляясь фенотипически. Однако пластидные мутации позволяют увидеть ее непосредственно на растении. Чаще всего спонтанная химерность наблюдается у гетерозиготных растений. Различные клеточные типы четко разделены в пространстве, образуя отдельные слои при делении апикальных меристем. Примером видимой мутации хлоропластов и образования химерного растения является пестролистность или появление секторов ткани другого цвета.

Трансгенные организмы

Трансгенный организм -- живой организм, в геном которого искусственно введен ген другого организма.

Ген вводится в геном хозяина в форме так называемой «генетической конструкции» -- последовательности ДНК, несущей участок, кодирующий белок, и регуляторные элементы (промотор, энхансер и пр.), а также в некоторых случаях элементы, обеспечивающие специфическое встраивание в геном (например, т. н. «липкие концы»). Генетическая конструкция может нести несколько генов, часто она представляет собой бактериальную плазмиду или ее фрагмент.

Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена).

Создание трансгенных организмов используют:

· в научном эксперименте для развития технологии создания трансгенных организмов, для изучения роли определенных генов и белков, для изучения многих биологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получили трансгенные организмы с маркерными генами (продукты этих генов с легкостью определяются приборами, например зелёный флуоресцентный белок, визуализируют с помощью микроскопа, так легко можно определить происхождение клеток, их судьбу в организме и т. д.);

· в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных;

· в биотехнологическом производстве плазмид и белков.

В настоящее время получено большое количество штаммов трансгенных бактерий, линий трансгенных животных и растений. Близко по смыслу и значению к трансгенным организмам находятся трансгенные клеточные культуры. Ключевым этапом в технологии создания трансгенных организмов является трансфекция -- внедрение ДНК в клетки будущего трансгенного организма. В настоящее время разработано большое количество методов трансфекции. В русской научной литературе существовали попытки ввести термины «трансгенез», «трансгеноз» и «трансгенология» для технологии создания трансгенных организмов и соответствующей области знания, но эти термины используются редко.

Близко по значению к термину «трансгенный организм» стоит термин «трансфицированный организм» -- организм, в клетки которого был осуществлен перенос гена другого организма. Этот термин иногда используют, когда акт трансфекции осуществлен, но экспрессия нового гена отсутствует. Также этот термин используется для описания организма, в часть клеток которого введена генетическая конструкция (например, введение ДНК в один из органов взрослого животного, в этом случае новый ген не будет передан потомству, а его экспрессия зачастую носит временный характер).

Близко по значению к термину «трансгенный организм» стоит термин «Генетически модифицированный организм», но это понятие шире и включает в себя не только трансгенные организмы, но и организмы с любыми иными изменениями генома.

Первые генетически модифицированные организмы, полученные с помощью методов молекулярной биологии, появились на свет только в 80-х годах XX века. Ученые сумели изменить геном растительных клеток, добавляя в них необходимые гены других растений, животных, рыбы и даже человека.

Первый трансгенный организм (мышь) был получен Дж. Гордоном с сотрудниками 1980 г. На начале 90-х годов в Китае было проведено первое коммерческое испытания генетически модифицированных сортов табака и томатов, устойчивых к вирусам. А в 1994 г. в США впервые поступили в торговую сеть продуктов питания плоды генетически измененных томатов с сокращенным сроком созревания.

В ряде экспериментов было установлено, что мыши, развивающиеся из зиготы, в которую была введена чужеродная ДНК, содержат в своем геноме фрагменты этой ДНК, а иногда у них происходит и экспрессия чужеродных генов (Рис. 2).

Рис. 2 Получение трансгенных организмов

биотехнология химера природа

Получение трансгенных животных

Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген или гены. Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свойства потомкам. У растений и животных целесообразно изменять такие свойства, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям, способность адаптироваться к новым внешним условиям. В качестве маркеров в этом случае можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (AFLP), анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной ДНК (SSR), гибридизацию и т.д.

Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. От работы с довольно крупными яйцами амфибий перешли к изучению яйцеклеток и эмбрионов мыши, которая представляет наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее.

Микроинъекцию клонированных генов производят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген в-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер - от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 - 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Интеграция чужеродных генов неспецифична по отношению к хромосомам, а число копий чужеродного гена может различаться от нескольких штук до 100 и более. Эти гены образуют группу тандемных повторов, объединенных по типу "голова к хвосту". Чужеродная ДНК после инъекции была обнаружена как в соматических, так и в половых клетках. Это означает, что интеграция проходит на самых ранних стадиях развития зиготы.

В нескольких случаях гетерологичная ДНК наследовалась в трех поколениях мышей, что свидетельствует о стабильной интеграции. Интегрировавшая в половые клетки ДНК передается как менделевский ген. Установлено, что уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с хромосомами и от степени ее метилирования, а также от дифференцировки тканей. В некоторых случаях удалось получить тканеспецифическую экспрессию. Важно отметить что специфические чужеродные гены можно встраивать в геном клетки таким образом, что они подчиняются нормальным регуляторным сигналам.

В 1981 году Константини и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию в яйцеклетки мыши фрагменты хромосомной ДНК кролика длиной 19 килобаз. Эти фрагменты содержали ген в-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали до стадии бластоцисты и имплантировали в матку. У 24 мышей, родившихся в результате развития имплантированных яйцеклеток, проведены частичная гепатоэктомия. Анализ ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей встречается от 1 до 20 копий на клетку гена в-глобина. После спаривания 4 трансформированных самцов с нормальными самками получили потомство из 18 животных. 6 из них также имели ген в-глобина. Установлено, что интеграция гена в клетки млекопитающих происходит случайным образом и не связана с конкретными областями хромосомы. Ген нестабилен, может быть утрачен или стать неактивным. Вместе с геном необходимо вводить регуляторные последовательности.

Метод введения генов в эмбриональные клетки имеет ограничения. Не всегда удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы. Разработанные методические примы пока не позволяют заменить имеющийся в геноме ген, вытесняя его, не всегда удается подчинить новый ген системе регуляции организма.

При трансгенозе могут возникать неожиданные проблемы. Например, одни из первых работ по генетической транформации животных проводились путем встраивания генов гормона роста. Перенос гена гормона роста крысы мышам увеличивал рост мышей в 2 раза. Эксперименты по трансгенозу генов гормона роста быка кроликам также увенчались успехом. А вот аналогичные эксперименты по модификации крупного рогатого скота привели к увеличению прироста всего на 10-20%. Очевидно, это связанно с тем, что у мышей сохраняется широкая норма реакции, и встраивание генов, увеличивающих количество гормона, заставляет генотип реализоваться максимально полно. У домашнего скота в результате направленной селекции организмы работают на верхнем пределе нормы реакции, отсюда ожидаемый эффект не проявился.

В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. Такие трансгенные свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке (животное-ферментер). Уже получены трансгенные коровы, в молоке которых содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируют применять для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью. Это больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию. Ведутся клинические испытания такого молока. Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота, содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани (фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого белка. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную яйцеклетку рождается от только 5 - 10% трансформированных животных, из них - несколько самцов, не дающих молока.

Использование новой технологии клонирования позволяет получать животных только женского пола, дающих трансгенный протеин. Альбумин используется в терапии для поддержания осмотического давления в крови. Ежегодно в мире требуется около 440 тысяч литров плазмы крови для выделения этого белка (стоимость около 1,5 млрд. $). Каждая молочная корова может произвести 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина ежегодно. Genzyme Transgenics занимается разработкой аналогичных методов получения человеческого гормона роста и в-интерферона.

В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови.

В нашей стране были попытки создать овец, продуцирующих химозин (фермент для сыроварения). Было получено 2 овцы, у одной - ген не экспрессировался, у второй содержание химозина достигало 300 мг/л. Однако потомство этой овцы давало низкие удои - порядка 50 кг за период лактации. Причина заключалась в том, что химозин вырабатывается в виде предшественника - прохимозина, который превращается в активный фермент при рН=5. Было запланировано получать именно прохимозин, но в каких-то участках вымени происходило снижение рН, что приводило к активации химозина непосредственно в организме. Активный химозин свертывал молоко, а оно закупоривало протоки вымени. Сейчас пытаются решить эту проблему.

В Подмосковье получены кролики, выделяющие г-интерферон, эритропоэтин, но кролики не являются традиционными продуцентами молока. Эксперименты же по трансформации сельскохозяйственных животных очень дорогостоящи - одно трансгенное животное стоит десятки и сотни тысяч долларов.

Трансгенных животных получают и для целей ксенотрансплантации. Одним из излюбленных доноров органов являются свиньи, так как имеется анатомическое сходство органов и сходство иммунологических свойств. Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.

Еще одно направление трансгеноза - получение устойчивых к болезням животных. Животноводство держится на вакцинах, так как селекция ведется преимущественно на хозяйственно ценные признаки - шерстистость, молочность и т. д. Повышение устойчивости - дело генных инженеров. К защитным белкам относятся интерфероны, поэтому ген интерферона встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость, они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Другое направление - введение генов, кодирующих антисмысловую РНК. Для животноводства острой проблемой являются лейкозы, вызываемые РНК-вирусами. Трансгенные кролики, несущие гены, отвечающие за присутствие в клетке антисмысловой РНК, были устойчивы к лейкозам.

Трансгенных животных можно использовать для изучения наследственных заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка в-амилоида приводит к образованию характерных бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические приемы.

Трансгенных животных стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например, ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом.

Заключение

биотехнология химера природа

1.Генетика с основами селекции [Текст] : учеб. для студ вузов/ С.Г. Инге-Вечтомов. - 2-е изд.. - Спб. : Изд-во Н-Л. 2010. - 718 с.

2.Биохимия [Текст] : учебник / В.П. Комов, В.Н. Шведова. - 3-е изд., стер. - М. : Дрофа, 2008. - 639 с.

3.Основы геномики и протеомики: технологии рекомбинантных ДНК первого поколения (генная инженерия) [Текст] : учеб. пособие / В.И. Чемерилова : рец.: Ю.М. Константинов, И.Л. Белькова : Иркутский гос. ун-т биолог.- почв. фак. - Иркутск : Изд-во ИГУ, 2014. - 238 с.

4.Брем, Г., Кройслих, Х., Штранцингер, Г., Экспериментальная генетика в животноводстве [Текст] / Г. Брем, Х. Кройслих, Г. Штранцингер. - М. : РАСХН, 1995. - 326 с.

5.Зиновьева, Н.А., Биотехнология [Текст] / Н. Зиновьева, У. Безенфельдер, С. Мюллер и др. - 1998а. - №1. - С. 3-11.

6.Зиновьева, Н.А., Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве [Текст] / Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Г. Брем. - Дубровицы : 2000. - 128 с.