Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Национальный исследовательский нижегородский национальный университет им. Н.И. Лобачевского

Институт биологии и биомедицины

Кафедра экспериментальной и ядерной биомедицины ННГУ им. Н.И. Лобачевского

Факультет медицинской биохимии

Реферат

по дисциплине "Биофизика"

на тему: "Применение спектрофотометрических методов в биологии"

Выполнила: Попова О.В.

Проверила: Пескова Н.Н.

Нижний Новгород 2019

Введение

Спектрофотометрический метод анализа

Молекулы, имеющие одинаковую связь и образующие одну группу, в ИФ области выдают полосы поглощения соответствующей характеристической частоты. Данные характеристические частоты помогают определить по получаемому спектру имеющиеся в исследуемой взвеси наличие искомых групп атомов или молекул.

Делят спектрофотометрию: на молекулярную, когда искомое вещество молекулярная структура, и атомную. В зависимости от длин волн, которые способен различить прибор, и веществ, которые надо будет определять, выбираются спектрофотометры.

Для внесения поправок на законы преломления и рассеяния в некоторых устройствах, проводят измерение взвеси (раствор с исследуемым веществом) и раствора. Когда луч света проходит через взвесь, то в зависимости от поглощающих свойств вещества, происходит его ослабление. Интенсивность ослабления луча имеет зависимость от содержания вещества во взвеси. Более точная зависимость определяется у Бугера-Ламберта-Бера (БЛБ), закон "вещество его толщина - от ослабления линии энергии".

Спектрофотометрическое определение фигурирует во многих областях для разных задач:

1. подтверждает подлинность заявленного элемента/продукта,

2. определяет доброкачественность изготовленного препарата,

3. с его помощью находят радиоактивные элементы в водоемах,

4. количественно оценивает, сколько разных веществ находится во взвеси,

5. различать химические элементы во взвеси.

Применяется в биологических и геологических лабораториях, в целях радиационной безопасности (на АЭС, институтах и т.д.), промышленностях, где требуется знать химический состав продуктов и материалов.

Теоретическая часть

Математическое описание спектрофотометрического метода

Введем понятие коэффициента пропускания Т.

I - интенсивность световой энергии, прошедшей через взвесь,

I0 - через раствор.

Для определения концентрации искомых веществ, спектрофотометры используют оптическую плотность, которая находится как D=-lоg10(T).

Количественно отыскивается концентрация посредством закона БЛБ:

I=I0*10-еlc

С помощью элементарных преобразований легко можно получить, что

lоg10(T)=е*l*c или D= е*l*c.

Обозначения переменных представлены ниже в ограничениях данного закона.

Если в раствор вводят несколько исследуемых элементов, то метод применим и в этом случае. Каждый элемент будет давать свой вклад в общую оптическую плотность по закону сложения:

D=D1+D2+…+Dk.

Закон Бугера Ламберта Бера определяет, что оптическая плотность, линейно связана с концентрацией, а ее график выходит из начала координат. В реальности линейность не всегда наблюдается.

Закон Бугера Ламберта Бера

Чтобы закон полностью выполнялся, должны соблюдаться следующие условия:

1. Излучение должно быть монохроматическим, т.е. длина волны должна быть одинаковой, ей будут просвечивать раствор и взвесь.

2. Молярный коэффициент поглощения (е) зависит от преломляющих свойств сред - как взвеси, так и раствора. Если преломление во взвеси сильнее, то линейный закон не применим. Чем больше коэффициент е, тем более чувствительным будет метод в данном определении.

3. Во время измерений должна быть постоянная температура окружающей среды. Допустимо изменение только в пределах пары градусов.

4. Применяться должен только параллельный пучок света.

5. В процессе измерения спектрофотометром концентрация (с) анализируемого вещества не должна меняться вследствие изменения природы исследуемого вещества. Например, во взвеси не должны молекулы переходить в ионы, в результате диссоциации или кислотно-основной реакции.

6. Стараться избегать возбуждения электронов в атоме (иногда такой способ тоже применяют для анализа, но в классическом применении его избегают), то есть не облучать атомы энергией свыше шестидесяти килоджоулей.

7. Свет должен проходить одинаковый путь (l) при измерении раствора и взвеси.

8. В качестве раствора часто применяют дистиллированную воду.

9. Ограничения спектрофотометрического метода

10. Интенсивнее поглощаются те энергии (длина волны), которые соответствуют энергетическим уровням возбуждения внутренних переходов атомов и молекул: тогда молярный коэффициент поглощения максимален.

11. Метод плохо работает для смеси газов.

12. Ограничения закона БЛБ.

Преимущества спектрофотометрического метода

1. Хорошо подходит для определения состава инертных газов.

2. Работает с низкими концентрациями - различает элементы, если их немного во взвеси.

3. Можно добиться расширенной неопределенности на уровне 0,5-1,%.

4. Применим как для высокого, так и для низкого содержания вещества в растворе.

5. Применим для примесей, ввиду закона сложения.

6. Быстрота определения (если не считать подготовку растворов).

7. Простота.

8. Техническая часть

Спектрофотометрическое исследование требовательно относится к подготовке растворов, как окрашенных, так и чистых. Для того чтобы производить измерения спектров, используют спектрофотометр и фотоколориметр, в которые помещают исследуемые растворы.

Основные части спектрофотометра:

· источник излучения,

· монохроматор (если источник света не может дать монохроматический луч),

· кювета, в которую размещаются растворы и взвеси,

· измерительный прибор.

Получить монохроматический свет можно следующими источниками света:

· непрямым солнечным светом,

· галогенными лампами,

· лазером,

· штифтом Нернста,

· лампой накаливания,

· глобар штифт,

· флуоресцентным излучением.

Спектрофотометрический анализ включает в себя построение градуировочной характеристики по известным образцам, чтобы вывести зависимость C=f(D), соотнесение полученных результатов в последующем. Когда градуировочная характеристика определена, то порядок измерения такой: 1 раствор (является основой при измерениях) - его измерение, 2 добавление в раствор исследуемого вещества,3 добавление красителя. В этом случае, степень окраски взвеси должна прямо зависеть, от концентрации исследуемого вещества, 4 измерение в спектрофотометре окрашенного раствора. Иногда в спектрофотометр вбиты соответствующие базы, и тогда метод не требует градуировочных образцов.

Практическая часть

Спектрофотометрия в биохимических исследованиях

Область применения спектрофотометрических методов в химической или биохимической лаборатории довольно широка. На определении оптического поглощения основаны различные методы количественного анализа аминокислот, белков, коферментов, НАДФ, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и др. соединений. Большая часть методов ферментативного анализа также связано с измерением оптического поглощения. Кроме того, спектрофотометрия может быть использована для установления зависимости между спектрами поглощения различных соединений и их химическим строением, т.е. проведения не только количественного, но и качественного анализа. С помощью спектрофотометрии можно также проводить турбидиметрический анализ, т.е. проводить измерение света, прошедшего через суспензии, эмульсии и коллоидные растворы. В этом случае свет не поглощается, а преимущественно рассеивается, тем не менее уменьшение интенсивности света может быть определено на обычном спектрофотометре. Поэтому спектрофотометрия может быть также использована при анализе клеточных культур, жировых эмульсий, мицелл и других полимерных структур.

В спектрофотометрии выделяют две основные группы методов: абсорбционные методы, в которых количество вещества определяется из его собственного поглощения, и колориметрические методы, в которых используются дополнительны окрашивающие соединения, а интенсивность окраски анализируемого образца оценивают по калибровочной кривой для соответствующего красителя. Для осуществления всех этих методов могут быть использованы одни и те же инструменты.

Количественное определение белков

Измерение концентрации белка в жидких пробах является обычной процедурой во многих научных лабораториях. Точная количественная оценка имеет большое значение для всех экспериментов, связанных с белками во множестве научно-исследовательских тем в области биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии, биологии развития и генетике. Существуют различные методы для количественного определения белка, многие из которых основаны на измерении спектра поглощения белков или белковых комплексов при определённых значениях длин волн.

С помощью спектрофотометрических методов может быть проведено прямое определение белка путём измерения оптического поглощения при 280 нм, основанное на присутствии в составе белка остатков ароматических аминокислот тирозина и триптофана. Этот способ прост и требует очень небольшого объема образца. Кроме того, после измерения образец можно использовать вновь. В то же время чувствительность метода невысокая, измерению мешает присутствие любых веществ, поглощающих в ультрафиолетовом диапазоне, в первую очередь остатков нуклеиновых кислот, чей пик поглощения на длине волны 260 нм в значительной степени перекрывает пик белков при 280 нм. спектрофотометр излучение раствор

Для количественного и качественного определения белка используют также различные цветные реакции, основанные на взаимодействии определенных аминокислотных остатков с окрашивающими соединениями. К наиболее распространённым методам количественного определения белка относятся анализ на основе бицинхониновой кислоты, анализ методом Брэрдфорда и анализ методом Лоури.

Метод на основе бицинхониновой кислоты использует реакции окислениия ионов меди Cu2+ до Cu+ в щелочной среде под действием аминокислот и образование окрашенного комплекса между ионами Cu+ и бицинхониновой кислотой, имеющего пик поглощения при длине волны 562 нм.

Аналитический метод Брэдфорда является одним из самых распространенных методов определения концентрации белка. Метод основан на образовании комплекса между красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 и белками в растворе. Кумасси связывается с главным образом с аргинином, триптофаном, тирозином, гистидином, фенилаланином. Образующиеся комплексы имеют оптическую плотность при 590--595 нм.

Метод Лоури также основан на окислении ионов меди Cu2+ до Cu+ в щелочной среде под действием аминокислот. Далее происходит реакция между ионами меди Cu+ и реактивом Фолина с образованием молибденовой сини, имеющей максимум адсорбции при 500--800 нм.

Количественное определение белка: А) путём измерения абсорбции на длине волны 280 нм; Б) методом Брэдфорда; В) методом на основе бицинхониновой кислоты; Г) методом Лоури.

Ферментативный анализ

Протекание различных химических реакций в биологических системах (в т.ч. ферментативных) сопровождается изменением количественного состава среды, что может быть детектировано с помощью спектрофотометрии. Т.о. метод позволяет исследовать ферментативную активность, а также экспрессию генов, кодирующих ферменты.

Спектрофотометрическое оборудование может быть использовано для определения диапазона действия ферментов (температура, pH), изучения более сложных механизмов, например, механизмов ингибирования, многосубстратных реакций, влияния адсорбции ПАВ на ферментативную активность и осуществления других измерений.

Спектрофотометрический качественный анализ

Спектрофотометрические методы могут быть использованы не только для определения количества вещества в анализируемом образце, но и сама природа вещества. Качественный спектрофотометрический анализ основан на том, что каждое химическое соединение имеет характерный для данного вещества спектр поглощения. Положение и интенсивность пиков поглощения определяются входящими в состав вещества функциональными группами, способными поглощать оптическое излучение (такие группы называются хромофорами). Полученный спектр сопоставляется с полученным при таких же экспериментальных условиях спектром данного соединения, приведённым в научной литературе, или с спектром, полученным для заведомо известного образца. Наличие в исследуемом спектре всей совокупности полос с совпадающими положениями максимумов и другими параметрами говорит о тождественности исследуемого и сравниваемого соединений. При этом, наличие примесей в исследуемом образце может привести к появлению лишних полос или увеличению интенсивности отдельных максимумов.

Список литературы

1. https://lab-test.ru/poleznaya-informatsiya/stati/291-spektrofotometriya-v-biokhimicheskikh-issledovaniyakh

2. Современные методы биофизических исследований / под ред. А.Б. Рубина. - М.: Высшая школа, 1988.

3. Артюхов, В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева. - Воронеж, 1996.

Размещено на Allbest.ru