Особенности влияния гормональных компонентов питательной среды на индукцию новоообразований при получении гаплоидов у рапса в культуре INVITRO

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности влияния гормональных компонентов питательной среды на индукцию новоообразований при получении гаплоидов у рапса в культуре INVITRO

А.И. Сорока

На трех сортообразцах рапса озимого и ярового селекции Института масличных культур изучено действие фитогормонов класса цитокининов и ауксинов на процессы индукции новообразований при получении гаплоидов в искусственных условиях invitro.Показано, что индукция развития микроспор по спорофитному пути может вызываться как цитокининами, так и ауксинами, а также их сочетанием. Наиболее эффективным оказалось совместное действие цитокинина БАП и ауксина 2,4-Д, а также действие одного цитокинина. Использование ауксина НУК было менее результативным по сравнению с 2,4-Д. Состав базовой среды (МС или В₅) оказывал незначительное влияние на частоту индукции новообразований у изученных генотипов.

Ключевые слова: ауксин, цитокинин, морфогенное образование, питательная среда, пыльник, микроспора, рапс.

Введение

Технологии получения константного гомогенного материала, основанные на методах экспериментальной гаплоидии, используются у целого ряда культур. На сегодня такие технологии разработаны более чем для 250 видов растений, принадлежащим к разным семействам (Maluszynskietal2003). Широкий интерес к подобным технологиям обусловлен тем, что применение клеток с одинарным набором хромосом для создания выровненных линий позволяет сделать это существенно быстрее, чем традиционными полевыми методами. Фактически полнаягомозиготность достигается в течение всего одного семенного поколения, что позволяет экономить значительные силы и ресурсы, направляя их на решение других проблем. Более того, у видов с чётко выраженным проявлением самонесовместимости или вегетативно размножаемых, гаплоидия может быть единственным реальным методом получения инбредных линий. Одним из общепризнанных способов для создания константных коммерческих линий сельскохозяйственных культур является метод культуры пыльников и микроспор, при котором используется явление андрогенеза invitro.При этом в работу берут пыльники, в которых микроспоры находятся на определенной стадии развития, поскольку известно, что способность клеток менять тип развития с гаметофитного на спорофитный сохраняется лишь в течение некоторого времени, когда микроспоры находятся, преимущественно, во временном интервале первого пыльцевого митоза (Touraevetal1997).

Однако, несмотря на очевидные преимущества гаплоидной технологии, в промышленном масштабе она применяется для весьма ограниченного числа видов. Это связано с рядом причин, как биологического (длительность цикла развития, уровень плоидности, способ размножения, базовый набор хромосом и прочее), так и технического характера (специальное оборудование, сложности стерилизации, особенности методик культивирования и т.п.). Кроме того, эффективность имеющихся методик формирования новообразований из гаплоидных клеток часто зависит не только от вида используемого растения, но и от особенностей конкретного генотипа, что говорит о, как минимум, неоднозначном влиянии генов на процесс индукции гаплоидных структур. Так, достаточно хорошо известна различная реакция генотипов на культивирование invitroу представителей целого ряда семейств, таких, например, как паслёновые, злаковые, капустные, бобовые и многих других (Zagorska1998; GhasemiBezdi et al 2007). фитогормон метаболизм морфогенез рапс

Процессы морфогенеза и регенерации в культуре invitroподвержены влиянию ряда факторов. Одними из наиболее важных из них являются состав питательной среды и набор используемых фитогормонов (Escandon&Hahne 1991; Chen &Dribnenki 2002).

Регуляторы роста, фитогормоны, как натуральные, так и искусственные, являются главным средством управления онтогенезом растений. Они участвуют в регулировании процессов дифференцировки клеток и клеточных делений, образования тканей и органов, изменения темпов роста и развития, длительности прохождения тех или иных этапов онтогенеза. Поэтому фитогормоны широко применяются при разработке и внедрении самых разных биотехнологических методик, включая процессы, инициирующие формирование гаплоидных структур из генеративных клеток высших растений.

Основными классами фитогормонов, используемыми в биотехнологии растений, в частности при индукции образования гаплоидов, являются ауксины и цитокинины. Другие группы фитогормонов, такие как гибберелины, брассиностероиды, жасмонаты, этилен и т.п., применяются значительно реже.

Механизм действия фитогормонов на клетку достаточно сложен и может иметь различный характер. Во-первых, показано, что фитогормональный сигнал воспринимается специфическими рецепторами, расположенными на поверхности клеточной мембраны. Это изменяет конформационную структуру рецепторного белка, таким образом, передавая сигнал внутрь клетки. В дальнейшем, через ряд последовательных изменений пространственной структуры, активации или ингибирования цепи ферментов, гормональный сигнал достигает генетического аппарата, где вызывает высокоспецифичное изменение активности определенных генов, запускающих те или иные генетические программы.

Не менее важным механизмом можно считать изменение электрического потенциала клеток при действии фитогормонов. Так, они оказывают влияние на электрическую полярность мембран, в частности, на системы первичного активного транспорта, например, посредством изменения активности Н-АТФазы(Opritov et al 1991). Кроме прямого регуляторного влияния это может в значительной степени изменять и сам характер действия фитогормонов.

Понимание особенностей действия фитогормонов осложняется тем, что система гормональной регуляции процессов жизнедеятельности растений многокомпонентна. Это проявляется в том, что на один и тот же физиологический процесс чаще всего оказывает влияние не один, а несколько фитогормонов, охватывая широкий ряд аспектов метаболизма клетки. Изменения могут затрагивать биохимические, биофизические, физиологические стороны морфогенеза,вызывая структурные преобразования самой разной направленности.

В связи с вышесказанным, целью нашей работы было на материале селекции Института масличных культур протестировать набор питательных сред с разным базовым составом и различным соотношением фитогормонов для выяснения закономерностей их влияния на процессы индукции новообразований в культуре пыльников рапса.

Материал и методы исследований

В качестве материала использовали два сортообразца рапса озимого (№ 1 и № 2) и один образец рапса ярового, предоставленные лабораторией селекции рапса Института масличных культур. Отдельные соцветия выдерживали на фоне пониженной температуры 6-8°С несколько суток, а затем в асептических условиях выделяли пыльники с незрелыми пыльцевыми зернами и высаживали на питательные среды. Пыльники сортообразцов озимого рапса культивировали на средах, различающихся как базовым составом, так и составом фитогормонов. В качестве базовых сред использовали среды МС (Murashige&Skoog 1962) и В₅ ^атЬо^ et а1 1968). В базовые среды на основе МС и В₅ добавляли фитогормоны в следующих концентрациях -0,6 мг/лБАП (6-бензиламинопурин), 0,6 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), 0,3 мг/л БАП + 0,3 мг/л 2,4-Д. Пыльники ярового рапса высаживали на питательные среды одного базового состава МС, но различающиеся составом фитогормонов. В качестве фитогормонов использовали 0,6 мг/л БАП, 0,6 мг/л 2,4 Д, 0,4 мг/л БАП и 0,4 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л НУК (а-нафтилуксусная кислота) и 0,1 мг/л 2,4-Д. В каждом варианте культивировали до 300 пыльников. Количество новообразований разного типа на пыльниках учитывали в течение 30-40 дней культивирования. Отличия между вариантами оценивали, используя стандартный ^критерий.

Результаты исследований и их обсуждение

Проведенные исследования показали, что в культуре пыльников рапса на испытанных питательных средах происходит формирование морфогенных структур различного (эмбриоиды и каллус) типа (табл. 1 и 2). Как видно из данных табл. 1, состав базовой среды не оказывал существенного влияния на индукцию новообразований. Это касалось обоих изученных образцов озимого рапса.

Введение в состав питательной среды фитогормонов разного вида позволило обнаружить некоторые закономерности их действия. Так синтетический ауксин 2,4-Д, независимо от состава базовой среды, вызывал формирование новообразований в виде каллусов или эмбриоидов, хотя и с невысокойчастотой. Сходное действие оказывал фитогормон БАПцитокининового ряда. В данном случае частота новообразований была несколько выше, а сами новообразования чаще были представлены эмбриоидами. Однако, наиболее благоприятным для инициации морфогенных структур оказалось совместное действие цитокинина с ауксином. Данная комбинация фитогормонов вызывала образование этих структур с частотой 24,5-14,7% у различных генотипов рапса озимого.

Очевидно, специфика действия цитокининаи ауксина на клеточный метаболизм обусловливает синергизм их влияния на процессы морфогенеза.

Это подтверждается данными и других авторов, обнаруживших еще в первых экспериментах на культуре тканей invitro,что только добавление цитокининов в среду с ауксином вызывало регенерацию побегов при культивировании каллусов табака (Skoog&Miller1957).

Таблица 1

Влияние базовой среды и состава фитогормонов на количество новообразований у рапса озимого (2015-2016 гг.)