Биотехнология на основе растительных клеток, используемые в фармации

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Реферат по биотехнологии

Биотехнология на основе растительных клеток, используемые в фармации

Исполнитель: студентка 4 курса

407 группы Антонец А.А.

ВОРОНЕЖ-2020г

Содержание

Введение

Векторы генетической инженерии растений

Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности

Суспензионная культура

Клональное размножение растений

Культивирование протопластов

Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений

Заключение

Список литературы

растение инженерия средство лекарственный

Введение

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрёл особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии.

Культура клеток высших растений может рассматриваться с трёх точек зрения - как уникальная биологическая система, как модель в физиологии растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологий. Изолированные растительные клетки способны продуцировать ценные для медицины, парфюмерии и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза (вещества не участвующие в основном обмене веществ): алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и т.д. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Использование изолированных культур клеток в селекции, дают возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды. Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получение соматических гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Культура клеток как экспериментально созданная биологическая система интересна сама по себе и является объектом исследования узкого круга специалистов. Как модель, клетки in vitro представляют интерес для многих физиологов и биохимиков растений. Очевидно, что адекватно использовать культуру клеток как модель можно тогда, когда чётко представляешь её свойства, как биологической системы. И, наконец, как инструмент фундаментальных и прикладных исследований. Статус экспериментально созданной биологической системы обусловлен свойственной культурам клеток изменчивостью, наследуемостью возникших изменений, адаптивным отбором и эволюцией. В некотором роде её можно считать микропопуляцией, основное отличие которой от природных популяций - это отсутствие полового размножения особей, т.е. клеток. Можно выделить две принципиальные особенности культуры клеток растений как биологической системы: во-первых, отсутствие организменного контроля развития, и во-вторых - избыточный генетический материал. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватными моделями для исследований различных направленностей, например метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения. И для более глубокого понимания данных процессов и явлений часто используются методы создания биохимических мутантов, гибридных и трансформированных клеток в пределах исследуемой культуры. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях являются преимуществами такого моделирования. В отношении синтеза вторичных метаболитов культуры клеток также обладают рядом достоинств, а именно возможность использования для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год. Тем не менее, проблемы клеточных и молекулярных основ морфогенеза, не говоря уже о механизмах морфогенеза, остаются малоизученными. Прежде всего, это концепция тотипотентности растительной клетки и её влияние на стратегию исследовательской работы с культурой тканей и клеток растений. Постулат этой концепции о первичности внешнего сигнала в морфогенетическом ответе растительной клетки во многом определил экстенсивный характер исследований в области культуры клеток растений. Второй причиной является сложность морфогенетических процессов, которые позволяют моделировать и изучать культуры клеток и тканей. Известно, что в культуре in vitro может осуществляться реализация нескольких морфогенетических программ, а именно зародышевого развития и некоторого органогенеза. Возможность моделирования в культуре in vitro более простых процессов, например гистогенеза и цитодифференцировок представляется затруднительнее. Однако, в рамках исследования эти проблемы вполне преодолимы, при индивидуальной разработке методики и постановки эксперимента.

Клеточная инженерия растений рассматривает различные способы получения клеточных культур, культивирования растительных и животных клеток, выделения изолированных протопластов, биологического конструирования, а также создания экспериментальных ассоциативных систем между культивируемыми клетками высших растений и микроорганизмами.

Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс. Это, прежде всего, следующие технологии: культура семяпочек и зародышей, регенерация растений из тканей летальных гибридов, экспериментальная гаплоидия, криосохранение генофонда, клональное микроразмножение. Клеточная инженерия предлагает новые пути для создания высокопродуктивных форм растений. Это гибридизация соматических клеток, перенос чужеродных генов.

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основным преимуществом такой технологии по сравнению с традиционной селекцией является возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип и значительно ускоряет процесс получения новых сортов растений.

Первое в мире генно-инженерное химерное растение «санбин» получено в США в результате переноса гена запасного белка бобов фазеолина в геном подсолнечника. В 1984-- 1987 гг. получены следующие трансгенные растения: табак, томаты, сельдерей, люцерна, хлопчатник. Внедрение в геном пшеницы генов, детерминирующих животные белки (миозин), может приблизить хлеб по качеству к продуктам животного происхождения.

Введение в растение гена, кодирующего белок тауматин (в 600 раз слаще глюкозы), может улучшить вкусовые качества многих фруктов, не увеличивая содержание углеводов.

Наиболее широко используемый метод трансформации -- агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли -- корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, не нужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, способствующие появлению хозяйственно ценных признаков.

Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, не чувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них рДНК проникают в геном клеток мишени.

Признаки, которые возможно придать растениям с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов, причем их можно разделить на три группы. К первой относится устойчивость к различным факторам окружающей среды -- гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению. Вторая группа представляет интерес непосредственно для потребителей -- модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветов, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-«биофабрики», способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие биологически активные вещества.

ДНК Agrobacterium tumefaciens содержат Ti-плазмиды, вызывающие опухоли растений. В геноме агробактерий имеется Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухолей и синтез опинов. Именно этот участок Ti-плазмиды встраивают в ДНК растений. При реконструкции Ti-плазмид, используемых в генно-инженерных проектах, Т-ДНК области заменяют генами, представляющими интерес для человека. Как правило, это целевой ген устойчивости сельскохозяйственных растений к насекомым-вредителям и селективный, который определяет резистентность к определенным веществам (например, антибиотикам). Встраивание этого гена позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как обычные клетки в ней гибнут. Иногда включают репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например по окрашиванию или свечению в ультрафиолетовом свете.

Процесс селекции генно-инженерных сортов растений заключается в следующем. В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых легче всего регенерировать растения (чаще всего используют меристему). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерий с помощью специальных белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в геном растительной ткани. Затем ее помещают в питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерий перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (каллус), из которых путем клонального микроразмножения регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом -- на полях и в теплицах.

В США выращиваются трансгенные растения рапса, сои, хлопчатника, устойчивые к гербицидам, созданы трансгенные томаты, содержащие гены вируса табачной мозаики, благодаря чему они устойчивы к другим вирусам.

Генно-инженерными методами в геном растения вводятся гены, кодирующие белки, токсичные для многих насекомых. Так получают сорта растений, устойчивые к вредителям. Генетическая инженерия решает проблему искусственной пищи. Уже сейчас в микроорганизмы вводятся гены, управляющие синтезом незаменимых аминокислот, ставится задача создания штаммов дрожжей, бактерий, вырабатывающих пищевые белки, причем культивировать их предполагается на отходах сахарной промышленности.

Клеточная инженерия позволяет получать сорта растений в контролируемых условиях, а также фармацевтические препараты (убихинон-10 -- табак, ятрорризин -- барбарис, шиконин -- воробейник).

Векторы генетической инженерии растений

Основными типами культивируемой растительной клетки являются каллусные и опухолевые клетки. Каллусная ткань появляется у растений в исключительных условиях (травмах) и функционирует непродолжительное время, накапливая питательные вещества для анатомической регенерации.

В настоящее время в генно-инженерных проектах используют векторы на основе Ti-плазмид, транспозируемые элементы и вирусы растений.

Природная Ti-плазмидная система переноса генов в растениях нуждается в модификации, прежде чем она может быть использована. Универсальная векторная система на основе Т-ДНК должна:

а) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции ее в ядерную ДНК растения, а также систему для экспрессии передаваемых в растение генов и маркер, который способствует селекции трансформируемых клеток;

б) характеризоваться простым способом введения чужеродной ДНК в вектор.

При конструировании векторов для введения чужеродных генов в клетки растений в настоящее время используют РНК-содержащие вирусы растений (например, вирус мозаики цветной капусты) и вириоиды, содержащие одноцепочечную низкомолекулярную кольцевую РНК (150--170 кДа), способные реплицироваться автономно от генома реципиента.

При селекции новых генно-инженерных сортов растений используют плазмиды Agrobacterium tumefaciens, ковалентно связанные с хлоропластнои или митохондриальной ДНК. Так получают челночные векторы, которые являются наиболее перспективным направлением надежных, хорошо воспроизводимых результатов по генетической трасформации растений и новых высокопродуктивных сортов, культивируемых в условиях интенсивной агротехники

Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности

Культура изолированных тканей обычно бывает представлена каллусными или опухолевыми тканями. Каллусная культура - это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из недифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные. Каллус может образовываться как на изолированных участках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при повреждении.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зелёного цвета (полная или зональная пигментация антоцианами). Тёмно-коричневая окраска возникает при старении каллусных клеток и вызвана накоплением в них фенолов. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть различной консистенции:

1. Рыхлая, состоящая из сильно оводнённых клеток, легко распадающиеся на отдельные агрегаты.

2. Средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами.

3. Плотная, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Обязательным условием дифференцировки растительной клетки и превращение её в каллусную является присутствие в питательной среде двух групп антагонистических гормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процессы дифференцировки клетки, запуская механизмы активизации вторичных мессенджеров, способствующих растяжению клеточных стенок и дальнейшую пролиферацию, а цитокинины вызывают деление уже дифференцированных клеток. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходим «возврат» к меристематическому состоянию (дедифференцировка). Размножение дифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией митозов, способность к которому была потеряна в процессе дифференцировки.

Эффект, вызываемый действием одних и тех же фитогормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Её компетентность определяется степенью дифференцировки клеток.

Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у однодольных. При переходе дедифференцированной клетки к неорганизованному анархическому размножению, приводящему к образованию каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические изменения. Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл. Через 6--12 ч после индукции дедифференцировки клеточная оболочка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, возрастает число элементов аппарата Гольджи, увеличиваются размеры и число ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые начинаются через 48-72 часа.

Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Каллусную дифференцировку можно назвать вторичной, но её не следует путать с вторичной дифференцировкой клетки, лежащей в основе морфогенеза. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирание каллусных клеток, первичный каллус, возникший на эксплантах, через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду - пассируют. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение нескольких лет.

Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму. Данный график включает пять фаз. Во время первой - латентной фазы увеличения числа и массы клеток не происходит. Клетки в этот период подготавливаются к делению. Вторая фаза - период экспоненциального роста, характеризующаяся наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллусной культуры. Кроме того, рост здесь происходит с ускорением. Третья фаза - линейная, где скорость роста клеток относительно постоянна. Далее наступает фаза замедленного роста, при которой митотическая активность клеток резко снижается. И пятая фаза - стационарная или период деградации. Скорость нарастания клеточной массы здесь равна нулю.

Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальную пролиферацию, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых особей. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза in vitro, регенерация и лежащих в их основы процессов.

Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого-биохимические черты, свойственные нормальным клеткам, входящим в состав растительного организма. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных метаболитов. Морозостойкость и способность к закаливанию присущи каллусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим свойством не обладают каллусные ткани, полученные от тропических и субтропических культур. Таким образом, устойчивость к низким температурам сохраняется при переходе клетки к каллусному росту. Каллусным тканям свойственна и фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности фитохромов. Общим у каллусные и нормальных клеток растения является и еще ряд признаков, в частности, устойчивость к действию высоких температур, осмотически активных веществ, засолению.

Вместе с тем каллусные клетки обладают отдельными свойствами, отличающими их от нормальных. В них появляются специфические белки, и уменьшается количество белков, характерных для фотосинтезирующих клеток листа, или они совсем исчезают. Каллусные клетки отличаются большой генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью.

Опухолевые клетки, в отличие от каллусных, могут расти на питательных средах, лишенных фитогормонов (ауксина, гетероауксина и др.), не образуют нормально организованные вегетативные органы. В некоторых случаях из них могут возникать уродливые органоподобные структуры.

Химический состав каллуса и ткани органа, из которого он получен, различаются незначительно. Поэтому каллус можно культивировать на жидких питательных средах с целью получения различных лекарственных соединений в промышленной технологии.

Регенерация растения из каллуса основана на тотипотентности. Тотипотентность -- это свойство соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития с образованием целого организма. Сущность его состоит в том, что если растительная клетка изолируется, она ведет себя подобно клетке зародышевого мешка, т.е. образует эмбриоид и целое растение.

Тотипотентность культивируемых клеток свидетельствует о том, что генетическая информация сохраняется. Но для ее реализации требуются специфические условия. К факторам, способным полностью или хотя бы частично восстановить замаскированную генетическую информацию, относятся свет, регуляторы роста, предшественники и элементы питания. Стимулирующее действие света на образование вторичных соединений было показано на примере каротиноидов и эфирных масел. Кроме этого важны температура, влажность, освещенность и периодическое обновление питательной среды, так как по мере роста клеток в ней накапливаются продукты метаболизма, что неблагоприятно действует на культуру. Поэтому данная методика связана с пересадками, т.е. с переносом части биомассы на новую питательную среду в другом сосуде («пассажи»). При культивировании растительные клетки имеют более низкие темпы размножения, чем микробиологические объекты, поэтому продолжительность культивирования определяется не десятками часов, а десятками суток.

Метод выращивания клеток in vitro состоит в том, что растительная, выделенная из любого органа растения, ткань (эксплант) помещается на питательную среду, компоненты которой подбираются так, чтобы они поддерживали нормальную жизнедеятельность клетки и стимулировали деление. Поэтому культивировать эти клетки можно только на сложных питательных средах, содержащих соли азота, калия, магния, фосфора и ряд микроэлементов, из органических веществ -- углеводы, аминокислоты, витамины, фитогормоны (кинетин, индолилуксусная кислота).

Среда Мурасиге и Скуга -- наиболее универсальная пригодная для клеток многих двудольных растений. Среда Уайта применяется для андрогенеза в культуре пыльников. Среда Као и Михайлюка используется для культивирования изолированных протопластов. Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Реже используются культивируемые клетки опухолей растений. Клетки опухоли могут делиться на среде без стимуляторов роста, но они не осуществляют в культуре морфогенез и органогенез.

Суспензионная культура

Помимо культур каллусных клеток в научной практике довольно часто применяются культуры клеточных суспензий и культуры единичных (одиночных) клеток. Для начала рассмотрим суспензионную культуру.

Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Суспензионную культуру получают непосредственно из ткани экспланта. Культура состоит из отдельных клеток и агрегатов, отделившихся от первично образованной каллусной ткани. Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание на качалке (90 - 120 об/мин), роллеров различного типа, или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то пролиферация суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани. Также необходимыми условиями поддержания культуры является аэрация, оптимальные температуры (20-30оС), а также определенный объём и физиологическое состояние инокулюма (часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую среду). Минимальный объём инокулюма, необходимый для роста культуры, зависит от вида объекта, фазы роста и состава культуральной среды. При слишком больших объёмах рост клеток в суспензии может ингибироваться из-за накопления токсичных продуктов метаболизма, либо из-за недостатка питательного субстрата.

Начальный момент получения суспензионной клеточной культуры является рандомическим событием. Это означает, что только клетки, которые по ряду причин способны к перестройке метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие» линии. Важными характеристиками иаких линий является высокая степень дезинтеграции (5-10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток.

Морфологическая вариабельность клеток суспензионных культур не слишком высока: встречаются одиночные растянувшиеся клетки, содержащие огромную вакуоль и пристеночный слой цитоплазмы с крупным ядром; клетки меньшего размер, округлые или овальные, в той или иной степени вакуолизированные, с более плотной цитоплазмой, одиночные или образующие агрегаты.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспензирование. Ещё больше облегчает этот процесс добавление в среду пектидазы, способной гидролизировать пектиновые связи в клеточной стенке.

Кривая роста клеток в суспензии, как и клетки каллусной культуры, имеет S--образную форму.

Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом. Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов - изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определённых генов, изолирования и характеристик мутантов.

Работы по культивированию и субкультивированию проводят в асептических условиях.

Первичную суспензию перед субкультивированием фильтруют через 1 -- 2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных, плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов. Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобретения клеточной суспензией желательных характеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культивирования.

Способы выращивания, разработанные в микробиологии, применяются для глубинного культивирования растительных клеток. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе при периодическом режиме выращивания клеточная масса (инокулюм) помещается в определенный объем среды. До конца выращивания система остается закрытой по всем параметрам, кроме газов. В закрытой культуре в систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

В открытые проточные культуры периодически (или непрерывно) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть урожая клеточной массы. Регуляция этого процесса может осуществляться по принципу турбидостата или хемостата. В турбидостате подача свежей среды, и отбор суспензии происходят после достижения клеточной популяцией определенной заданной плотности. Сигнал на включение протока поступает от реле, связанного с оптической системой, определяющей плотность клеток. В хемостате скорость протока задается экспериментатором и от нее зависит скорость роста клеточной массы. Для этого питательная среда лимитируется по одному из наиболее важных для роста факторов, чаще всего по фосфору, азоту или сахару. Режим хемостата позволяет с помощью фиксированной скорости разбавления поддерживать константную скорость деления и плотность клеток в популяции.

Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов. Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших клеточных масс используют ферментеры большой емкости (от 20000 и более литров), в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Суспензионные культуры могут быть не только источником ценных вторичных метаболитов, но в них выявлены также другте соединения, например, камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др. Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.

Клональное микроразмножение растений

Клональное микроразмножение -- это использование техники in vitro для быстрого размножения растений, идентичным исходному, неполовым путем.

Клон -- это совокупность клеток или особей, произошедших от общего предка путем бесполого размножения -- основная единица учета в генетике микроорганизмов. В основе образования клонов лежит митоз, поэтому считается, что клон состоит из генетически однородных клеток. Однако это весьма относительно из-за спонтанных мутаций. Только клонированием удается сохранить особенности сорта. Клональное микроразмножение растений путем выращивания их из одной клетки на основе тотипотентности клеточной культуры обладает рядом преимуществ и является чрезвычайно перспективным:

1. Коэффициент клонального размножения гораздо выше, чем при обычных методах размножения. Так, из одного растения герберы в год можно получить 50--100 растений обычным способом, при клональном размножении из культуры ткани -- до 1 млн.

2. Можно размножать растения круглый год.

3. Тысячи растений могут расти на относительно небольшой лабораторной площади.

4. Одновременно с размножением происходит и оздоровление растений (от вирусов и патогенных микроорганизмов).

5. Методом клонального размножения получают посадочный материал растений, которые медленно размножаются половым путем или совсем не размножаются вегетативно.

6. При клональном размножении, в отличие от полового, получают генетически однородное потомство. Различают два вида клонального размножения:

*маломасштабное (при селекционных работах);

*массоклональное, коммерческое размножение с целью освобождения от вирусов и получения оздоровленного посадочного материала.

Следует назвать еще две области применения клонального микроразмножения. Первая -- это клональное микроразмножение лучших экземпляров лесных деревьев, особенно хвойных. Вторая -- это использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов растений, которые могут сохранять генетическую стабильность на всех этапах клонального микроразмножения -- от экспланта до растения в поле. Меристемные ткани растений непрерывно поддерживаются в эмбрионально активном состоянии, устойчивы к генетическим изменениям вследствие высокой активности систем репарации ДНК. При использовании в качестве эксплантов дифференцированных тканей растений возможно появление мутантных форм, поэтому апикальная меристема и пазушные почки стебля являются наиболее предпочтительными объектами клонального микроразмножения. Все манипуляции при клональном микроразмножении растений осуществляются в асептических условиях, т.е. с соблюдением техники микробиологических работ. Работа проводится или в микробиологических боксах, облучаемых УФ-светом, или в ламинарбоксах, где асептика достигается подачей стерильного воздуха.

Процесс клонального микроразмножения имеет продолжительность около трех месяцев и его можно разделить на четыре этапа.

На первом этапе осуществляют выбор растения-донора, изоляцию и стерилизацию экспланта и создание условий для образования каллуса на твердой питательной среде.

Второй этап связан с увеличением числа инициалей на каллусе и формированием побега.

Третий этап -- укоренение размножаемых пробирочных растений и адаптация их к условиям in vitro.

Четвертый этап -- выращивание извлеченных из пробирок растений в теплице и закалка перед высаживанием в поле.

При отборе растений -- доноров экспланта следует учитывать условия их предварительного выращивания, так как они могут существенно влиять на рост экспланта в культуре (добавки искусственных удобрений, время года). Необходимо отбирать и соответствующую стадию развития. Незрелые ткани и органы более способны к морфогенезу, чем зрелые. Двудольные травянистые растения обладают значительно большей регенерационной способностью, чем однодольные. Экспланты, изолированные в фазу активного роста, более склонны к укоренению и образованию побегов, чем изолированные в фазе покоя.

После отбора экспланта следует обратить особое внимание на дезинфекционную обработку растений, необходимую для удаления микроорганизмов с поверхности растений. Наличие любого загрязнения влияет на формирование каллуса. Прежде всего орган растения, из которого берут эксплант, моют мылом и водой (корни). Если берут листья, то их моют водным раствором мягкого детергента.

Установлено, что меристема сердцевины луковиц, клубнелуковиц, корневищ надежно защищена и является стерильной. Открытые органы растений -- источники эксплантов подвергают стерилизации химическим способом.

Стерилизующий эффект можно повысить следующим образом: стерилизация под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещение экспланта в 70 %-ный этанол перед стерилизацией дезинфектантом. После отмывки стерильной водой эксплант помещают на стерильную питательную среду в пробирки.

Как правило, для клонального микроразмножения на первом и втором этапах используют среду Мурасиге и Скуга, варьируя состав и сочетание стимуляторов роста в зависимости от объекта.

На первом этапе возможно ингибирование ростовых процессов экспланта токсическими веществами, выделяемыми в среду. В результате травмы, полученной эксплантом при изолировании, активируются фенолазы, окисляющие фенолы растений, продукты окисления которых ингибируют деление и рост клеток. Поэтому в питательную среду на первом этапе вводят антиоксиданты (глютатион, аскорбиновую кислоту, иногда антибиотики) и первые 4--5 дней культуру держат в темноте.

Условия культивирования экспланта (60--100 мг) характеризуются определенной температурой (25 °С), для субтропических растений -- 29 °С, каллус может расти в темноте, но можно его выращивать и на свету. Дальнейшие стадии культивируют при интенсивном освещении при длине светового дня 16 ч.

В последние годы фирма «Sigma» (США) выпускает новые мембранные наборы для культур растительных тканей из микропористой полипропиленовой мембраны, обработанной специальными поверхностно-активными веществами для улучшения прохождения питательных веществ. С применением мембран существенно ускоряется рост растений и каллуса по сравнению с агаризованной питательной средой, лучше удается освобождать культуры от ингибирующего влияния фенолов, выделяющихся в среду. Для развития и формирования каллуса важную роль играют элевиторы -- биологически активные вещества, активизирующие клеточное деление и ускоряющие дедифференцировку каллуса на первом этапе. Полагают, что они образуются из гидролизованных гликанов клеточных стенок.

На втором этапе очень важно создать оптимальные условия для митотического деления. Полученный каллус, как правило, состоит из неодинаковых по размеру клеток паренхимного типа. Для него характерно появление меристематически активных отдельных клеток или целых групп, предшественников корней и побегов. Образование и размножение каллуса происходит 4--16 недель. Далее его можно расчленить и размножить на той же среде с добавлением 6-бензиладенина с целью получения побегов.

Инкубация на втором этапе клонального микроразмножения осуществляется при 16-часовом световом дне и температуре 25--29 °С; побеги формируются через 3--5 недель. Условия должны обеспечить быстрое размножение экспланта в течение длительного процесса культивирования. Основную роль при этом играет оптимальное соотношение стимуляторов роста цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют 6-бензиламинопурин (1--10 мг/л), из ауксинов -- в-ИУК (в-индолилуксусную кислоту 0,5 мг/л).

На третьем этапе (укоренение побегов) осуществляют пересадку побегов на агаризованную питательную среду. Образования придаточных корней можно добиться различными способами. Корнеобразование усиливается при добавлении в среду хлорогеновой и феруловой кислот. Придаточные корни легко образуются на культивируемых побегах после введения ауксина. Корнеобразование может подавлять высокая интенсивность света, поэтому нижнюю часть пробирок следует закрывать фольгой. Укоренение можно индуцировать, поместив проросток в нестерильные условия грунта с высокой влажностью.

При подготовке растений к высадке в грунт они должны иметь длину 10--15 см. Выращивание осуществляется путем ряда пересадок (через 4--8 недель) на новые питательные среды. Для переноса в почву отбирают крепкие здоровые растения-регенеранты. Интактные проростки переносят в дистиллированную воду на 10--15 мин, затем во избежание дегидратации и для удаления остатков питательной среды их трижды промывают дистиллированной водой, опрыскивают раствором фунгицида и переносят в пластмассовые или торфяные горшочки, содержащие стерильный моховой торф. В течение 1--2 месяцев растения поливают через день дистиллированной водой и питательным раствором. Проростки инкубируют при высокой освещенности и при длине светового дня 16 ч, температуре 25--29 °С. Через два месяца с растениями уже можно обращаться как с обыкновенными проростками. Процесс регенерации длится около трех месяцев.

Получение растений через органогенез можно осуществить тремя способами:

1. путем формирования придаточных органов на каллусе, полученном из экспланта;

2. путем формирования придаточных органов прямо из экспланта без промежуточной фазы каллусообразования;

3. путем формирования растений-регенерантов из побегов, образовавшихся из набухших почек.

Сейчас клональное микроразмножение разработано для 2400 видов растений на лабораторном уровне. Однако в мире работают более 130 коммерческих лабораторий, не считая тех, которые занимаются размножением орхидей. Потребности мирового рынка .удовлетворяются на 20 %. В нашей стране развиваются лаборатории, связанные с нуждами селекции, а также с производством посадочных клубней картофеля, винограда и земляники на безвирусной основе.

Основные недостатки клонального микроразмножения растений:

1. Большая трудоемкость и высокие затраты. Необходима автоматизация и принципиально новые приемы. Среди них можно назвать отказ от укоренения растения in vitro и привлечение гидро- и аэропоники. В дальнейшем прогресс будет связан с автоматизацией и роботизацией трудоемких процедур.

2. Все особи, полученные путем клонального размножения, происходят из единственной меристемы и обладают уменьшением генетического разнообразия. Новые болезни могут оказаться для них катастрофическими за счет одинаковой восприимчивости к патогенным микроорганизмам.

Поэтому наряду с развитием техники вегетативного размножения на основе культуры меристематических клеток необходимо иметь и коллекции семян для сохранения генотипов п поддержания генетического разнообразия.

Культивирование протопластов

Протопласты высевают как на жидкие, так и на агаризованные среды того же состава с различными концентрациями агара.

Основное требование к применяемым методам состоит в том, чтобы в процессе культивирования не происходило разрушения протопластов и среда была оптимальна для образования клеточных колоний. До тех пор, пока протопласты не образовали клеточную стенку, они представляют собой легко разрушаемые структуры, и работа с ними должна проводиться в мягких условиях.

Условия культивирования протопластов, в основном, соответствуют тем, которые применяются для выращивания в культуре клеток растений.

В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу или их смеси. Сахароза не всегда может быть подходящим компонентом среды для культивирования протопластов. В некоторых случаях требуется добавление рибозы, ксилозы, фруктозы, маннозы или других сахаров. Кроме этого в состав питательных сред должны входить такие витамины, как тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота. При небольшой плотности высева требуется добавление и других витаминов.

Маннит, сорбит и их комбинация могут быть использованы в качестве осмотических стабилизаторов.

В качестве источников органического азота применяют обычно гидролизат казеина, который представляет собой смесь аминокислот. Его добавляют в том случае, если в среде недостаточное количество неорганического азота, а его содержание уже увеличить нельзя.

Ауксины и цитокинины требуются для клеточного деления и дальнейшего развития растительных клеток. Обычно в качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксус-ную кислоту и нафтилуксусную кислоту, в качестве цитокининов -- кинетин, бензиладенин. Оптимальные концентрации варьируют, и их подбирают в каждом отдельном случае.

Большое внимание при культивировании протопластов уделяется соблюдению и других условий среды -- так, рН среды -- 5,4--5,8, температура -- 22--28 °С. Иногда требуется слабое освещение. Жизнеспособность протопластов зависит от начальной плотности высева. Обычно их культивируют при плотности высева от 104 до 106 на 1 мл среды.

Можно изменять соотношения аммонийного и нитратного азота в зависимости от потребности в них клеток, увеличивать концентрацию СаСl2 для стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как образовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены в условия культивирования, применяемые обычно для клеток растений.

Иногда для повышения числа делящихся протопластов в среду добавляют различное количество кондиционированной среды, на которой некоторое время росли клетки, или же используют так называемый кормящий слой, состоящий из облученных клеток. Клетки в кормящем слое не делятся, но остаются метаболически активными, т.е. продукты жизнедеятельности инактивированных клеток восполняют необходимые компоненты среды. Обычно эти методы применяются в том случае, если протопласты высевают на питательную среду с небольшой плотностью.

Единичные протопласты можно культивировать в небольших количествах среды в пластмассовых или стеклянных чашках Купрака, а также в микрокамерах. Такое культивирование необходимо для получения колоний из одной клетки и для наблюдения за ее дальнейшим развитием. В последующем при нанесении таких колоний на агаризованную среду определенного состава можно получить каллус, а затем и целое растение.

В первые сутки культивирования некоторое число протопластов погибает, что может быть связано с гетерогенностью популяции по отношению к действию осмолитиков. Оставшиеся протопласты уже через несколько часов начинают синтезировать клеточную стенку. Полностью этот процесс завершается при правильно подобранных условиях выделения и культивирования на первые-четвертые сутки. При этом протопласты теряют сферическую форму, клетки удлиняются. Скорость регенерации клеточной стенки зависит от вида растения и ткани, из которой получены протопласты, а также от степени ее дифференцировки. При неблагоприятных условиях выделения и культивирования протопластов клеточные стенки образуются не по всей поверхности. В местах разрывов часть протоплазмы выходит, оставаясь окруженной плазмалеммой. Это так называемые почки. «Почкование» происходит при повышенной концентрации осмотически активных пеществ и при низком содержании СаСl2.

Как правило, при благоприятных условиях выделения и культивирования на третьи-четвертые сутки с момента нысева наблюдаются первые деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус, который способен регенерировать целое растение. Растения-регенеранты из протопластов получены в настоящее время для целого ряда сельскохозяйственных культур.

Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений

В 60-х гг. XX в. была доказана способность клеток и тканей растений к росту, делению, органообразованию и вторичному метаболизму, т.е. возможность любой клетки образовывать полноценное растение, поскольку генетический и физиологический потенциал, необходимый для вторичных метаболитов, присутствует в каждой клетке.

В настоящее время разработано промышленное получение ряда ценных веществ из растительной биомассы методом in vitro. Хорошо налажен в Японии выпуск следующих лекарственных препаратов: шиконин (из воробейника аптечного), убихинон (из табака), дигоксин (из наперстянки шерстистой), диосгенин (диоскорея дельтовидная).

Промышленное производство лекарственных веществ на основе культур клетки гарантирует достаточный выход продукта. Это можно подтвердить путем сравнения процента выхода активного начала из биомассы цельного сырья, взятого в эквивалентном количестве.

Для выращивания культур необходимы высокопродуктивные клетки растения. Так, для культивирования родиолы розовой более перспективными являются клетки корневой системы.

Для обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма необходим подбор ингредиентов питательной сре-ды, который проводят и оценивают по двум направлениям:

*влияние среды на формирование биомассы;

*влияние состава среды на синтез вторичных продуктов.

Компоненты субстрата для выращивания культур клеток растений должны включать: основные неорганические питательные вещества, источники железа, органические добавки (витамины, регуляторы роста), источники углерода.

Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений. На выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды. Так, в культуре клеток барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с повышением в среде концентрации сахарозы, а в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма используют ауксины, среди которых индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 2,4-дихлорфенок-сиуксусная кислота, а также цитокины. На синтез вторичных метаболитов влияют внесенные в питательную среду известные предшественники, которые могут стимулировать определенные ферментативные пути метаболизма. Введение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивало выход диосгенина на 100 %. На степень накопления вторичных метаболитов влияют также свет, температура, рН, а при суспензионном культивировании -- аэрация и перемешивание, состав питательной среды и концентрации ее компонентов.

Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов, можно гарантировать получение любого продукта с метаболической активностью.

Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и суспензионные культуры; последние получают из каллуса.

Преимущества получения ряда фармакологических веществ на основе культивирования растений заключаются в следующем:

1. независимость от климатических, сезонных и географических условий;

2. стабильность выпуска фарамацевтической продукции в течение года;

3. уменьшение площади почвы, на которой выращиваются лекарственные растения.

Культуры клеток растений могут синтезировать все классы соединений вторичного обмена (алкалоиды, терпеноиды, фенолы, гликозиды, бетаины). Синтез лекарственных веществ происходит либо во время эксконенциальной фазы, когда наиболее интенсивны метаболические процессы, либо в стационарной фазе развития популяции клеток. Суспензионные культуры -- это процесс получения биомассы в течение нескольких десятков суток в биореакторах с постоянным перемешиванием и при соблюдении правил асептики.

В России разработана технология получения субстанций женьшеня, родиолы розовой, унгерии на основе каллусных культур. Данные препараты нашли применение в медицине, косметологии и пищевой промышленности.

Выращивание растительных клеток осуществляется в биореакторах различного объема (до 200 л) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивание).

В настоящее время для получения биомассы и продуктов пторичного метаболизма применяют периодическое и проточное культивирование.

Для регуляции процесса проточного культивирования используют хемостатный и турбидостатный методы, т.е. такие подходы, как и при использовании в качестве продуцентом клеток микроорганизмов. Однако для процесса ферментации применяют специализированные типы биореакторов С пневматическим перемешиванием. Наиболее разработаны периодические способы выращивания растительных культур.

Перспективна технология получения БАВ с помощью иммобилизованных клеток, обладающих более низкой скоростью роста и способностью к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток -- выделение метаболита в питательную среду, из которой он может быть легко извлечен (например, клетки, продуцирующие алкалоиды). Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами:

*многократное использование биомассы;

*четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;

*увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования;

*получение большого количества вторичных метаболитов.

Другим вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

Биотрансформация -- метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны изменять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Он применяется для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

Возможность биотрансформации при синтезе некоторых соединений была показана на примере превращения дигитоксина в дигоксин клетками Digitalis lanata (наперстянки шерстистой). Производство этого вещества осуществляется периодическим способом; продолжительность процесса -- 17 суток. На первом этапе клетки Digitalis lanata выращивали 10 суток на специальной питательной среде, далее переносили в другую «продукционную» среду (8 %-ный раствор глюкозы с субстратом для биотрансформации -- дигитоксином). При соблюдении условий культивирования дигитоксин в течение двух дней трансформировался в деацетиллантозид С (дигоксин) и пурпургликозид. Содержание дигитокси-на -- 88 %.

...