Трансгенные животные. Экспрессия трансгенов в клетках млекопитающих

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

По дисциплине: «Генная инженерия»

На тему: «Трансгенные животные. Экспрессия трансгенов в клетках млекопитающих»

Егорова Мария

Москва 2018

Содержание

Введение

1. Способы введения чужеродной ДНК в клетки млекопитающих

2.Селективные маркеры

3. Способы доставки генов в клетки млекопитающих

4. Основные векторные системы клеток животных, основанные на использование вирусов

5. Использование трансгенных животных

Список литературы

Введение

Изучение работы генов млекопитающих основано на возможности изоляции генов с помощью клонирования, манипулирования последовательностью гена invitro, а также возможности вернуть измененный ген в клетки, чтобы определить функцию кодируемого им белка. Была необходима разработка методов, заставляющих клетку принять чужеродную ДНК несмотря на все эволюционные барьеры, существующие уже миллионы лет. Хотя эта проблема была разрешена довольно быстро, вскоре ученым стало ясно, что сразу же после введения ДНК в клетки всякий контроль за ее поведением теряется. Поэтому много сил ушло на разработку методов, позволяющих сохранить истинные функции перенесенных генов.

Были также разработаны методы, инактивирующие гены, уже присутствующие в клетке, что позволяет определить их функции в интактной клетке или животном. Изощренные методы генной инженерии позволяют вводить новые гены или изменять старые . клонирование трансгена в клетках млекопитающих может быть использовано:

1) Для инактивации изучаемого гена для определения его функций

2) Для экспрессии рекомбинантного гена в культуре клеток

3) При получении трансгенных животных

4) В генной терапии

Подтрансгенным организмом принято принимать организм, который содержит новый ген(гены), который стабильно передается потомству. Другое название - генетически модифицированный организм. Первая генетически-модифицированная бактерия, Ecoli была получена в 1973г., всего на два года раньше чем первая трансгенная мышь (1975). С тех пор были получены самые разные трансгенные животные (табл. 1), но мыши по-прежнему остаются одной из основных генетических моделей для изучения совершенствования методик трансгенеза. Трансген - ген, который был внесен в организм тем или иным способом (трансформацией, трансфекцией и т.д.). Требования к трансгену - трансген должен включаться в заданное время, в нужном количестве и в соответствующем месте (органе, ткани) животного, требуются соответствующий промотор и другие регуляторные последовательности; для правильной экспрессии ген должен быть встроен в хромосому. селективный вирус трансгенный млекопитающий

Таблица 1.Ряд основных достижений в области трансгенеза животных

1. Способы введения чужеродной ДНК в клетки млекопитающих

Процесс захвата ДНК не является естественным для клеток млекопитающих. Напротив, в коде эволюции клетки всячески защищались от попадания чужеродного генетического материала. Поэтому для преодоления естественных барьеров переноса генов использовали различные технические ухищрения. Одним из первых методов был микроинъекция, при котором ДНК инъецируют прямо в ядро клетки, с помощью специально сконструированных тонких стеклянных иголок. Этот метод является эффективным, так как большая доля инфицированных клеток действительно получает ДНК, но одном эксперименте может быть инъецировано лишь около сотни клеток. Тем не менее, некоторые из ранних экспериментов с опухолевыми вирусами были сделаны этим методом, и в ряде экспериментов он по-прежнему используется для инъекции ДНК, РНК или белков в клетки.

Временная и стабильная экспрессия трансгенов.

Выделяют два типа трансфекции, трансфекция для временной экспрессии трансгена, которая является кратковременной, не требует селекции и характеризуется тем, что лишь до 50% клеток получают рекомбинантную ДНК: трансфекция для стабильной экспрессии трансгена, которая требует селекции и характеризуется тем, что все отобранные клетки получают рекомбинантную ДНК. В последнем случае возникает новая клеточная линия. Эффективность такойтрансфекции составляет 1 к 10(3) - 1к10(4) трансфецированных клеток.

Каждый из этих методов служит для доставки ДНК в клеточное ядро. Во многих случаях целью трансфекции является изучение функции какого-либо гена в течение короткого времени. Для этих экспериментов не нужно получать стабильно трансфецированные клетки и не требуется специфических методов селекции. Особенностью временной экспрессии является то, что анализировать ее можно лишь через короткое время после проведения трансфеции( как правило, 48-72 ч.), т.к. затем трансген будет быстро теряться при клеточных делениях или приводить к гибели клеток в случае цитопатического действия вектора.

Для получения стабильныхтрансфектантов необходимо использовать методы селекции. В этом случае можно отобрать клоны, в которых произошла интеграция трансгенной ДНК в хромосомы. Интеграция в клетках млекопитающих, как правило, происходит не по гомологии, а в случайные сайты.

Использование временной экспрессии.

Как уже упоминалось выше, трансфекция очень редко приводит к стабильному включению трансгена в геном трансфецрованной клетки. Это редкое событие, встречающееся с частотой от 1на тысячу или миллион клеток. Гораздо большее число клеток, обычно до половины, захватывает ДНК при трансфекции, но это ДНК не интегрирует в геном. В этих клетках ДНК сохраняется в течении нескольких дней, а затем исчезает. Во время первых 48 часов после трансфекции около 50% клеток в культуре содержат трансфецированную ДНК. Этот период называется временной фазой, и именно она используется в ряде экспериментов. По мере продолжения инкубации клеток большинство из них постепенно теряет трансфекцированную ДНК.

Ученые использовали временную (или транзитную) экспрессию для различных целей. Например, при изучении активности промоторов и энхансеров млекопитающих плазмиды, содержащие клонированные промоторы ( часто с делециями или мутациями различных последовательностей), вводили в клетки, и через 48-72 часа клетки анализировали. За это время активные промоторы распознавались транскрипционным аппаратом клетки, что приводило к транскрипции последовательностей, расположенных «вниз по течению». Часто эти последовательности содержали репортерный ген, например ген luc, который кодирует легко анализируемый фермент люциферазу.

С помощью гибридизации с мечеными пробами можно также измерить количество РНК, синтезируемой с трансфецированных генов. Другим применением временной экспрессии является продукция больших количеств белка или РНК с клонированного гена. Оно может быть достаточно велико.

2. Селективные маркеры

Одним из основных принципов технологии рекомбинантной ДНК является использование селективных маркеров для идентификации клеток, содержащих рекомбинантную ДНК. У бактерий - это гены устойчивости к антибиотикам, которые используют для селекции клеток, получивших клонированную ДНК, среди значительно большей популяции бактерий, которые ее не получили. В ранних экспериментах по трансфекции клеток млекопитающих, использовавших вирусные гены, перенос экзогенной ДНК в клетки регистрировали потому, что ДНК обладала биологической активностью - она или приводила к образованию частиц вируса, или к изменению скорости роста клеток. В случае изучения генетического материала, свойства которого нельзя зарегистрировать просто по фенотипу трансфецированных клеток, задача усложняется, т.к. даже в лучших экспериментах по трансфекции стабильный перенос ДНК происходит только в одну клетку из тысячи.

Основные селективные маркеры, используемые при трансфекции клеток млекопитающих

3. Способы доставки генов в клетки млекопитающих

Хотя очищенную ДНК, вводимую с помощью трансфекции, могут временно экспрессировать до половины клеток культуры, чаще доля таких клеток значительно меньше. Фактически некоторые клетки практически полностью устойчивы ко всем искусственным методам трансфекции, которые мы обсуждали выше, но очень часто необходимо ввести чужеродные гены именно в такие клетки. Например, стратегия генной терапии требует эффективных методов введения генов в нормальные клетки человека. В некоторых случаях, например для продукции больших количеств гетерологичного белка, требуется ввести клонированную ДНК в максимальное число клеток.

Для доставки специфических генов в клетки животных возможно использовать такие природные «векторные», как вирусы. Модифицированные вирусные векторы подразделяют на 2 группы: (1) свободно реплицирующиеся вирусы, которые размножаются внутри клетки, но не интегрируются в геном хозяина: (2) интегрирующиеся вирусы, включая ретровирусы.

4. Основные векторные системы клеток животных, основанные на использовании вирусов

В качестве векторов для клеток животных используют вирусы, чей геном представлен ДНК (ДНК-содержащие вирусы) или РНК (РНК-содержащие вирусы, или ретровирусы).

Из ДНК-содержащих вирусов наиболее часто для создания векторов используют аденовирусы (Ad) и аденоассоциированные вирусы (AAV). Геном аденовируса имеет размер около 36 kb и представляет собой двунитевую ДНК, в то время как геном AAV состоит из небольшой молекулы (около 4,7 kb) однонитевой ДНК. Основной принцип «дизайна» векторов на основе вирусов состоит в удалении генов, отвечающих за патогенез, в то время как гены, необходимые для репликации и упаковки генетического материала, помещают на вирус-помощник (или встраивают в геном клетки-реципиента). Естественно, что каждый тип векторов обладает своими особенностями конструирования, сборки и очистки.

Векторы на основе SV40

В ранних вирусных векторах, основанных на онкогенном вирусе обезьян SV40 (Simianvirus 40), часть вирусных генов просто заменяли с помощью ДНК-лигазы. Эти кольцевые молекулы которые формировали вместе с ДНК из дефектного хелперного вируса SV40.

5. Использование трансгенных животных

Трансгенные животные используют для изучения функций самых различных белков. В ряде случаев можно использовать уменьшение или увеличение экспрессии гена, для того чтобы выявить его роль в организме. Мышей используют и при отработке методик, направленных на получение белков, секретируемых в молоко. Очевидно, что для создания традиционных «продуцентов» молока, таких как козы и овцы, необходим предварительный анализ экспрессии трансгена на более простой и дешевой модели, особенно характеризующейся быстрым ростом и размножением. В настоящее время, трансгенные мыши продуцируют некоторые белки человеческого организма - интерферон, интерлейкин-2, факторы свертываемости кров lX, сывороточный альбумин и т.д.

Использование трансгенных коров в основном направлено на изменение состава молока, в том числе синтез белков человека (инсулин, эритропоэтин); продукцию моноклональных антител в молоке; получение безлактозного молока за счет сверхэкспрессии гена лактамазы; увеличение содержания казеина; получение молока, соответствующего по составу женскому молоку. Кроме того, у овец актуальными задачами являются : увеличение продукции цистеина за счет синтеза двух бактериальных белков, превращающих серин в цистеин (цистеин является лимитирующим фактором для роста шерсти овец); экспрессия генов, кодирующих белки-инсектициды чтобы уменьшить или избежать использования инсектицидных жидкостей.

Проведены многочисленные попытки увеличения скорости роста свиней с помощью экспрессии химерного гена, кодирующего гормон роста. Трансгенных свиней действительно характеризует увеличение мускулатуры и уменьшение количества жира, но эти положительные качества сопровождало большое число аномалий. Возможно, причиной таких негативных эффектов было то, что гормон синтезировался нерегулируемо в самых различных тканях.

Трансгенных рыб все шире используют для моделирования различных болезней человека. Для скрининга лекарств применят как традиционные генетические подходы, например, получая мутантов с нарушением развития каких-либо органов, а также и создавая трансгенных рыб с нарушениями соответствующих генов.

Успешным примером создания трансгенных рыб является получение трансгенных лососей и радужной форели, содержащих сверхэкспрессированный ген гормона роста. Это привело к значительному увеличению веса трансгенных лососей.

Трансгенных кур можно будет использовать для получения яиц, обогащенных самыми различными белками, использующимися в фармацевтике, в том числе и антионкогенными средствами. При средней производительности 250 яиц/год и продукции около 100мг трансгенного белка на яйцо такие трансгенные куры могут стать дешевым и эффективным источником рекомбинантных белков.

Заключение

Для получения трансгенных животных могут быть использованы эмбрионы любых животных. Такие организмы могут быть применены для самых различных целей. Мыши и крысы являются прекрасными модельными объектами в фундаментальных исследованиях. Мышей, крыс и свиней используют для моделирования болезней и человека, а также способов терапии этих болезней. Свиньи являются потенциальными донорами органов при ксенотрансплантации. Сельскохозяйственные животные могут быть существенно улучшены за счет изменений их анатомии и/или физиологии. Самые разные виды трансгенных животных могут стать источниками белков, важных для медицины (гормонов, ростовых факторов).

В то же время многие проблемы связанные с получением и использованием трансгенных животных, остаются нерешенными.

В частности, несмотря на значительные успехи в использовании нуклеаз типа Cas9, ученые пока не научились проводить строго направленную интеграцию трансгена, часто кассеты попадают в случайные места генома, иногда приводят к инактивации других генов; иногда интегрируют множественные копии кассеты; интеграция не всегда стабильна. Часто трансгенные животные имеют проблемы со здоровьем. Несмотря на заверения ученых, широкую общественность продолжает мучить вопрос: безопасны ли трансгенные животные для человека? Несомненно, что получение трансгенных животных не заменяет и не отменяет традиционные методы селекции, позволяющие сохранить природное разнообразие организмов.

Размещено на Allbest.ru