Використання аквакультури для акліматизації культивованих in vitro рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Використання аквакультури для акліматизації культивованих in vitro рослин

Т.В. Медведєва, кандидат біологічних наук Інститут садівництва (ІС) НААН

Abstract

Анотація

Специфічні умови культури in vitro зумовлюють формування мікропагонів з порушеними морфологічною та анатомічною структурою та фізіологічними процесами. Після перенесення з культиваційних посудин в культуру ex vitro такі рослини можуть пошкоджуватися через зміну умов культивування. Тому вони вимагають акліматизації для коригування анатомічних і фізіологічних змін. Автор пропонує використовувати аквакультуру як один із способів акліматизації мікропагонів після культури in vitro.

Спосіб мікроклонування рослин, що базується на активації пазушних меристем шляхом зняття апікального домінування, набув широкого використання для швидкого розмноження генетично однорідного матеріалу багатьох видів, особливо для отримання цінних сортів, вільних від вірусів [1, 2]. Але його застосування часто обмежується високим відсотком рослин, втрачених чи пошкоджених при перенесенні в умови ex vitro (у теплицю чи в поле). Акліматизація є фінальним і необхідним кроком в усій схемі мікроклонального розмноження, що включає введення експлантів в культуру in vitro, активну проліферацію, вкорінення та перенесення рослин - регенерантів в умови ex vitro. Для акліматизації в умовах ex vitro необхідно забезпечити ряд оптимальних фізичних факторів, щоб виконати поступовий перехід мікропагонів з in vitro в умови навколишнього середовища. Ці фактори - адекватний субстрат (торф, перліт чи різноманітні суміші), вологість повітря, вентиляція та кислотно-лужний баланс (рН). У більшості випадків для акліматизації використовують твердий субстрат, а вологість повітря забезпечують штучним туманом або захищають культури прозорими кришками чи вологими тентами.

Значні зусилля були спрямовані на оптимізацію умов акліматизації рослин, розмножених в умовах in vitro [3]. Однак ця стадія залишається основним вузьким місцем при мікроклональному розмноженні багатьох видів і сортів рослин і вивчення способів підвищення її ефективності є досить актуальним.

Методика. Дослідження проводили у відділі вірусології, оздоровлення та розмноження плодових і ягідних культур Інституту садівництва НААН. Об'єктами служили рослини суниці садової (Fragaria х ananassa Duch.) сортів Геркулес та Янтарна (селекція вказаного інституту), ожини (Rubus fruticosus L.) сортів Торнфрі та Блек сетин і мінітроянди (Rosa chinensis Jacq. var. minima) сорту Ред Моцарт. Базальне середовище для проліферації рослин містило солі та вітаміни за Мурасіге і Скугом (MS) [4], 30 г/л сахарози та 7 г/л агару, pH 5,6-5,8. Концентрація екзогенного цитокініну (6- бензиламінопурину (БАП) варіювала по культурах (від 0,5 мг/л до 2,0 мг/л). Для вкорінення мікропагонів в умовах in vitro цитокінін видаляли з середовища, натомість додавали ІМК (1,0 мг/л). Рослини, укорінені в умовах in vitro, були обережно видалені з культиваційних посудин, а їх корені ретельно відмиті в теплій воді від залишків агаризованого середовища. Рослини вставляли в отвори, зроблені в пінопластовій пластині, яку вміщували у пластикову кювету, що містила шар водопровідної води 2-3 см, який не перевищував рівень коріння, і культивували при температурі 22° С, освітленні 2,5-3 тис. люкс, фотоперіоді 16/8 годин і вологості повітря 50-60% без накриття, у безпосередньому контакті з навколишнім середовищем.

Результати досліджень. Умови культивування рослин у теплиці та в культурі in vitro мають ряд відмінностей: інтенсивність і якість освітлення, рівень відносної вологості, склад газового середовища, поживні елементи і регулятори росту, субстрат для культивування [5]. Значно відрізняється процедура вкорінення - у теплицях на короткий час занурюють живці у розчин ауксину високої концентрації, надлишки якого потім вимиваються з добре аерованого субстрату. При вкоріненні in vitro мікропагони культивують кілька тижнів на агаризованому поживному середовищі з низькою концентрацією ауксину та низькою аерацією. Тому не дивно, що перенесення їх з in vitro в теплицю незалежно від того, вкорінені вони чи ні, супроводжується стресом, уповільненим ростом і значними втратами рослинного матеріалу [6]. Протягом процесу акліматизації мікропагони, отримані в культурі in vitro, повинні адаптуватися до нових умов росту - при нижчій відносній вологості, вищій інтенсивності освітлення, коливанні температури та постійній загрозі контамінації патогенами. Дуже часто зневоднення і в'янення є основними причинами низького відсотка приживлюваності мікропагонів в ex vitro. За деякими оцінками, лише 25% регенерованих in vitro мікропагонів можуть бути успішно пересадженими в тепличні і ще менше в польові умови через причини, які пов'язані з їх недосконалими анатомічними і фізіологічними характеристиками:

- недорозвинута чи неактивна воскова кутикула листка;

- пошкоджений продиховий механізм, у якому ненормально орієнтовані мікрофібрили;

- низька фотосинтетична активність;

- вітрифікація мікропагонів, що до певної міри зумовлена нерозвинутою восковою кутикулою та недостатньою диференціацією васкулярної тканини;

- слабий судинний зв'язок між коренем і пагоном, що перешкоджає поглинанню і транспорту води та елементів живлення з першого в останній;

- недорозвинуті або відсутні кореневі волоски.

Всі ці та інші чинники призводять до великого процента втрат протягом акліматизації [7].

Для акліматизації мікропагонів, розмножених в культурі in vitro, застосовуються дві основні стратегії, що базуються на зменшенні водного стресу при зміні умов культивування і стимулюванні фотоавтотрофного росту цієї культури. Позбавити мікропагони від цього стресу дає можливість акліматизація з використанням аквакультури, що позитивно впливає на відсоток адаптованих рослин. Цей метод виявився високоефективним для акліматизації вкорінених рослин суниці обох досліджуваних сортів (Геркулес і Янтарна). Через 3 тижні культивування в рідкому субстраті 100% рослин були успішно пересаджені в горщики і виставлені для адаптації на вегетаційний майданчик (рис.1).

Рис.1. Стадії акліматизації суниці садової в аквакультурі

За цей час спостерігали утворення нових коренів і нових листків, тобто рослини розвивались активно, їх ріст не сповільнювався. Вода в кюветах залишалася прозорою, не спостерігалось її побуріння і відпадала потреба в заміні на свіжу. Але через випаровування та поглинання рослинами доводилося регулювати її об'єм.

При акліматизації в такий спосіб сортів ожини Торнфрі і Блек сетин було випробувано два варіанти: в одному рослини були вкорінені, а в другому ні. В останньому варіанті ми спробували сумістити вкорінення та акліматизацію, додавши у воду індолілмасляну кислоту у концентрації 1мг/л для гормональної стимуляції ризогенезу. В першому випадку (рис. 2) через два тижні 100% рослин були успішно акліматизовані і пересаджені в горщики. Подібного результату акліматизації у гідрокультурі сорту Торнлес евергрін досягли протягом місяця дослідники в Румунії [8].

У другому варіанті процеси вкорінення та акліматизації тривали близько місяця, спостерігалося побуріння води в кюветах і розчин доводилось міняти на свіжий один раз на тиждень. Загальний вихід висаджених у горщики рослин становив 60 (Торнфрі) - 70% (Блек сетин). Більшість комерційних лабораторій не вкорінюють мікропагони in vitro, оскільки цей процес трудомісткий і вимагає додаткових коштів. Укорінення in vitro складає приблизно 35-75% загальної вартості мікроклонального розмноження [9]. Такі витрати можна значно скоротити, якщо цей процес сумістити з акліматизацією. Випробуваний нами спосіб дає можливість з'єднати дані процеси в один, але для підвищення його ефективності дослідження треба продовжити.

А - матеріал для Б - кювети з водою для Г - результат акліматизації

акліматизації акліматизації

Рис. 2. Укорінення та акліматизація рослин ожини Rubus fruticosus Ь.

Рослини міні троянди сорту Ред Моцарт, укорінені на середовищі Мурасіге і Скуга з додаванням 1,0 мг/л ауксину, також були ефективно акліматизовані в аквакультурі (рис. 3). Вихід їх склав 80% за рахунок високих сильних рослин з добре розвиненою кореневою системою. Мікропагони, в яких були слаборозвинені корінці, розвивалися повільно і врешті-решт загинули. Процес акліматизації тривав 3 тижні.

Запропонований нами спосіб акліматизації в аквакультурі виявився високоефективним для всіх культур, випробуваних у даному дослідженні. З його допомогою можна отримувати сильнорозвинені рослини суниці, ожини та мініатюрної троянди, придатні для пересаджування в горщики і подальшого пристосування до умов навколишнього середовища.

Рис. 3. Акліматизація рослин мінітроянди сорту Ред Моцарт

Він дає можливість зменшити трудові та фінансові витрати, оскільки не потребує створення штучного туману, спеціальних субстратів, накриття та періодичного провітрювання рослин, які знаходяться в безпосередньому контакті з довкіллям з першої хвилини акліматизації. Ми також пропонуємо випробування цього способу для оптимізації умов укорінення та акліматизації як єдиного процесу та для розширення спектра культур, які можуть бути акліматизовані таким чином.

мікропагін акліматизація укорінення рослина

1. Gamborg O.L. Plant tissue culture. Biotechnology milestones // In vitro Cell Dev. Biol. Plant. - 2002. - 38. - P. 84-92.

2. Read P.E. Micropropagation: Past, Present and Future // Acta Hort. (ISHS). - 2007. - 748. - P. 17-27.

3. Медведєва Т.В. Проблеми акліматизації культивованих in vitro рослин // Фізіологія і біохімія культурних рослин, Т.40.- 2008.- №4.- С. 299-309.

4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum.-1962. - 15. - P, 473-497.

5. Balla I., Vйrtesy J., Vйgvвry Gy., Szьcs E., Kвllay T., Vцrцs I., Biro B. Nutrition of the micropropagated fruit trees in vitro and ex vitro // Int. Journal of Hort. Sci. - 2003. - 9(2). - P.43-46.

6. Seelye J.F., Burge G.K., Morgan E.R. Acclimatizing tissue culture plants: reducing the shock // Combined Proceedings International Plant Propagators' Society. - 2003.- 53.- P.8590.

7. Pospisilovв J., Synkovв H., Haisel D., Semoradova S. Acclimation of plantlets to ex vitro conditions: effects of air humidity, irradiance, CO2 concentration and abscisic acid (a review) // Acta Hort. -2007.- 748.- P. 29-38.

8. Alexandru Fira, Doina Clapa Ex-Vitro Acclimation of some Horticultural Species in Hydroculture // Bulletin UASVM Horticulture.-2009. - 66(1). - P. 44-50.

9. Kozai T., Zobayed S.M.A. Acclimatization // Spier R.(ed). Encyclopedia of cell technology. New York: Wiley, 2000.- P. 1-12.

Размещено на Allbest.ru