Применение мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток в регенерации костной ткани

В 20 веке с открытием стволовых клеток возросла активность по их изучению советскими учеными. Большой вклад в открытие и исследование стволовых клеток внесли российские гистологи А.А. Максимов и А.Я. Фриденштейн [1]. В 1926 году профессор А.А. Максимов обнаружил в соединительной ткани вокруг мелких сосудов гемопоэтические стволовые клетки, являющиеся предшественниками клеток крови. Значительно позже в 70-х годах XX века ученый А.Я. Фриденштейн описал и экспериментально подтвердил наличие в костном мозге малодифференцированных клеток мезодермы, которые способны дифференцироваться в костную ткань. Однако позднее было установлено, что, помимо костной ткани, эти клетки способны дифференцироваться в следующих направления - хондрогенном, адипогенном, миогенном, ангиогенном. Таким образом, подводя итог почти вековых исследований ученые пришли к выводу, что стволовые клетки- это недифференцированные клетки, способные к самоподдержанию клеточной колонии и активной пролиферации и дифференцировке. Мультипотентность определила их название - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК). Было установлено, что, кроме костного мозга, донорными зонами ММСК могут быть - жировая ткань, поперечно-полосатая мышечная ткань скелетных мышц, синовиальная оболочка, пупочный канатик, пульпа зуба, амниотическая жидкость, периферическая кровь.

Также ММСК могут быть получены из фетальных тканей некоторых паренхиматозных органов, например печени, легких.

Актуальность изучения ММСК взрослого организма обусловлена рядом причин:

1) быстрое получение трансплантата в короткие сроки благодаря высокой скорости пролиферации клеток;

2) мультипотентные МММСК обладают способностью к дифференцировке в разных направлениях, что позволяет использовать их в лечении различных заболеваний.

Главным преимуществом использования ММСК при лечении заболеваний является возможность трансплантировать собственные клетки пациента.

В связи с этим актуальной остается и область медицины, занимающаяся лечением врожденных костных дефектов или полученных вследствие механического повреждения, а также хирургических операций. Устранением костных дефектов занимается клеточная инженерия. Первые попытки восстановления целостности костной ткани были предприняты в 70-х годах XX века. Метод заключался в использовании аутологичной кости. В настоящее время более эффективным и прогрессивным является применение синтетического материала (полимеры, фосфаты кальция, пластмассы, металлы и т.д.) для решения проблем размера и формы трансплантата, обеспечения его механической прочности. Такой биоинертный материал используется как матрица для размещения стволовых клеток пациента, обеспечивая структурную и биомеханическую совместимостью с поврежденным участком и отсутствие отторжения.

Современное конструирование костных трансплантатов предполагает наличие трех составляющих: остеогенных клеток, материала-носителя и биоактивных молекул (ростовых факторов, цитокинов, костных морфогенетических белков). Достаточное количество остеогенных клеток может быть получено in vitro из мезенхимальных стволовых клеток разного происхождения - стромы костного мозга, жировой ткани и других источников. Для репарации костных тканей наиболее часто используются стволовые клетки костного мозга, реже - жировой ткани. Во многом эффективность формирования костной ткани с использованием костных трансплантатов зависит от особенностей поддерживающей матрицы.

Поэтому одним из основополагающих этапов замещения костных дефектов является выбор материала матрицы. Механической основой для стволовых клеток является скаффолд, представляющий собой волокнистую или пористую структуру. Выбор материала определяется рядом критериев: биосовместимостью (отсутствием отторжения трансплантата), адгезивностью (поддержанием клеточной пролиферации), биорезорбируемостью (способностью к саморассасыванию, непрепятствующему росту собственной ткани). Кроме того, материал-носитель должен иметь оптимальный размер пор для равномерного распределения клеток, образования сосудов, а также всасыванию питательных веществ и удаления продуктов жизнедеятельности и др. Также одним из ключевых факторов при выборе материала скаффолда является его способность к выполнению функций внеклеточного матрикса. Таким образом, для изготовления скаффолдов используются следующие материалы: природные полимеры, синтетические полимеры и керамика. Наиболее широкое применение находят матрицы на основе фосфатов кальция (гидроксиапатит трикальциифосфат, ситталы, биоактивные стекла), близкие по своему составу к костной ткани человека [5].

В последнее время стало популярным использование морских материалов в биомедицинской области благодаря их многообещающим характеристикам, таким как биосовместимость, низкая иммуногенность и широкая доступность.

Недавние исследования были сосредоточены на использовании каракатицы в качестве биологически активного агента для применения в тканевой инженерии, из которой были синтезированы частицы гидроксиапатита. В ходе исследований было установлено, включение гидроксиапатита увеличило поверхностную минерализацию, которая является основным этапом регенерации костной ткани [6].

В целом метод предполагает помещение в область костного дефекта пропитанного мезенхимными стволовыми клетками матрикса. Последующее деление клеток определяется их взаимодействием с факторами роста, так как обычно большинство ММСК пребывают в состоянии G0/G1 периода. Контроль пролиферации, дифференцировки и направленного движения клеток является важной частью восстановления костной ткани, так как обуславливает ее правильное развитие [7].

Факторы роста - это небольшие полипептидные молекулы, регулирующие пролиферацию, стимулируя или ингибируя ее, а также выживание определенных клеток. К факторам остеогенеза относятся: IGF (инсулиноподобный фактор роста); PDGF; TGF-трансформирующий фактор роста бета); EGF( эпидермальный фактор роста), FGF( фактор роста фибробластов). Факторы роста действуют избирательно на клетки-мишени, взаимодействуя с мембранными рецепторами клеток. Таким образом, начинается деление клетки [5, 8].

В результате ряда симметричных делений клетки образуются трипотентные и бипотентные предшественники. Во время стадии стволовых клеток фенотипические изменения не происходят. Однако после деления бипотентных клеток и образования унипотентных, приобретающих фенотипические особенности, начинается стадия клеток, идущих по пути дифференцировки. Таким образом, унипотентные предшественники становятся источниками полностью дифференцированных клеток. Остеобластная дифференциация из остеопредшетсвенника включает стадии преостеобласта, остеобласта и остеоцита. Все эти этапы сопровождаются активацией остеопонтина, коллагена I типа, щелочной фосфатазы, костного сиалопротеина и остеокальцина.

Начальная остеогенная дифференцировка может проходить самостоятельно и, как правило, не требует добавления специфических индукторов. Следует отметить, что на начальных стадиях дифференцировки появляется фермент щелочная фосфатаза, по активности которого можно судить о коммитировании клеточных колоний к остеогенезу. Морфологические особенности остеобластов клетки приобретают лишь на поздних этапах дефференцировки, на ранних этапах они обладают признаками фибробластов и морфологически неотличимы от них.

Терминальная остеогенная дифференцировка ММСК, представляет собой образование минерализованных костных узелков и требует определенных индукторов. Она включает три этапа:

1) пролиферация остеогенных клеток;

2) выработка и созревание внеклеточного матрикса;

3) минерализацию матрикса.

В присутствии дексаметазона, аскорбиновой кислоты и -глицерофосфата ММСК костного мозга происходит их группировка в плотные узелки. Позднее начинается синтез внеклеточного матрикса, содержащего преимущественно коллаген I типа, остеокальцин, остеонектин, остеопонтин и костный сиалопротеин Третий этап характеризуется отложением в матриксе солеи“ кальция (гидроксиапатита). Есть данные, что дексаметазон обеспечивает осуществление ранних стадии“ остеогенеза, индуцируя дифференцировку МСК в остеобласты, сопровождающуюся усилением экспрессии ЩФ. Программа костной дифференцировки может быть активирована гидрокортизоном и костным морфогенетическим белком BMP-2. мультипотентный мезенхимальный стромальный костный инженерия

По современным данным, помимо регенеративных способностей ММСК обладают секреторной активностью. ММСК являются важным источником факторов роста и цитокинов, которые участвуют в регуляции регенерации тканей. Таким образом, ММСК вырабатывают факторы в костном мозге, которые необходимы для самоподдержания кроветворных стволовых клеток и держать их в нише, мы можем ссылаться на такие факторы как ФСР-1А (стромальный фактор-1А), СКФ (фактор стволовых клеток), ангиопоэтин-1, и Ил-7. Было также установлено, что ММСК способны продуцировать ангиогенные и нейротрофические ростовые факторов, в том числе и ФРЭС (фактор роста эндотелия сосудов), нервный рекомбинатный (основной фактор роста фибробластов), ХГФ (фактор роста гепатоцитов), ангиопоэтин, ФРН (фактор роста нерва), головного мозга BDNF (нейротрофических фактор мозга), и GDNF (глиальный нейротрофический фактор). Ангиогенные факторы роста, продуцируемые ММСК в зоне пересадки, стимулирует деление эндотелиальных клеток, их миграцию и формирование кровеносных сосудов. Кроме того, факторы, продуцируемые ММСК способствуют мобилизации эндотелиальных предшественников из костного мозга, которые участвуют в формировании новых кровеносных сосудов. Одновременно, нейротрофический фактор, продуцируемый ММСК стимулирует рост и обновление нервных окончаний. Таким образом, ММСК могут контролировать рост и развитие кровеносных сосудов и нервов при регенерации костных тканей [7, 11].