Филогенетический анализ и молекулярное типирование трихотеценпродуцирующих грибов рода Fusarium из российских коллекций

Размещено на http://www.allbest.ru/

Филогенетический анализ и молекулярное типирование трихотеценпродуцирующих грибов рода Fusarium из российских коллекций

А. А. Стахеев

РЕФЕРАТ

Проведен трехлокусный филогенетический анализ штаммов грибов рода Fusarium, депонированных во всероссийских коллекциях и предположительно способных к синтезу микотоксинов трихоте- ценовой группы. Исследован меж- и внутривидовой полиморфизм фрагментов гена фактора элонгации трансляции 1 альфа (TEF1a) и двух генов, входящих в трихотеценовый кластер - TRI5 и TRI14. Анализ 60 штаммов различного происхождения позволил подтвердить и уточнить таксономическую характеристику некоторых штаммов с помощью ДНК-маркеров. Впервые на территории России идентифицирован штамм commune (F-900), а также выявлен штамм (F-846), филогенетически отличный от любого из охарактеризованных на данный момент видов Fusarium. Также показано, что штаммы F. equiseti из северо-западных регионов России относятся к североевропейской (I) группе, а северокавказский изолят - к южноевропейской (II). Частичные последовательности гена TRI14 9 из 12 исследованных видов охарактеризованы впервые. Сравнительный анализ выявил относительно высокий уровень внутривидового полиморфизма этих последовательностей, в частности у видов F. graminearum и F. sporotrichioides, однако не обнаружено какой- либо связи между различиями в структуре гена TRI14 и географическим происхождением либо хемотипом штаммов. С помощью двух систем праймеров проведено молекулярное типирование штаммов-продуцентов трихотеценов типа В, позволившее охарактеризовать их специфические хемотипы. Принадлежность большинства исследованных штаммов к определенному хемотипу подтверждена методом ВЭЖХ. штамм гриб микотоксин типирование

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ДНК -маркеры, идентификация, род Fusarium, трихотеценовые микотоксины, филогенетический анализ, хемотип.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПЦР - полимеразная цепная реакция; ТрМТ - трихотеценовые микотоксины; TEF1a - ген фактора элонгации трансляции 1 альфа; TRI5 - ген триходиенсинтетазы.

ВВЕДЕНИЕ

Грибы рода Fusarium, относящегося к классу аско- мицетов, занимают разнообразные экологические ниши и встречаются в различных климатических поясах. На территории России виды Fusarium распространены во всех регионах, в которых выращивают сельскохозяйственные культуры, в первую очередь злаки. Этот гриб причиняет существенный ущерб сельскохозяйственной и пищевой промышленности, исчисляемый сотнями миллионов долларов ежегодно. Кроме того, микотоксины, продуцируемые представителями рода Fusarium, представляют угрозу здоровью человека и животных, а также действуют как факторы патогенности по отношению к растениям [1].

Наиболее обширной группой токсических метаболитов, продуцируемых грибами рода Fusarium, являются трихотеценовые микотоксины (ТрМТ). Трихотеценовые микотоксины продуцируются не только представителями рода Fusarium, но и родов Myrotecium, Trichoderma, Cephalosporium, Verticimonosporium, Stachybotrys [2]. На сегодняшний день выявлено около 200 трихотеценовых токсинов [3-6]. ТрМТ представляют собой сесквитерпено- вые соединения, состоящие из трех колец, у которых при атомах С-12-С-13 находится эпоксидное кольцо, а при С-9--С-10 - двойная связь, поэтому группа носит название 12,13-эпокситрихотец-9-ены. В зависимости от структуры боковых групп трихотеценовые токсины делятся на четыре типа (A-D), при этом лишь А и В продуцируются грибами рода Fusarium. К более токсичным представителям трихотеце- нов типа А относятся диацетоксисцирпенол (ДАС), а также токсины Т-2 и НТ-2, а основными продуцентами этих токсинов являются F. sporotrichioides и F. langsethiae. В 2015-2016 гг. была описана новая группа трихотеценовых токсинов типа А, получившая название NX [7, 8]. Интересно, что эти соединения идентифицированы в культурах F. graminearum, традиционного продуцента ТрМТ В-типа. Тип В представлен такими соединениями, как нивале- нол (НИВ), дезоксиниваленол (ДОН), а также их ацетилированными производными (3- и 15-АДОН и 4,15-АНИВ), которые продуцируются F. graminearum, F. culmorum, F. cerealis, а также группой видов, известной под названием F. graminearum species complex (FGSC) [9, 10]. Кроме того, F. poae,

venenatum и F. equiseti способны продуцировать токсины, относящиеся как к А-, так и к В-типам Тип токсинов, продуцируемых тем или иным штаммом, определяется структурой и функциями генов, входящих в состав трихотеценового кластера [12, 13]. У большинства трихотеценобразующих видов Fusarium в состав основного кластера входят 12 генов, кодирующих как ферменты, ответственные за различные этапы биосинтеза, так и регуляторные факторы, некоторые из которых контролируют экспрессию большого числа генов, связанных с различными аспектами метаболизма и жизнедеятельности грибов [14]. Трихотеценовые токсины ингибируют синтез белка у эукариот [15], а такие трихотеце- ны, как ДОН, представляют собой важные факторы агрессивности, способствуя распространению гриба по тканям растения-хозяина. Показано, что искусственная инокуляция колоса злаков мутантными штаммами F. graminearum, у которых нарушен синтез ДОН, приводила к поражению меньшего количества зерновок, чем инокуляция штаммами дикого типа [16].

Опасность, которую представляют грибы рода Fusarium и продуцируемые ими микотоксины, делает необходимой разработку методов быстрого и надежного определения видовой принадлежности штаммов, что позволит определять спектр соединений, накапливающихся в культуре или партии зерна. На сегодняшний день важную роль в таксономических исследованиях рода Fusarium и идентификации его представителей играют методы, основанные на анализе полиморфизма ДНК. Применение молекулярно-генетического подхода позволило более четко установить стандарты и границы видов, а также охарактеризовать целый ряд новых таксонов. В частности, мультилокусный филогенетический анализ с использованием ДНК-маркеров с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов (SCAR-маркеры [17]) на основе 13 генов «домашнего хозяйства» позволил выявить 9 новых видов в составе FGSC [10], который ранее считался единым видом F. graminearum. Чуть позднее этот комплекс был дополнен также видами F. vorosii и F. gerlachii [18]. Всего в составе комплекса FGSC выделяют 16 филогенетических видов [19]. Применение филогенетического подхода дало возможность подтвердить статус F. pseudograminearum и F. culmorum как самостоятельных видов [20, 21]. На территории России с помощью анализа полиморфных ДНК-маркеров идентифицированы группы штаммов, впоследствии охарактеризованные как два новых вида - F. ussuria- num, морфологически и фенотипически сходный с F. graminearum [22], и F. sibiricum, близкородственный F. sporotrichioides [23]. Ряд недавних филогенетических исследований позволил установить сложную структуру комплекса видов F. equiseti-F. incarnatum (FIESC) и выделить в его составе несколько новых видов [24]. Кроме того, изучение меж- и внутривидового полиморфизма ДНК позволило разработать ряд высокоспецифичных систем диагностики и идентификации основных возбудителей фузариоза, прежде всего, основанных на ПЦР и ее модификациях [2529]. Применение современных молекулярно-биологических и биоинформатических методов, в том числе полногеномного секвенирования [30, 31], существенно ускорило изучение генетического разнообразия рода Fusarium и функциональную характеристику элементов геномов, однако поиск эффективных методов молекулярного маркирования и информативных ДНК-баркодов остается по-прежнему актуальным [32, 33].

Род Fusarium отличается от большинства других таксонов царства Грибы (Fungi). «Золотым стандартом» молекулярной таксономии грибов считается область внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК (ITS) [34]. Однако в геноме представителей рода Fusarium эти маркеры представлены двумя неортологичными копиями и не обладают достаточным уровнем межвидового полиморфизма [35]. На сегодняшний день в филогенетических и таксономических исследованиях в качестве маркера наиболее часто используется ген TEF1a [36, 37]. Интересным представляется использование в качестве филогенетических маркеров генов, вовлеченных в биосинтез микотоксинов. Так, ген, кодирующий триходиенсинтетазу (TRI5), ранее использовали для разработки систем видоспецифичных праймеров [38] и изучения внутривидового полиморфизма представителей комплекса видов F. equiseti [39, 40]. Однако филогенетические характеристики гена TRI5 не сравнивали с характеристиками «классических» маркеров, таких, как TEFla. Среди других генов, входящих в состав трихотеце- нового кластера и применяемых в филогенетических исследованиях, необходимо отметить TRI1, кодирующий цитохром-Р450-монооксигеназу, и TRI12, кодирующий белок, участвующий в транспорте токсинов из клетки [41]. Филогенетический анализ гена TRI1 позволил идентифицировать группу штаммов F. graminearum, обладающих способностью к синтезу токсина NX-2 [7]. Полиморфизм гена TRI12 использовали для дизайна праймеров, выявляющих штаммы-продуценты ТрМТ типа B в соответствии с их хемотипом (3/15-АДОН, НИВ) [42]. В состав трихотеценового кластера входит также ряд генов, практически не охарактеризованных ни структурно, ни функционально, таких, как TRI9 и TRI14 [43].

Содержащиеся во всероссийских коллекциях штаммы Fusarium, потенциально способные к синтезу ТрМТ и представляющие различные климатогеографические зоны России, практически не охарактеризованы молекулярно-генетическими методами. Поэтому основными целями нашей работы были: (1) анализ корректности таксономической идентификации трихотеценпродуцирующих штаммов Fusarium, депонированных во всероссийских коллекциях, с помощью SCAR-маркеров; (2) изучение молекулярногенетического разнообразия штаммов различного географического происхождения, выделенных в разные годы и из разных источников; (3) определение меж- и внутривидового полиморфизма гена TRI14, одного из наименее изученных генов трихотецено- вого кластера; (4) определение хемотипов штаммов- продуцентов ТрМТ типа В с помощью известных систем праймеров, с подтверждением полученных результатов методом ВЭЖХ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штаммы грибов

В работе анализировали 60 штаммов 12 видов грибов рода Fusarium, депонированных во всероссийских коллекциях и предположительно обладающих способностью к биосинтезу ТрМТ. При выборе штаммов исходили из максимального охвата различных природно-географических зон России. Кроме того, в исследование были включены штаммы из ряда сопредельных государств, а также из Молдовы и Германии. Кроме того, изучен штамм F. graminearum F-892 (ВКПМ), депонированный в базе данных Strainlnfo (http://www.straininfo.net) под номером ATCC 36015. Перечень штаммов с указанием их географического происхождения, видов растений-хозяев, годами сбора и принадлежности к той или иной коллекции приведен в табл. 1. Дополнительно с помощью лабораторного микроскопа МИКМЕД 6 («Ломо», Россия) определяли морфологические характеристики ряда штаммов, первоначальная идентификация которых не подтверждалась молекулярными методами. Для проведения микроскопического анализа штаммы грибов выращивали в течение 10-14 сут на гвоздично-листовом агаре (ГЛА) и синтетической среде Ниренберга (SNA).

Выделение ДНК

Перед выделением ДНК моноспоровые культуры грибов выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) в течение 10 сут при комнатной температуре до получения обильного мицелия. ДНК из моноспоровых культур грибов выделяли с помощью метода, основанного на использовании цетилтриметиламмоний бромида в качестве детергента, с учетом модификаций, описанных нами ранее [28]. Концентрацию образцов ДНК и их чистоту оценивали с помощью спектрофотометра NanoVue (GE Healthcare, США).

Дизайн универсальных праймеров, проведение ПЦР, секвенирование

Для амплификации частичных последовательностей генов TEFla, TRI5 и TRI14 сконструированы пары праймеров TEF50F (5'-CGACT- CTGGCAAGTCGACCAC-3') и TEF59 0 R (5'-CTCGGCTTTGAGCTTGTCAAG-3'); TRI5F (5'-ACACTGGTTCTGGACGACAGCA-3') и TRI5R (5'-CCATCCAGTTCTCCATCTGAG-3'); TRI14F (5'-GAAGCTGCCTCGACATGGCTC-3') и TRI14R (5'-AATAATATTATGGGGAACAATCAT-3').

Праймеры подбирали с использованием алгоритма ClustalW [44]. Физико-химические свойства праймеров оценивали с помощью программы Oligo 6.71.

ПЦР проводили с использованием следующих программ амплификации.

Праймеры TEF50F-590R: 93°С, 90 с; 93°С, 20 с; 64°С, 5 с; 67°С, 5 с (5 циклов); 93°С, 1 с; 64°C, 5 с; 67°С, 5 с (40 циклов).

Праймеры TRI5F-R и TRI14F-R: 93°С, 90 с; 93°С, 10 с; 55°С, 15 с; 72°С, 10 с (40 циклов).

ПЦР и электрофоретический анализ проводили согласно [27, 28].

Продукты ПЦР клонировали с использованием системы InstA Clone PCR Cloning Kit (Fermentas, Литва) в соответствии с протоколом производителя. ДНК секвенировали в ЗАО «Евроген» с использованием набора реактивов ABI PRISM BigDye

Таблица 1. Штаммы грибов рода Fusarium, использованные в работе

* Штаммы из коллекции ВНИИФ; **штаммы из коллекции ВИЗР; ***штаммы из коллекции ИБФМ; ****штаммы из коллекции ГосНИИГенетика. 'Первоначально идентифицирован как F. graminearum.

2В ходе работы видовая принадлежность не подтвердилась.

3Первоначально идентифицирован как F. роае.

Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.

Охарактеризованные в настоящей работе последовательности нуклеотидов депонированы в GenBank NCBI под номерами: MG989711-989751 (TEF1a), MH001611-001651 (TRI5), MH001652-001692 (TRI14).

Филогенетический анализ

ДНК-маркеры с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов сравнивали с последовательностями, депонированными в базах данных GenBank NCBI и Fusarium MLST (http://www. westerdijkinstitute.nl/fusarium/) с помощью алгоритма BLAST. Построение филогенетических деревьев проводили с использованием метода максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) и модели нуклеотидных замен GTR + G (General Time Reversible, с гамма-распределением) [45] в программе MEGA5.1 [46]. Помимо исследуемых штаммов в филогенетическом анализе использовали ряд последовательностей соответствующих генов типовых штаммов из международных коллекций, депонированных в базах данных. Достоверность топологий филогенетических деревьев подтверждали с помощью бутстреп-анализа с 1000 повторностей. Инсерции и делеции при проведении анализа не учитывали. Количество вариабельных, филогенетически информативных нуклеотидов и гаплотипов для каждого маркера вычисляли, используя выборку из 41 штамма в программе DnaSP v6 [47].

Молекулярное типирование продуцентов ТрМТ типа В

С целью определения хемотипов продуцентов ТрМТ типа В анализировали штаммы F. gra- minearum, F. culmorum, F. cerealis, F. ussurianum. Хемотип-специфичную ПЦР проводили с использованием трех наборов праймеров: два набора праймеров на полиморфные участки гена TRI12 [42] (набор обозначен нами как 12-1), [48] (12-2), а также пара праймеров, амплифицирующая фрагменты последовательности гена TRI13 разной длины в зависимости от хемотипа [49] (13-1). Структура праймеров и температура их плавления приведены в табл. 2. При этом в случае системы 12-2 анализ решено проводить с каждой парой праймеров отдельно, а не в формате мультиплексной ПЦР [48], что позволит повысить специфичность анализа, а также избежать образования неспецифических ампликонов.

Полученные результаты подтверждали с помощью количественной ПЦР (кПЦР) с парами праймеров из систем 12-1 и 12-2. В состав реакционной смеси, помимо стандартных компонентов, добавляли по 1.5 мкл 20х красителя EvaGreen (Biotium, США). Амплификацию и детекцию флуоресцентного сигнала проводили в детектирующем ампли- фикаторе ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Результаты ПЦР выражали в значении пороговых циклов (quantification cycle, Cq, [50]). Анализ каждого образца проводили в двух независимых повторностях.

Анализ токсинообразования штаммов- продуцентов ТрМТ типа В методом ВЭЖХ

Для определения типа ТрМТ, продуцируемых исследуемыми штаммами, культуры грибов выращивали на жидкой среде MYRO [51] при 25°С, 220 об/мин в течение 5 сут. Способность изолятов продуцировать ДОН и его моноацетилированные производные определяли, анализируя отделенный от мицелия центрифугированием супернатант культурального фильтрата, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой [52, 53]. Аликвоту супернатанта культуральной жидкости объемом 8 мл разбавляли смесью ацетонитрил : вода (1 : 1) до 10 мл, пропускали через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0.22 мкм и вводили 10 мкл образца в инжектор жидкостного хроматографа Waters 1525 Breeze, снабженного УФ-детектором Waters 2487 (Waters, США). Разделение проводили на колонке Symmetry C18 (150 х 4.6 мм), которую термостатировали при 27С. Микотоксины элюировали смесью ацетонитрил : метанол : вода (1 : 1 : 8 об/об/об - подвижная фаза) со скоростью потока 0.5 мл/мин и детектировали при 254 нм. В качестве стандартов использовали коммерческие препараты ДОН, 3-АцДОН и 15-АцДОН (Sigma-Aldrich, США), а в качестве контроля - фильтрат неинокулирован- ной среды MYRO, которую инкубировали одновременно с выращиванием погруженных культур грибов в указанных выше условиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Филогенетические свойства генов, анализ их частичных последовательностей с помощью алгоритма BLAST, микроскопический анализ морфологии штаммов со спорной идентификацией

Основные филогенетические свойства анализируемых генов приведены в табл. 3. ДНК всех штаммов при амплификации с парой праймеров 50F-590R образовывала единственный продукт амплификации размером от 452 до 483 п.о., содержащего два интрона длиной от 80 до 100 и от 236 до 254 п.н. За вычетом инсерций и делеций, не учитываемых при оценке филогенетических свойств, длина анализируемых последовательностей составила 392 п.н., включая 129 (32.9%) вариабельных нуклеотидов. Число филогенетически информативных позиций - 115 (29.3%), число гаплотипов - 17. Анализ последовательностей гена TEF1a с применением алгоритма BLAST подтвердил первоначальную видовую идентификацию 54 штаммов. Из шести штаммов, идентификация которых не была подтверждена, три были изначально охарактеризованы как F. sambucinum. Показано, что последовательности TEF1a штаммов F-3966 (№ 51, см. табл. 1), NRRL 52726, относящегося к комплексу F. tricinctum species, и NRRL 52727 (F. avenaceum), сходны на 99.3%. Сходство штамма F-4360 (№ 52) со штаммом F. acuminatum NRRL 52789 составляет 99.545%. Последовательность гена TEF1a штамма F-900 (№ 60) на 100% сходна с последовательностью фрагмента этого гена штамма NRRL 52764 F. commune. Не подтверждена первоначальная видовая принадлежность штамма F-3549 (№ 56), морфологически идентифицированного как F. equiseti: BLAST-анализ выявил 99% сходство с последовательностью штамма NRRL 34033 относительно редкого вида F. brachygibbosum. Штамм 58212 (№ 32), первоначально идентифицированный как F. graminearum, показал 100% сходство последовательности TEF1a со штаммами CBS 123751-123745, типовыми для F. ussurianum. Наиболее интересный результат получен при анализе результатов секве- нирования маркерной последовательности штамма F-846, первоначально идентифицированного как F. poae. Сравнение с последовательностями TEF1a типовых штаммов, депонированными в базах данных, не выявило 100% сходства ни с одной из них. Наиболее близкой была последовательность штамма F-0016 вида F. polyphialidicum (DQ295144, сходство 97%).

Примечание. ДП - длины анализируемых последовательностей, GC - GC-состав, ВП - вариабельные позиции (variable sites), ФИП - филогенетически информативные позиции (parsimony informative sites), ГТ - гаплотипы, H_d - гаплотипическое разнообразие, P. - нуклеотидное разнообразие.

Пара праймеров TRI5F-R обеспечивала амплификацию ДНК всех исследуемых штаммов, за исключением № 51, 52, 56 и 60. Продукт амплификации гена TRI5 длиной 431-440 п.н. содержал один интрон длиной 52-61 п.н. Длина анализируемых последовательностей составила 379 п.н., в том числе 141 (37.2%) вариабельная позиция и 137 (36.1%) филогенетически информативных, число гаплотипов - 13. Анализ последовательностей с помощью BLAST подтвердил корректность видовой идентификации 54 штаммов. Продукт амплификации ДНК штамма 58212 показал 99% сходство с последовательностью фрагмента гена TRI5 F. asiaticum (штаммы NRRL 26156, 28720). Необходимо отметить, что ни одна из баз данных не содержала записей о полных или частичных структурах этого гена у штаммов F. ussurianum, однако, принимая во внимание близкое родство F. asiaticum и F. ussurianum [7], этот результат представляется достоверным. Продукт амплификации ДНК штамма F-846 был на 98% сходным с частичной последовательностью гена TRI5 штамма F. langsethiae KF2640 (JF966259).

При проведении ПЦР с парой праймеров TRI14F-R не были выявлены продукты амплификации ДНК образцов № 51, 52, 56, 60 (как и в случае пары TRI5F-R), а также № 58 (F-846). ДНК остальных штаммов амплифицировалась с образованием продуктов размером от 698 до 705 п.н., содержащих один интрон длиной от 50 до 59 п.н. Длина анализируемой последовательности (без учета вставок и делеций) составила 650 п.н., из которых 239 (36.8%) вариабельные, а 224 (34.5%) - филогенетически информативные, число гаплотипов - 23. Поиск сходных последовательностей в базах данных GenBank и Fusarium MLST показал, что исследованные штаммы F. graminearum составляют две группы: первая, в которую входят № 30 и 58, показала 100% сходство с последовательностью TRI14 штамма CBS 138562 (KU572434.1), в то время как вторая (№ 27-29, 31) полностью идентична последовательности штамма CBS 138561 (KU572429.1), при этом сходство последовательностей в этих двух группах составляло 97%.

Проведен микроскопический анализ основных морфологических структур штаммов, первоначальная идентификация которых не была подтверждена при анализе маркерных последовательностей. У штаммов F-3966 и F-4360, растущих на ГЛА, выявлены удлиненные изогнутые макроконидии с тремя- четырьмя перегородками, характерными для F. av- enaceum, F. tricinctum и F. acuminatum [54]. Штамм F-900 также формировал изогнутые макроконидии с четырьмя перегородками и микроконидии овальной формы размером порядка 10 мкм - признаки, соответствующие характеристикам вида F. commune [55]. У штамма F-846 обнаружены толстостенные микроконидии с четырьмя-пятью перегородками, а также овальные и булавовидные микроконидии. Этот результат подтверждает предположение об ошибочности первоначальной идентификации штамма как F. poae, поскольку для этого вида характерны шаровидные или остроконечные микроконидии, а также редко формирующиеся макроконидии, как правило, с тремя перегородками [54].

Анализ топологии филогенетических деревьев

Филогенетические деревья, построенные на основе структур трех изучаемых генов, имели как сходство, так и ряд существенных топологических различий. На дендрограмме гена TEF1a (рис. 1) присутствуют четыре крупных кластера, поддержанных высокими значениями бутстрепа (98-99%). Каждый кластер включал штаммы видов, характеризующихся сходными спектрами продуцируемых микотоксинов. Кластер I (бутстреп-поддержка 98%) представлен видами, продуцирующими ТрМТ типа В (в том числе F. pseudograminearum CBS109954, номер KM434220), кластер II (99%) сформирован продуцентами ТрМТ типа А, кластер III (98%) представлен видами, образующими оба типа ТрМТ, а кластер IV (99%) - видами F. equiseti и F. incarnatum, также способными продуцировать токсины как типа А, так и В, однако, в отличие от F. poae и близкородственных видов, они обладают также способностью к синтезу зеараленона и некоторых других микотоксинов. Необходимо отметить, что кластеры I-III и IV формировали отдельные группы, поддержанные высокими значениями бутстрепа (99%), а «F. sp.» (штамм F-846 Fusarium sp.) занимал промежуточное положение между этими двумя группами. Кластеры I и II включали в себя по две подгруппы: первую подгруппу кластера I (поддержка 99%) составили штаммы видов F. culmorum и F. cerealis, а вторую (98%) - F. graminearum и F. ussurianum. В кластере II подгруппы были представлены видами F. langsethiae и F. sporotrichioides/F. sibiricum (бутстреп-поддержка по 99% каждая). Наиболее неоднородным был кластер IV, представленный видами F. equiseti и F. incarnatum. Два типовых штамма F. incarnatum (NRRL 22244 и NRRL 34059) формировали отдельную группу, поддержанную значением бутстрепа 59%, в которую, однако, не вошел штамм F-2681, исследованный в настоящей работе. Штамм F. equiseti 97001 сформировал подгруппу (90%) вместе со штаммами H2-

5B (JF496575) и 10393 (LN901566), а штаммы 65901 и 64414 вошли в состав другой подгруппы (99%), куда также входили штаммы VI01095 (AJ543560), VI01070 (AJ543562) и 10675 (LN901573).

Бутстреп-поддержка основных кластеров, соответствующих токсигенным профилям исследуемых видов, на дендрограмме гена TRI5 (рис. 2) составляла от 94 (кластер III) до 100% (кластеры I, II, IV). В отличие от дендрограммы гена TEF1а, «F. sp.» занимал промежуточное положение между кластерами II и III. Кроме того, штаммы F. sporotrichioides не формировали единой группы, а были распределены по кластеру II, в частности, штамм 33100 оказался в одной подгруппе со штаммами F. siЫricum (поддержка 98%). В составе кластера I отсутствовала подгруппа F. graminearum-ussurianum, характерная для дендрограммы TEF1a. На филогенетическом дереве гена TRI14 (рис. 3) штаммы F. ussurianum сфор-

мировали подгруппу со штаммами F. сетеаШ (бут- стреп-поддержка 95%), в то время как штаммы F. дтатіпеатит разделились на две подгруппы, поддержанные значениями бутстрепа 99 и 100%. В состав кластера II входят подгруппы F. langsethiae (98%) и F. spoтotrichioides/sibiricum (91%); таким образом, топология этого кластера на дендрограмме TRI14 соответствовала скорее топологии дендрограммы TEF1a, чем TRI5. Необходимо отметить, что в составе кластера IV штаммы F. equiseti 64414, 65901 и F. іпсатпаШт F-2681, с одной стороны, и штамм F. eq- и^еЫ 97001, с другой, формировали отдельные ветви на дендрограммах обоих TRI-генов.

В структуре филогенетического дерева, построенного на основе анализа комбинированной последовательности генов TEF1a, TRI5 и TRI14 (рис. 4), можно выделить четыре крупных кластера, поддержанных значениями бутстрепа 100%. Обращает на себя внимание существование общей группы, включающей кластеры II и III (бутстреп-поддержка 96%).

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения частичных последовательностей нуклеотидов гена TRП4 видов-продуцентов ТрМТ с помощью метода максимального правдоподобия (45 последовательностей). Показаны значения бутстрепа более 50% для 1000 повторностей. В анализ включены четыре последовательности типовых штаммов, депонированных в GenBank NCBI

Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения комбинированной последовательности нуклеотидов генов TEF1 а+TRI5+TRП4 видов-про- дуцентов ТрМТ с помощью метода максимального правдоподобия (41 последовательность). Показаны значения бутстрепа более 50% для 1000 повторностей

Хемотипирование штаммов-продуцентов ТрМТ типа В, определение микотоксинов методом ВЭЖХ

В табл. 4 приведены результаты анализа 33 штаммов-продуцентов ТрМТ типа В методом кПЦР с наборами праймеров 12-1 и 12-2. От использования набора 3-1 в ходе исследования было решено отказаться, поскольку при электрофоретическом анализе продуктов амплификации во всех образцах выявлены две специфические полосы (данные не приведены), т.е. не удавалось разделить хемотипы 3-АДОН и 15-АДОН F. дгатіпеагит. Согласно результатам хемотипирования, все проанализированные штаммы F. сиїтогит и F. ussurianum принадлежат к хемотипу 3-АДОН, к нему же относятся штаммы F. дгатіпеагит 58033 и 70725. ДНК штаммов F.

graminearum G.8-8, 41806, 48702 амплифицировалась с парой праймеров 12CON-12-15F, что свидетельствует об их принадлежности к 15-АДОН-хемотипу (однако в образцах F. graminearum 14-17 выявлены также минорные полосы, что, вероятно, связано с условиями проведения ПЦР).

Таблица 4. Результаты кПЦР ДНК 33 штаммов рода Fusarium, относящихся к продуцентам ТрМТ типа В, с использованием наборов праймеров 12-1 и 12-2

Примечание. ВЭЖХ - результаты анализа методом ВЭЖХ. «?» - минорные полосы детектированы при электрофоретическом анализе либо амплификация на последних циклах кПЦР; «н/а» - не анализировали.

Анализ токсинообразующей способности штаммов методом ВЭЖХ подтвердил данные молекулярного типирования большей части образцов (табл. 4). В большинстве культур ДОН количественно преобладал над ацетилированными производными, в культурах штаммов F. graminearum G.8-8, F. culmorum KP-1599-25/3, KS-1384-1, F. ussurianum 58212 производные обнаружены не были. На рис. 5 в качестве примера изображена хроматограмма культуральной жидкости штамма F. ussurianum 29813, содержащая пики, соответствующие ДОН (время удерживания 4.453) и 3-АДОН (время удерживания 5.483).

ОБСУЖДЕНИЕ

Основной задачей настоящей работы было изучение генетического разнообразия и токсигенных характеристик выделенных в разные годы в разных регионах России и депонированных во всероссийских коллекциях штаммов грибов рода Fusarium, потенциально способных к синтезу ТрМТ. Другой важный аспект исследования - расширение сведений о структурных особенностях генов, относящихся к основному трихо- теценовому кластеру, связанных с синтезом токсинов и патогенными свойствами гриба.

Поскольку ген TEF1a на сегодняшний день считается наиболее изученным и наиболее филогенетически информативным SCAR-маркером представителей рода Fusarium, анализ его последовательностей стал основой для верификации таксономического статуса коллекционных штаммов. Первоначальная идентификация шести из 60 образцов не была подтверждена. Использование комбинации молекулярно-генетического и морфологического подходов позволило с высокой достоверностью определить видовую принадлежность «спорных» штаммов. Штамм 58212 (первоначально F. graminearum) был идентифицирован как F. ussurianum, что хорошо согласуется с его географическим происхождением (Приморский край) и с тем фактом, что виды F. graminearum и F. ussurianum практически невозможно отличить по морфологическим признакам. Штаммы F-3966 и F-4360, депонированные в коллекциях как F. sambucinum, идентифицированы как F. avenaceum и F. acuminatum соответственно. Виды F. acuminatum и F. avenaceum не продуцируют три- хотеценовые микотоксины, однако по занимаемым экологическим нишам и характеру роста на картофельно-сахарозном агаре сходны с F. sambucinum.

Рис. 5. Хроматограмма культуральной жидкости штамма F. ussurianum 29813. Пик, охарактеризованный временем удерживания 4.453 - ДОН; пик, охарактеризованный временем удерживания 5.483 (красный) - 3-АДОН

Данные о подобных ошибках отсутствуют, однако утверждается, что распространена неверная идентификация близкородственного к этим двум видам F. torulosum как F. sambucinum [54]. Штамм F-900, выделенный из почвы лесопитомника в Красноярском крае, по результатам комплексного исследования идентифицирован как F. commune. Вид F. њmmune, описанный в 2003 г. [55], до настоящего времени не выявлялся на территории России. Согласно имеющимся данным, F. commune может быть как почвенным сапрофитом, так и поражать различные растения, в том числе важные в хозяйственном отношении культуры. F. commune считается таксономически близким к комплексу видов F. оxysporum, он не способен к синтезу ТрМТ [56], что подтверждается отсутствием продуктов ПЦР-амплификации с парами праймеров к генам TRI5 и TRI14. Штамм F-846, выделенный из дыни (Молдова, 1958), который по данным Всероссийской коллекции микроорганизмов представляет собой F. poae, при анализе последовательностей генов TEF1aи TRI5 не показал 100% сходства ни с одной из последовательностей, депонированных в базах данных. По структуре маркерных генов наиболее близкими к нему оказались штаммы F. polyphi- alidicum F-0016 (TEF1a) и F. langsethiae F2640 (TRI5). Родство F-846 с F. polyphialidicum не подтверждено анализом морфологических структур. Что же касается штамма F2640, депонированного в GenBank, то существуют сомнения в правильности его отнесения к F. langsethiae, что подтверждается значительными различиями в структуре гена TRI5 этого штамма и типовых штаммов F. langsethiae. На дендрограммах генов TEFla и TRI5 F-846 занимал промежуточное положение и не был отнесен ни к одному из крупных кластеров. Можно осторожно предположить, что штамм F-846 представляет собой отдельный филогенетический вид, однако для подтверждения этого предположения необходим дополнительный анализ с использованием большего спектра ДНК- маркеров, исследование токсинообразующей способности, а также дополнительных морфологических и физиологических данных.

В последние годы показано, что вид F. equiseti вместе с близкородственным F. incarnatum обладает сложной филогенетической структурой, формируя неоднородную группу, называемую «F. incarnatum- equiseti species complex» (FIESC). Штаммы F. equiseti из северной и южной Европы образуют две разные группы, названные типами I и II [57]. В настоящей работе маркерные последовательности гена TEF1a штаммов из различных регионов России сравнивали с последовательностями этого гена штаммов VI01070 и VI01095, относящихся к типу I, штамма H2-2-5B, относящегося к типу II, а также штаммов 10675 и 10393, проанализированных в [40]. Сравнение последовательностей и филогенетический анализ TEF1a показали, что штамм 97001, по всей видимости, принадлежит к типу II (южная Европа), что коррелирует с его географическим происхождением (Сев. Осетия), в то время как штаммы 64414 и 65901 (Калининградская и Ленинградская обл. соответственно) относятся к североевропейскому типу I. Исключением из этого правила стал штамм 10675 (LN901573), выделенный в 2009 г. из пшеницы в Испании, отнесенный, однако, согласно топологии сконструированного дерева, к типу I. К типу I также принадлежал штамм F-2681 F. incarnatum.

Использование в филогенетических исследованиях структур генов, ответственных за различные этапы биосинтеза микотоксинов, является дискуссионным, поскольку большая часть этих генов приобретена в результате горизонтального переноса. Сравнительный анализ таких маркеров, как правило, не вполне корректно отражает эволюционные отношения между таксонами, однако может быть полезен при выявлении особенностей токсинообразования либо патогенных свойств штаммов. В настоящей работе нами исследованы частичные структуры двух входящих в трихотеценовый кластер генов - TRI5, кодирующего триходиенсинтетазу, ответственную за первый этап биосинтеза ТрМТ, и TRI14, точная функция которого неизвестна, однако предположительно связана с регуляцией биосинтеза ДОН или его транспортом за пределы клетки в процессе развития гриба в тканях зараженного растения [16]. Представленная в базах данных информация о последовательностях генов трихотеценового кластера достаточно ограничена. Так, депонировано по одной последовательности гена TRI5 F. venenatum и F. incarnatum и две - F. sambucinum. Найдены лишь три аннотации гена TRI14 F. sporotrichioides, одна - F. pseudograminearum, а также семь и четыре - в составе полных последовательностей трихо- теценового кластера F. graminearum и F. culmorum соответственно. Таким образом, впервые определены и депонированы в базу данных GenBank частичные последовательности гена TRI14 9 из 12 исследованных видов. Характерной особенностью генов TRI5 и TRI14 стал тот факт, что значительная часть вариабельных позиций у них сосредоточена в кодирующей части, что отражается и на различиях в аминокислотных последовательностях соответствующих белков между и внутри видов. Обратная картина наблюдается в случае гена TEF1a, у которого все вариабельные позиции находятся в интронах, а кодирующая часть отличается высокой консервативностью. Как мы полагаем, такой характер различий может быть следствием разной эволюционной истории этих генов, а также того, что фактор элонгации трансляции не относится к белкам, специфичным для рода Fusarium, в то время как полиморфизм аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами TRI, имеет важное адаптивное значение. Этим же можно объяснить различия в топологии филогенетических деревьев, построенных на основе TEF1a, TRI5 и TRI14. Одно из таких различий - формирование кластерами II (продуценты ТрМТ типа А) и III (ТрМТ А+В) общих ветвей, поддержанных высокими значениями бутстрепа (90 и 75%), на дендрограммах генов TRI5 и TRI14 соответственно. В свою очередь, на дендрограмме гена TEF1a кластер II формирует общую ветвь с кластером I (продуценты ТрМТ типа В), хотя бутстреп-поддержка этой ветви была низкой (менее 50%). Также на дендрограммах генов TRI5 и TRI14 штаммы F. ussuria- num формировали единые кластеры со штаммами видов F. culmorum и F. cerealis, что противоречит эволюционным данным, согласно которым F. ussu- rianum наиболее близок к виду F. graminearum [22], что подтверждено при филогенетическом анализе TEF1a. На дендрограмме гена TRI14 исследованные штаммы F. graminearum были разделены на два кластера с высокой бутстреп-поддержкой, однако нам не удалось связать эту группировку ни с хемотипом штаммов, ни с их географическим происхождением.

Можно предположить существование связи между полиморфизмом гена TRI14 и различиями в агрессивности разных штаммов по отношению к расте- нию-хозяину. Однако в рамках настоящей работы таких исследований не проводилось. Для гена TRI5 также не выявлено корреляции между хемотипами F. graminearum (3/15-АДОН) и филогенетической структурой вида. Кроме того, ни один из проанализированных штаммов F. graminearum и F. culmorum не содержал 8-нуклеотидной делеции (TGGAACAA), маркерной для слаботоксигенных штаммов этих видов [58].

Несмотря на приблизительно одинаковое содержание вариабельных и филогенетически информативных позиций, а также гаплотипическое разнообразие трех генов, анализ TEFla более точно отражал филогенетическую структуру и предполагаемое эволюционное развитие группы видов рода Fusarium - продуцентов ТрМТ. Этот результат согласуется с данными, полученными ранее при исследовании полиморфизма других генов, вовлеченных в биосинтез микотоксинов, например TRI1 [7], или гена энниатин- синтазы (Esynl) - ключевого фермента биосинтеза энниатинов у F. avenaceum и близкородственных видов [28, 59].

Принадлежность к тому или иному хемотипу является специфической характеристикой штамма, продуцирующего В-трихотецены. В последние годы опубликованы работы, посвященные встречаемости хемотипов продуцентов В-трихотеценов (прежде всего, F. graminearum) в различных регионах мира, например в Южной Америке [60], Африке [61] и Европе [62, 63]. В 2016 г. были опубликованы результаты обширного исследования, проведенного специалистами из 17 стран Европы, в том числе из России [64], практическим результатом которого стало создание европейской базы данных (www.cata- logueeu.luxmcc.lu). В этой базе данных содержится информация о 187 штаммах, выделенных на территории России, при этом нет упоминания о штаммах из целого ряда регионов, таких, как Западная Сибирь и Волго-Вятский район, а также сведений о хемотипах коллекционных образцов, выделенных в прошлые годы. В настоящем исследовании для анализа типа ТрМТ мы применили комбинированный подход, включающий хемотипирование с использованием хемотип-специфических праймеров, описанных ранее (см. раздел «Молекулярное типирование продуцентов ТрМТ типа В»), а также анализ культуральных жидкостей некоторых штаммов методом ВЭЖХ. С помощью наборов праймеров, специфичных к полиморфным участкам гена TRI12 (12-1 и 12, удалось установить хемотипы штаммов четырех видов, продуцирующих ТрМТ типа В. Показано, что штаммы F. си1тогит и F. ussurianum относятся к 3-АДОН-хемотипу, штаммы F. свтгаШ - к НИВ- хемотипу, а среди штаммов F. дтаттватит присутствуют продуценты как 3-АДОН, так и 15-АДОН. Необходимо имет...