Структура генома клинических изолятов Mycoplasma hominis, устойчивых к ципрофлоксацину

Размещено на http://www.allbest.ru/

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Структура генома клинических изолятов Mycoplasma hominis, устойчивых к ципрофлоксацину

Е.А. Колесникова, Н.Ф. Бруснигина,

М.А. Махова, А.Е. Алексеева

Нижний Новгород

РЕФЕРАТ

микоплазма геном ципрофлоксацин аминокислотный

С использованием NGS-секвенирования на платформе Illumina изучена структура генома трех устойчивых к ципрофлоксацину клинических изолятов Mycoplasma hominis. Определена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей исследуемых штаммов микоплазм. Показана ограниченность биосинтетических возможностей M. hominis (М45, М57, МН1866), связанная с преобладанием в их геноме генов, кодирующих белки, которые участвуют в катаболических процессах. Обнаружены множественные однонуклеотидные замены, обусловливающие внутривидовой полиморфизм M. hominis. Выявлены гены, кодирующие эффлюксные системы - АВС-транспортеры (ATP-binding cassette superfamily) и белки семейства MATE (Multidrug and toxic compound extrusion family). Установлено, что молекулярный механизм резистентности к ципрофлоксацину у изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 связан с заменой серина на лейцин в позиции 83 субъединицы А ДНК-гиразы, а у M. hominis МН1866 - с заменой лизина на аргинин в позиции 144 А-субъединицы топоизомеразы IV.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Mycoplasma hominis, структура генома, секвенирование, гены gyrA, parC, ABC- транспортеры, MATE.

ВВЕДЕНИЕ

Mycoplasma hominis -- один из наиболее распространенных представителей класса Mollicutes, характеризуется отсутствием ригидной клеточной стенки, способностью к персистенции на мембране клеток эукариот, малым размером генома, генетическим и клеточным полиморфизмом, ограниченностью метаболических путей, устойчивостью к антибактериальным препаратам, действие которых направлено на ингибирование биосинтеза клеточной стенки [1].

Известно, что штаммы M. hominis колонизируют преимущественно органы урогенитального тракта женщин и мужчин как в норме, так и при воспалительных процессах (уретрит, цервицит, вагинит, бактериальный вагиноз и др.). Доказана способность M. hominis колонизировать верхние дыхательные пути новорожденных и вызывать респираторные инфекции [1, 2].

Полученные за последние годы данные литературы свидетельствуют об увеличении частоты выявления урогенитальных микоплазм, резистентных к препаратам фторхинолонового ряда и макролидам, наиболее часто применяемым в терапии воспалительных заболеваний органов малого таза [3-5].

Мониторинг антибиотикорезистентности бактерий, в том числе M. hominis, - возбудителей репродуктивно-значимых инфекций, представляет важную медико-биологическую проблему, решение которой связано с изучением основ патогенности, резистентности и адаптации микоплазм к стрессовым условиям среды. Современные молекулярно-генетические технологии, в частности NGS-секвенирование, позволили приблизиться к пониманию этих процессов. Полная нуклеотидная последовательность генома M. hominis (M. hominis ATCC 23114 номер GenBank FP236530.1) была впервые секвенирована и расшифрована группой французских ученых под руководством S. Pereyre в 2009 г. [6]. В настоящее время в международной базе данных GenBank представлена информация о полногеномных последовательностях 23 штаммов M. hominis. Следует отметить, что изучение эволюционного разнообразия популяции M. hominis как в Российской Федерации, так и за рубежом сопряжено с трудностями, связанными с отсутствием информации об особенностях организации их генома, включая факторы патогенности и резистентности.

В нашей работе проанализирована структура генома ципрофлоксацин-резистентных клинических изолятов M. hominis, выделенных от женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Нами изучены три клинических изолята M. hominis (М45, М57, МН1866), выделенных из соскобов эпителия цервикального канала женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, от которых получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Обнаружение, идентификацию, определение антибиотикограммы микоплазм осуществляли с использованием коммерческих жидких дифференциально-диагностических сред производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора (РУ № ФСР 2008/03366). Все штаммы, включенные в исследование, обладали устойчивостью к ципрофлоксаци- ну. Результаты многолетнего микробиологического мониторинга распространенности и антибиотикоре- зистентности урогенитальных микоплазм, выделенных от женщин и мужчин как здоровых, так и с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, опубликованы ранее [7-10]. ДНК выделяли и очищали с использованием набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Полногеномное секвенирование проводили на секве- наторе MiSeq (Illumina, США). Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия). Подготовку библиотеки ДНК для секвенирования осуществляли с использованием набора Nextera XT (Illumina), секвениро- вание проводили с использованием набора MiSeq reagent kit v2 (Illumina) на 500 циклов. В качестве ре- ференсной была выбрана полногеномная последовательность штамма M. hominis АТСС 23114 (GenBank FP236530.1). Нуклеотидные последовательности выравнивали с использованием встроенного программного обеспечения секвенатора MiSeq (Isis version 2.6.2.3). Полученные данные визуализировали и анализировали с помощью программного обеспечения UGENE Unipro [11] и MEGA 7.0 [12]. Аннотацию генома проводили с использованием сервера RAST (Rapid Annotationusing Subsystem Technology) [13] и NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ annotation_prok/). Филогенетический анализ полногеномных последовательностей проводили с использованием web-сервиса REALPHY [14] Online tool версия 1.12 (https://realphy.unibas.ch/fcgi/realphy). В анализ включены все полные нуклеотидные последовательности геномов M. hominis, депонированные в базу данных RefSeq NCBI (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/refseq). Построение филогенетических деревьев осуществляли методом ближайшего соседа (Neighbor-Joining) [15] с использованием программного обеспечения MEGA 7.0 [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полные нуклеотидные последовательности геномов M. hominis депонированы в международную базу данных GenBank NCBI под номерами MRAY00000000 (M. hominis М45), MRAX00000000 (M. hominis М57) и Q0K000000000 (M. hominis МН1866). Исходные архивы ридов доступны под номерами: SUB 6713744 (M. hominis М57), SUB 6713764 (M. hominis М45), SUB 6713769 (M. hominis МН1866). В результате сек- венирования и сборки первичных прочтений получено от 18 (штамм МН1866) до 27 (штаммы М45, М57) контигов. Вероятнее всего, разрывы, обнаруженные при картировании геномов исследуемых изолятов M. hominis, связаны с отсутствием покрытия данного региона в исходном архиве ридов. Размер генома исследуемых штаммов варьировал от 633 286 п.н. (М57) до 642 227 п.н. (М45), доля GC составила 27.2%.

Структурный анализ генома клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866)

Рис. 1 Сравнительный анализ идентичности аминокислотных последовательностей штаммов M. hominis М45, М57 и МН1866. Результаты получены с помощью сервера RAST

Основные метрические показатели сборки генома M. hominis представлены в таблице.

Анализ данных, полученных с помощью сервера RAST (Rapid Annotationusing Subsystem Technology), выявил у штамма M. hominis М57 543 белоккодирующих гена и 546 - как у штамма M. hominis М45, так и у МН1866. В структуре генома M. hominis МН1866 обнаружено 16 псевдогенов, 30 - у штамма M. hominis М57 и 28 - у M. hominis М45. Подавляющее большинство псевдогенов представлено неполными нуклеотидными последовательностями с неизвестной функцией. Однако у части псевдогенов M. hominis выявлены преждевременные стоп-кодоны (три у штамма M. hominis М57) и мутации сдвига рамки считывания (четыре у M. hominis МН1866, по две - M. hominis М45 и M. hominis М57). В геномах всех штаммов обнаружено по две копии оперона 16S-23S-5S рРНК.

Установлено, что геномы исследуемых штаммов M. hominis являются высокогомологичными, степень гомологии на уровне аминокислотных последовательностей составляет около 95% (рис. 1).

Геномы всех трех штаммов имеют сходную структуру, поэтому на рис. 2 представлена диаграмма, отображающая распределение генов по функциям их продуктов, на примере изолята M. hominis МН1866.

Показано, что функции подавляющего числа генов M. hominis связаны с синтезом белка (39.1%), ДНК (13%) и РНК (11.6%) (рис. 2). Система центрального углеводного обмена (доля генов составляет 6.9%) исследуемых штаммов является усеченной и состоит из отдельных компонентов, участвующих в метаболизме пирувата, пентозофосфатов (предшественников рибозы и дезоксирибозы), глюкозы и лактозы. Отмечено, что геном микоплазм содержит гены pdP, deoD, deoB и deoC, кодирующие катаболиче- ские ферменты: пиримидин-нуклеозидфосфорила- зу, пурин-нуклеозидфосфорилазу, фосфопентому- тазу и дезоксирибоальдолазу соответственно. Эти ферменты участвуют в катаболизме дезоксирибо- зы и дезоксинуклеозида. В качестве единственного источника углерода и энергии штаммы M. hominis могут использовать 2-дезокси^-рибозильную часть 2'-дезоксирибонуклеозидов в результате каскада биохимических реакций ферментации дезоксири- бозы. Наличие генов, кодирующих ферменты цикла пуриновых оснований - аргининдезаминазу (ArcA), орнитинтранскарбамилазу (ArgF) и карбаматкиназу (ArqC), позволяет микоплазмам получать энергию в форме АТР альтернативным путем - посредством деградации аргинина и орнитина [6]. Доля продуктов мембранного транспорта, как и ферментов, преобра-

Рис. 2 Диаграмма распределения генов по функциональным группам на примере штамма M. hominis МН1866. Изображение получено с помощью сервера RAST. Цифры от 1 до 27 - условные обозначения подсистем в структуре генома. В скобках указано количество генов в подсистеме / % (процент генов в общей структуре генома)

зующих пурины, составляет 3% от общей структуры генома.

У каждого исследуемого изолята микоплазм выявлены гены, кодирующие эффлюксные системы, участвующие в мембранном транспорте, а именно АВС-транспортеры (ATP-binding cassette superfamily) и белки семейства MATE (Multidrug and toxic compound extrusion family). Система АВС- транспортеров представлена структурными элементами, осуществляющими транспорт олигопептидов через мембрану бактериальной клетки, а именно, тремя копиями гена oppB (кодирует транспортные белки - пермеазы OopB) и одной копией гена oppC (кодирует пермеазу OopC). Работа эффлюксных насосов системы МАТЕ обеспечивается электрохимическим градиентом ионов натрия (Na+) [16]. Полная последовательность гена, кодирующего белки семейства МАТЕ, в каждом анализируемом штамме микоплазм составила 1809 п.н.

Как уже сказано, исследуемые штаммы M. hominis (М45, М57, МН1866) характеризуются устойчивостью к ципрофлоксацину. Поиск мутаций, определяющих устойчивость к фторхинолонам, проводили путем анализа QRDR-области в генах, кодирующих топоизомеразы - gyrA и gyrB (субъединицы ДНК- гиразы), parC и parE (субъединицы топоизомеразы IV). Детальная характеристика генов gyrA, gyrB, parC и parE у изолятов M. hominis М45 и M. hominis

М57 приведена в ранее опубликованной работе [16]. Установлено, что резистентность изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 к ципрофлоксаци- ну связана с заменой серина (Ser) на лейцин (Leu) в позиции 83 А-субъединицы ДНК-гиразы [16]. Определено, что гены gyrA, gyrB, parC и parE изо- лята МН1866 содержат большое количество нуклеотидных полиморфизмов. Так, в гене gyrA обнаружено 47 точечных замен, в gyrB - 10, в parC - 45, в parE - 19. Показано, что устойчивость M. hominis МН1866 к ципрофлоксацину обусловлена мутацией в QRDR- участке гена parC, приводящей к замене лизина (Lys) на аргинин (Arg) в позиции 144 большой субъединицы топоизомеразы IV (рис. 3).

Рис. 3 Выравнивание аминокислотной последовательности А-субъединиц топоизомера- зы IV клинического изолята M. hominis МН1866 и референсного штамма M. hominis АТСС 23114 (PG21). Красным цветом выделена замена лизина (К) на аргинин (R)в позиции 144

Значимые замены в QRDR-области генов gyrA, gyrB и parE у M. hominis МН1866 нами не обнаружены.

Дендрограмма полной нуклеотидной последовательности генома штаммов M. hominis (М45, М57, МН1866) относительно геномов M. hominis, депонированных в базу данных GenBank, представлена на рис. 4.

Рис. 4 Дендрограмма полных нуклеотидных последовательностей генома штаммов M. hominis, депонированных в международной базе данных GenBank/ NCBI. *Выделен клинический изолят M. hominis М45, наиболее удаленный от других российских изо- лятов

Результаты филогенетического анализа показали, что изолят M. hominis М45 занимает обособленное положение относительно российских изолятов микоплазм и представляет отдельную филогенетическую ветвь. Изолят M. hominis MH1866 генетически близок к M. hominis МН1817 и формирует с ним единый кластер. Штамм M. hominis М57 выделен в отдельную ветвь среди основной группы российских изо- лятов микоплазм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Современные молекулярные методы позволяют понять, как функционирует один из самых малых по размеру геномов прокариот - геном M. hominis, а также оценить его эволюцию. Впервые полная структура генома M. hominis ATCC 23114 (GenBank FP236530.1) длиной 665 445 п.н. была расшифрована группой французских ученых под руководством S. Pereyre в 2009 г. [6]. В настоящее время (на 23 августа 2019 г.) в базе данных GenBank/NCBI доступна информация о полной структуре геномов семи штаммов M. hominis и неполных геномах 16 штаммов в виде контигов (пять штаммов) и скаффолдов (11 штаммов). Размер генома исследуемых изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) оказался меньше, чем у геномов микоплазм, депонированных в GenBank/ NCBI. Однако результаты биоинформатического анализа, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что основные характеристики (количество генов, псевдогенов, РНК, белоккодирующих последовательностей) генома штаммов M. hominis (М45, М57, МН1866) и референсного штамма M. hominis ATCC 23114 являются одинаковыми. Следует отметить, что полученные нами данные соответствуют информации о других представителях вида M. hominis, представленной в NCBI Genome (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/genomes/3075?).

Биоинформатический анализ структуры генома M. hominis (М45, М57, МН1866) выявил большое число псевдогенов. Известно, что псевдогены рассматриваются в качестве резерва последовательностей, которые рекомбинируют с функциональными паралогичными генами, и таким образом создают их генетическое разнообразие [17]. Отмечено, что количество псевдогенов в геноме изолятов M. hominis М45 и M. hominis М57 в 2 раза превышало аналогичные показатели у референсного штамма. Вероятно, что множественные псевдогены микоплазм обеспечивают ассортимент последовательностей, необходимый для создания генетического разнообразия поверхностных антигенов [17].

Филогенетические взаимоотношения между изученными штаммами и штаммами, геномы которых депонированы в GenBank, оценивали на основе сравнения однонуклеотидных полиморфизмов. Данные филогенетического анализа свидетельствуют о генетической гетерогенности исследуемых ципрофлокса- цин-резистентных изолятов M. hominis. Однако сравнительный анализ с использованием сервера RAST [13] выявил высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей белков штаммов микоплазм. Большое количество точечных мутаций в геноме M. hominis обусловливает их высокую генетическую пластичность и склонность к быстрой эволюции.

Преобладание в геноме M. hominis генов, кодирующих белки с катаболическими функциями, подтверждает ограниченность биохимических возможностей микоплазм. Импорт питательных веществ в клетку микоплазм из клеток хозяина происходит преимущественно при помощи транспортных белков [1], менее специфичных, чем аналогичные белки других бактерий. Транспортные белки микоплазм выполняют несколько функций. Так, белки OopB и OopC, входящие в систему АВС-транспортеров, участвуют не только в транспорте олигопептидов, но и в выведении лекарственных препаратов из бактериальной клетки [18]. При характеристике неспецифического механизма устойчивости M. hominis (М45, М57, МН1866) к фторхинолонам следует отметить, что геном каждого исследуемого изолята содержит одну копию гена, кодирующего белки множественной лекарственной резистентности MATE. В состав этого гена входят гомологичные последовательности генов norM и mepA Staphylococcus aureus, которые, как доказано, участвуют в удалении катионных антибактериальных препаратов из бактериальной клетки [19].

Установлено, что молекулярный механизм устойчивости анализируемых клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) к фторхинолонам обусловлен нуклеотидными заменами в генах gyrA (Ser83Leu) и parC (Lys144Arg), приводящих к изменению первичной структуры больших субъединиц ДНК-гиразы и топоизомеразы IV. Такой механизм описан у ряда классических бактерий (E. coli, Streptococcus spp, Staphylococcus spp.) [20]. Многочисленные однонуклеотидные замены в генах gyrA, gyrB, parC и parЕ изолятов M. hominis являют ся причиной высокого генетического полиморфизма и играют ведущую роль в формировании анти- биотикорезистентности, что согласуется с данными [21-23].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного нами исследования выявлено сходство в организации геномов ципроф- локсацин-резистентных клинических изолятов M. hominis (М45, М57, МН1866) и референсного штамма M. hominis ATCC 23114 (GenBank FP236530.1). Установлено преобладание в геноме генов, кодирующих белки, участвующие в катаболических процессах, что подтверждает ранее предложенную теорию об ограниченности биосинтетических возможностей M. hominis [1, 6]. В геноме изученных нами клинических изолятов микоплазм обнаружено большое количество нуклеотидных замен, не затрагивающих первичную структуру белка, что свидетельствует об их внутривидовом генетическом и эволюционном разнообразии. Отсутствие у изученных штаммов детерминант резистентности с конъюгативным механизмом передачи объясняет доминирование классического молекулярного механизма устойчивости микоплазм к фторхинолонам (ципрофлок- сацину), а именно, мутаций в области QRDR генов gyrA и parC. Вероятно, обнаруженные нами гены, кодирующие белки системы MATE, в определенных условиях могут обусловливать процессы выведения антибактериальных препаратов из клеток M. hominis. Проведение подобных исследований необходимо как для понимания эволюции M. hominis, так и для оценки структуры генома популяции урогенитальных микоплазм в целом.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вишняков И.Е. Микоплазмы в биологии и медицине начала XXI века. СПб.: Наука, 2016. 333 с.

2. Белова А.В., Никонов А.П. // Альманах клинической медицины. 2015. № 39. С. 140-150.

3. Заручейнова О.В., Вербов В.Н., Семенов Н.В. // Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций». 2014. Т. 4. № 1. С. 67.

4. Байтяков В.В., Сыркина М.Г., Радаева О.А. // Акушерство. Гинекология. 2016. Т. 93. № 1. С. 72-75.

5. Lee M.Y., Kim M.H., Lee W., Kim M.H., Lee W.In., Kang So.Y., Jeon Y.La. // Yonsei Med. J. 2016. V. 5. № 57. P. 1271- 275. doi: 10.3349/ymj.2016.57.5.1271

6. Pereyre S., Sirand-Pugnet P., Beven L., Charron A., Renaudin H., Barrй A., Avenaud P., Jacob D., Couloux A., Barbe V., et al. // PLoS Genet. 2009. V. 5. № 10. e1000677. doi: 10.1371/journal.pgen.1000677

7. Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф. // Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологиии им. академика И.Н. Блохиной. 2014. С. 208-213.

8. Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф., Ефимов Е.И. // Современные технологии в эпидемиологическом надзоре за актуальными инфекциями: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной. 2016. С. 166-173.

9. Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф., Ефимов Е.И. // Русский медицинский журн. Медицинское обозрение. 2018. № 2(1). С. 4-7.

10. Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф., Кишоян К.Г. // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения: актуальные проблемы и решения: Сборник научных трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. 2019. С. 167-170.

11. Okonechnikov K., Golosova О., Fursov М. // J. Bioinformatics. 2012. № 28. Р. 1166-1167. doi: 10.1093/ bioinformatics/bts091

12. Kumar S., Stecher G., Tamura K. // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. № 7. P. 1870-1874. doi: 10.1093/molbev/msw054

13. Aziz R.K., Bartels D., Best A.A., DeJongh M., Disz T., Edwards R.A., Formsma K., Gerdes S., Glass E.M., Kubal M., et al. // BMC Genomics. 2008. V. 9. P. 75. doi: 10.1186/14712164-9-75

14. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M.l., Rainey P.B., Nimwegen E. // Mol. Biol. Evol. 2014. V. 31. № 5. P. 1077-1088. doi: 10.1093/molbev/msu088

15. Saitou N., Nei M. // Mol. Biol. Evol. 1987. № 4. P. 406-425. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454

16. Колесникова Е.А., Бруснигина Н.Ф., Махова М.А., Алексеева А.Е. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018. Т. 20. № 1. С. 68-72.

17. Балакирев Е.С., Айала Ф.Дж. // Журн. общей биологии. 2004. Т. 65. № 4. С. 306-321.

18. Raherison S., Gonzalez P., Renaudin H., Charron A., Bйbйar C., Bйbйar C.M. // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2005. V. 49. № 1. Р. 421-429. doi: 10.1128/AAC.49.1.421-424.2005

19. Sun J., Deng Z., Yan A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. № 453. Р. 254-267. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.05.090

20. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M. // Antimicrobial Agents Chemotherapy. 1990. V. 34. № 6. Р. 1271-1272. doi: 10.1128/aac.34.6.1271

21. Meng D.Y., Sun C.J., Yu J.B., Ma J., Xue W.C. // Brazilian J. Microbiol. 2014. V. 45. № 1. P. 239-242. doi: 10.1590/s1517- 83822014000100034

22. Chernova O.A., Medvedeva E.S., Mouzykantov A.A., Baranova N.B., Chernov V.M. // Acta Naturae. 2016. V. 8. № 2 (29). P. 24-34.

23. Рахматулина М.Р., Кириченко С.В. // Вестник дерматологии и венерологии. 2013. № 3. С. 17-25.

Размещено на Allbest.ru