Механизм тушения флуоресценции белковых фотосенсибилизаторов на основе miniSOG в процессе интернализации рецептора HER2

Размещено на http://www.allbest.ru/

Механизм тушения флуоресценции белковых фотосенсибилизаторов на основе miniSOG в процессе интернализации рецептора HER2

Е. О. Кузичкина*, О. Н. Шилова, С. М. Деев

Институт биоорганической химии им. академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

РЕФЕРАТ

Белковый фотосенсибилизатор miniSOG является перспективным агентом для фотодинамической терапии. Генетически кодируемые фототоксины 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG способны специфически связываться с онкомаркером HER2, который сверхэкспрессируется на поверхности раковых клеток, а также способствовать его интернализации. Установлено, что попадание белков в комплексе с этим рецептором в эндосомы приводит к падению флуоресцентного сигнала фототоксического модуля. С целью выяснения механизма угасания флуоресценции проанализировано влияние таких факторов, как низкие значения pH, протеолиз, восстановление кофактора и др. Обнаружено, что значимый вклад в изменение флуоресцентных свойств вносит экранирование и поглощение флуоресценции miniSOG флуорофорами клетки, в том числе цитохромом с.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА адресные белковые фотосенсибилизаторы, интернализация, miniSOG, рецептор HER2, флуоресценция.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

тераностика терапия противораковый

HER2 - рецептор 2 эпидермального фактора роста человека;

scFv - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела;

DARPin - искусственный белок с анкириновыми повторами (Designed Ankyrin Repeat Protein);

FITC - флуоресцеинизотиоцианат;

FMN - флавинмононуклеотид;

IPTG - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид;

ПААГ - полиакриламидный гель;

PBS - фосфатно-солевой буфер; GSH - глутатион

ВВЕДЕНИЕ

Направленная доставка противораковых агентов для фотодинамической терапии приобретает все большее значение в современной тераностике. Этот подход позволяет повысить селективное накопление фотосенсибилизатора в опухоли и обеспечить его доставку в желаемый внутриклеточный компартмент [1, 2]. В качестве нацеливающих фрагментов могут использоваться моноклональные антитела, фрагменты антител и другие белки, селективно связывающиеся с опухолевыми антигенами.

Поверхностный клеточный рецептор HER2/neu, также известный как ЕгЬВ2, является значимым опухолевым маркером и наиболее изученной мишенью для разработки новых терапевтических агентов, поскольку он сверхэкспрессируется во многих типах опухолей, в том числе в клетках рака молочной железы человека, и ассоциирован с агрессивным фенотипом [3, 4].

Ранее в лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН были получены и охарактеризованы генетически кодируемые адресные фототоксины 4D5scFv-miniSOG [5] и DARPin-miniSOG [6]. В качестве нацеливающих модулей использовали фрагмент моноклонального антитела 4D5scFv и искусственный белок DARPin_9-29, селективно распознающие внеклеточный домен рецептора эпидермального фактора роста человека HER2/neu. В качестве фототоксического модуля в обоих случаях использовали фотоактивируемый флуоресцентный флавопротеин miniSOG [7]. Оба белка показали избирательный фототоксический эффект in vitro: для HER2-положительных клеток аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3 IC_„ составила 160 нМ в случае 4D5scFv-miniSOG и 0.8 мМ в случае DARPin-miniSOG. Также оба белка обладали способностью вызывать рецептор-опосредованный эндоци- тоз [4-6], однако скорость интернализации DARPin- miniSOG в комплексе с HER2 оказалась выше, чем у комплекса с 4D5scFv-miniSOG [8]. Поскольку константы диссоциации фототоксинов и рецептора, определенные с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса, имеют сравнимые значения, был сделан вывод о том, что решающее значение для эффективности данных фотосенсибилизаторов имеет скорость интернализации, определяющая время нахождения токсина на мембране.

Быстрая оценка динамики интернализации данных белков стала возможной благодаря тому, что miniSOG обладает собственной флуоресценцией, интенсивность которой падает при попадании фототоксинов в эндосомы. Однако механизм угасания флуоресценции miniSOG при попадании в клетку до сих пор не был установлен, и, исходя из процессов, происходящих в эндосоме, можно сформулировать несколько гипотез, объясняющих данное явление. Подобное угасание флуоресценции некоторых флуо- рофоров в эндосоме может быть связано с протонированием при понижении pH. Так, флуоресцеинизоти- оцианат (FITC) реагирует на изменение кислотности и используется для изучения интернализации клеточных рецепторов [9]. Основой хромофора miniSOG является флавинмононуклеотид (FMN), который также способен подвергаться протонированию, что может служить причиной падения флуоресценции [9, 10]. Флуоресцентные свойства белка miniSOG определяются его кофактором, поэтому протеолиз в эндосоме или лизосоме считается менее вероятной причиной этого явления. Наконец, падение интенсивности флуоресценции фототоксинов может быть следствием экранирования miniSOG и поглощения его флуоресценции хромофорами цитоплазмы.

Данная работа посвящена изучению причин падения интенсивности флуоресценции белковых фототоксинов 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG. Угасание miniSOG в эндосоме делает этот модуль удобным инструментом для изучения динамики интернализации, однако важно понимать причины этого явления, так как флуоресцентные свойства miniSOG неразрывно связаны с его токсическими свойствами, и физико-химические процессы, происходящие с ним в различных компартментах клетки, должны учитываться при разработке систем доставки фототоксина к терапевтическим мишеням.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии и условия культивирования

Клетки аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, сверхэкспрессирующие поверхностный рецептор HER2, и клетки яичников китайского хомячка CHO (Chinese hamster ovary) культивировали в среде McCoy's 5A (Life Technologies, США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (FBS) (HyClone, Бельгия) и 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», Россия) в атмосфере 5% CO2 при 37С.

Получение рекомбинантных белков 4D5scFv- miniSOG и DARPin-miniSOG

Белки 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG нарабатывали в бактериях Escherichia coli штамм BL21(DE3). Клетки трансформировали плазмидой pET22b, содержащей ген соответствующего белка. Трансформированные бактерии растили в жидкой питательной среде LB (1% триптона, 0.5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl) до достижения оптической плотности OD600 = 0.5. Экспрессию индуцировали 1 мМ изопропил^-0-1-тиогалактопиранозидом (IPTG, Merck, Германия), после чего биомассу растили при 25С в течение 24 ч. Полученную биомассу осаждали центрифугированием (10000д, при 4С) в течение 10 мин, ресуспендировали в 60 мл 20 мМ фосфатного буфера (3.2 мМ NaH2PO4, 16.8 мМ Na2HPO4, 0.3 М NaCl, pH 7.5) и лизировали при помощи ультразвука на дезинтеграторе VCX120 (Sonic and Materials Inc., США) в импульсном режиме (30 с - импульс, 30 с - охлаждение, амплитуда - 70%) в течение 5 мин. Для разделения растворимой и нерастворимой фракций лизат центрифугировали (50000д, при 10С) в течение 30 мин, осадок отделяли от супернатанта, из которого выделяли целевые белки.

Из растворимой фракции белки 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG выделяли с использованием ме- талл-хелатной аффинной хроматографии на колонке HisTrap FF 1 мл (GE Healthcare, США), содержащей №2+^ТА-сефарозу. Элюцию белков проводили ступенчатым изменением концентрации имидазола от 15 до 500 мМ в 20 мМ фосфатном буфере (pH 7.5) с рабочей скоростью 0.5 мл/мин с использованием УФ-ячейки (RD2:250-280, Reach Devices, США), детектирующей светопоглощение при 260 и 280 нм. После хроматографии белковые фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. Концентрацию целевых белков определяли биуре- товой реакцией в присутствии бицинхониновой кислоты при помощи набора Pierce BSA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, США) по протоколу производителя.

Подтверждение специфичности связывания 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG с рецептором HER2

Присутствие рецептора HER2 на клетках и специфичность связывания с ним белков 4D5scFv- miniSOG и DARPin-miniSOG анализировали с помощью проточного цитометра BD Accuri C6 (Becton Dickinson, США) со следующими параметрами: мощность лазера 20 мВт, длина волны 488 нм, фильтры 533/30 BP (FLl-канал) для детекции флуоресценции белков и 585/40 BP (FL3-канал) для детекции флуоресценции йодида пропидия. Данные анализировали с использованием программного обеспечения BD Accuri C6 Sortware и обрабатывали в программе FlowJo. В эксперименте использовали HER2-положительные клетки SK-BR-3 и HER2- отрицательные клетки CHO. На каждую пробу брали ~ 105 клеток, инкубировали их с белками 4D5scFv- miniSOG, DARPin-miniSOG, 4D5scFv, конъюгированным с FITC (4D5scFv-FITC), или бета-лактоглобулином, конъюгированным с FITC (P-LG-FITC) (все белки в концентрации 2 мкМ) в PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина («Диаэм», Россия), в течение 15 мин в темноте на льду. После окрашивания клеточную суспензию дважды отмывали в PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина. Для исключения из анализа мертвых клеток перед измерением пробу в течение 5 мин инкубировали с йодистым пропидием в концентрации 2.5 мкг/мл. При измерении флуоресценции выделяли популяции одиночных клеток по параметрам светорассеяния (FSC-H/FSC-A), затем среди них выбирали для анализа живые клетки, не окрашенные йодидом пропидия. Для каждого образца собирали не менее 104 событий.

Изучение скорости интернализации DARPinminiSOG и 4D5scFv-miniSOG

Для оценки скорости рецептор-опосредованной интернализации использовали клетки SK-BR-3, окрашенные DARPin-miniSOG и 4D5scFv-miniSOG. Флуоресценцию образцов измеряли с помощью проточного цитометра BD Accuri C6 (Becton Dickinson, США) как описано выше. Выделяли две группы образцов: первую группу после окрашивания инкубировали при температуре 4С (условия, при которых отсутствует рецептор-опосредованная интернализация), вторую - при 37С. Показания снимали в нескольких временных точках: 5, 10, 30 и 60 мин. Для каждого образца собирали не менее 104 событий.

Изучение механизма угасания фототоксинов на основе miniSOG в эндосоме

Влияние pH и воздействия протеаз на DARPinminiSOG, 4D5scFv-miniSOG и FMN оценивали, измеряя интенсивность флуоресценции, возбуждаемой светом с длиной волны 488 нм и детектируемой при 535 нм, на планшетном спектрофотометре Infinite M1000 (Tecan, Швейцария). Белки в концентрации 35 мкМ инкубировали при температуре 37С в буфере (100 мМ Трис-HCl), доведенном до нужного значения pH, а также с протеолитическими ферментами в концентрации 40 мкМ (трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин (Sigma, США)) и восстановителями (дитиотреитол, глутатион (восстановленная форма), аскорбиновая кислота, NADH, NaBH4 (Sigma, США)) в концентрации 10 мМ. Показания снимали сразу после добавления белка и через 1 и 2 ч инкубации.

Для оценки влияния присутствия других хромофоров на интенсивность флуоресценции FMN, DARPinminiSOG в сравнении с DARPin-FITC использовали краситель трипановый синий («ПанЭко», Россия) в концентрации 0.1% и цитохром с в концентрации 300 мкМ (Sigma, США). Интенсивность флуоресценции образцов измеряли на планшетном спектрофотометре Infinite M1000 (Tecan, Швейцария), флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 488 нм и детектировали в диапазоне длин волн 525-545 нм. Показания снимали сразу после добавления хромофоров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для эффективной работы противоопухолевого агента в фотодинамической терапии важно обеспечить его селективную доставку к мишени. Так, в нашем случае для доставки цитотоксического модуля miniSOG использовали две адресные молекулы: белок неиммуноглобулиновой природы (DARPin_9-29) и одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела 4D5, нацеленные на поверхностный рецептор HER2. Фототоксический модуль miniSOG является флавопротеином, способным за счет связанного FMN под действием синего света генерировать активные формы кислорода. Для получения рекомбинантных белков клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали соответствующими плазмидами pET22b-4D5scFv- miniSOG и pDARPin-miniSOG. Из растворимой фракции белки 4D5scFv-miniSOG и DARPinminiSOG выделяли с использованием металл-хелат- ной аффинной хроматографии на основе Ni2+-NTA с элюцией растворами имидазола. Для подтверждения активности полученных белковых фотосенсибилизаторов методом проточной цитофлуориметрии оценивали специфичность связывания гибридных белков 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG с рецептором HER2/neu на поверхности клеток аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, сверхэкспрессирующей HER2/neu. Это позволило проверить как селективность связывания адресного модуля DARPin с рецептором, так и функциональность флавопротеина, поскольку токсический модуль miniSOG обладает собственными флуоресцентными свойствами, и его связывание с клетками можно детектировать напрямую [11].

Флуоресценция клеток после окрашивания различными белками. Приведены средние значения трех экспериментов ± ошибка среднего

Рис. 1. Изменение интенсивности флуоресценции фототоксичных белков в условиях интернализации в комплексе с HER2 (+37оС) и в условиях, препятствующих интернализации (+4оС). 1 - 4D5scFv-miniSOG, +4°С;

2 - DARPin-miniSOG, +4°С; 3 - 4D5scFv-miniSOG, +37°С; 4 - DARPin-miniSOG, +37°С. ДMFI - разница в интенсивности флуоресценции между окрашенными клетками и неокрашенным образцом, инкубированным в тех же условиях

Наличие на поверхности клеток рецептора HER2/ пей было подтверждено их окрашиванием 4D5scFv, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (4D5scFv-FITC). В качестве отрицательного контроля использовали бета-лактоглобулин, конъюгированный с FITC (P-LG-FITC), не связывающийся с HER2 на поверхности клеток. Показано, что НЕR2- отрицательные клетки СНО не дают флуоресцентного сигнала после инкубации с белками 4D5scFv-FITC, P-LG-FITC и целевыми белками 4D5scFv-miniSOG, DARPm-mmiSOG (таблица).

Таким образом, показано, что адресные рекомбинантные белки 4D5scFv-miniSOG и DARPinminiSOG высокоспецифично связываются с поверхностным рецептором HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3 аденокарциномы молочной железы человека.

Обнаружено, что после связывания белков DARPin-miniSOG и 4D5scFv-miniSOG с рецептором на поверхности клеток SK-BR-3 при температуре +4С рецептор-опосредованной интернализации белков не происходит. Однако при + 37С комплекс рецептор-белок подвергается интернализации, о чем свидетельствует снижение интенсивности флуоресценции ДMFI (разность между средними значениями флуоресценции окрашенных и неокрашенных клеток) (рис. 1). При этом рекомбинантный белок DARPin-miniSOG интернализуется в комплексе с рецептором быстрее, чем 4D5scFv-miniSOG, так как ДMFI для DARPm-mmiSOG снижается вдвое по сравнению с начальной точкой в течение первых 10 мин, в то время как для 4D5scFv -miniSOG это занимает 40 мин. Полученные данные согласуются с опубликованными: 4D5scFv-miniSOG проявляет более высокую цитотоксичность по сравнению с DARPin-miniSOG [5, 6], так как дольше локализован на мембране. Поскольку преимущественным механизмом гибели клеток, облученных в присутствии данных фототоксинов, является некроз, по-вреждение мембраны вносит решающий вклад в токсичность адресных белков. Однако падение интенсивности флуоресценции miniSOG может свидетельствовать о реакциях с участием хромофора, что также должно повлиять на его эффективность в качестве фототоксина.

Для того чтобы выяснить причины падения интенсивности флуоресценции и токсичности белков на основе miniSOG при их интернализации, мы оценили воздействие разных факторов на флуоресцентные свойства miniSOG. Было выдвинуто предположение, что угасание флуоресценции DARPm-mmiSOG в процессе интернализации может быть связано с изменением pH среды при попадании комплекса рецептор-белок в эндосомы и лизосомы. На рис. 2 показана зависимость интенсивности флуоресценции белков DARPin-miniSOG и 4D5scFv-miniSOG и флавино- вого кофактора ^М^ от pH раствора при температуре + 37С. Достоверное и значительное снижение флуоресцентного сигнала (более чем в 2 раза) наблюдалось при pH 3 и менее существенное при pH 4. В то же время известно [12], что в эндосомах и ли- зосомах минимальное значение pH составляет 4.8, поэтому тушение флуоресценции miniSOG при его интернализации не может объясняться реакцией на закисление среды эндосом. Кроме того, изменение температуры в диапазоне от +4°С до +37°С не является причиной падения интенсивности флуоресценции FMN и DARPm-mmiSOG.

Для проверки гипотезы о возможном влиянии протеолиза в эндосоме на интенсивность флуоресценции DARPm-mmiSOG и 4D5scFv-miniSOG были созданы искусственные условия протеолиза такими ферментами, как трипсин, папаин, химотрипсин, подобный эндосомному катепсину G [13], и пепсин, соответствующий по активности катепсинам D и Е лизосом, при оптимальных для них значениях pH. FMN использовали в качестве контроля. Значительное падение интенсивности сигнала флуоресценции FMN, DARPin-miniSOG и 4D5scFv-miniSOG наблюдалось только при обработке целевых белков пепсином (рис. 3). Однако, основываясь на приведенных выше данных (рис. 2), можно сделать вывод о том, что причиной тушения флуоресценции является низкое значение pH. Эта гипотеза подтверждается и тем, что падение флуоресценции произошло и в реакционной смеси, содержащей вместо белковых фототоксинов FMN, не чувствительный к протеолизу. При этом обработка другими протеазами не привела к снижению флуоресцентного сигнала в 2 или более раз, что наблюдалось при интернализации (рис. 1). Расщепление DARPm-mmiSOG и 4D5scFv- miniSOG в экспериментальных условиях подтверждено при помощи электрофореза в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу Лэммли: через 1 ч инкубации наблюдалось полное расщепление белковых фототоксинов.