Формування біоплівки штамами salmonella enteritidis за присутності синтетичних аналогів 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолону

Размещено на http://www.allbest.ru/

Формування біоплівки штамами salmonella enteritidis за присутності синтетичних аналогів 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолону

М.Б. Галкін

Мета роботы - дослідити формування біоплівки клітинами S. enteritidis за впливу оригінальних похідних 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолону (PQS) з різною довжиною алкільного ланцюга. Методи. Клітини тест штамів інкубували у 96-лункових планшетах за присутності 20, 40 та 80 мкМ досліджуваних сполук. Сполуки були поділені на дві групи - зі скороченою та подовженою відносно PQS довжиною алкільного ланцюга. Вміст планктонних клітин визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 600 нм. Формування біоплівки оцінювали за допомогою CV-тесту (crystal violet-тесту) спектрофотометрично при довжині хвилі 592 нм. Результати. Отримані результати показали що аналоги PQS зі скороченою довжиною алкільного ланцюга, у більшості випадків знижують вміст планктонних клітин, тоді як похідні з подовженим алкільним ланцюгом виявили тенденцію до стимулювання планктонної культури. PQS і його синтетичні аналоги зі скороченою довжиною алкільного ланцюга або не впливали, або помірно стимулювали формування біоплівки тест-штамами S. enteritidis. На противагу цьому похідні з подовженим алкільним ланцюгом достовірно знижували масу біоплівки на 50-70% у порівняні з контролем. Висновок. Показано, що аналоги сигнального хінолону Pseudomonas aeruginosa з подовженим алкільним ланцюгом є ефективними пригнічувачами утворення біоплівок різними штамами S. enteritidis.

Ключові слова: 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолон (PQS), синтетичні аналоги PQS, S. enteritidis, біоплівки.

salmonella алкільний ланцюг

Salmonella entericа - внутрішньоклітинний грамнегативний збудник, який заражає різних господарів, і включає понад 2500 сероварів. Одним з таких, що найчастіше пов'язані з інфекціями людини, є серовар Salmonella enteritidis. Сальмонела може викликати захворювання у домашніх тварин, тяжкість яких може коливатися у широкому діапазоні: від безсимптомної форми до діареї, ентериту та, навіть, до системного синдрому, і спричиняти величезні економічні втрати у свинарстві та птахівництві. Важливою для поширення сальмонельозів є здатність збудника до утворення біоплівки, оскільки бактерії в її складі стійкі до антибіотиків, дезінфікувальних засобів, хімічних, фізичних та механічних чинників [6]. Нещодавно було показано, що у разі спільного культивування Salmonella enteritidis з Pseudomonas aeruginosa кількість сальмонел у складі біоплівки є достовірно меншою у порівнянні з моновидовою біоплівкою [8]. Скоріше за все, вплив псевдомонад опосередковується якимись регуляторними молекулами, зокрема аутоіндукторами, що контролюють формування біоплівок. Одним з кандидатів на цю роль може бути сигнальний хінолон.

2-Гептил-3-гідрокси-4-хінолон, що носить назву PQS (Pseudomonas Quinolon Signal) [13], є однією з найбільш вивчених сигнальних молекул серед бактерій. Ця сполука є унікальною для Pseudomonas aeruginosa, у якої вона грає роль регулятора однієї з трьох ланок системи міжклітинної комунікації - quorum sensing (QS). Ця система у P. aeruginosa побудована за принципом аутоіндукції та складається з трьох пов'язаних між собою ланок: las-, rhl- та pqs-, в кожній з яких використовується своя сигнальна молекула [7, 9]. Саме регулятором ланки pqs- і є 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолон. Загалом ця молекула грає величезну роль у функціонуванні клітин P aeruginosa, регулюючи роботу всіх ланок системи QS [7], синтез вторинних метаболітів, таких як рамноліпіди та феназинові пігменти [5], та, навіть, використовується як зброя у конкурентній боротьбі з іншими видами мікроорганізмів [14].

У зв'язку з тим, що молекула 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолону має з одного боку великий потенціал для хімічних модифікацій, а з іншого, її синтез не є надто складним, синтетичні аналоги цієї сполуки з різними замісниками [12] є досить перспективними для створення на їх основі нових антимікробних препаратів. Існують чисельні публікації, які вказують на значну ефективність похідних PQS як модуляторів формування біоплівки та роботи системи QS P. aeruginosa [1, 3, 12]. Однак, сьогодні практично не існує інформації щодо впливу таких сполук на інші грамнегативні та грампозитивні бактерії.

Таким чином, метою даної роботи, було дослідити формування біоплівки клітинами S. enteritidis за впливу оригінальних похідних 2-гептил-3-гід- рокси-4-хінолону (PQS) з різною довжиною алкільного ланцюга.

Матеріали та методи

У роботі було досліджено синтетичні похідні 2-гептил-3-гідрокси-4-хі- нолону з різною довжиною алкільного ланцюга. Сполуки були синтезовані у Біотехнологічному науково-навчальному центрі Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за методикою [11]. Структурні формули досліджених сполук наведені у табл.

Таблиця 1

Структурні формули та хімічні назви похідних 2-гептил-3-гідрокси-4-хінолону, що використовувалися у дослідженні

В роботі були використані штами Salmonella enteritidis ONU 262, ONU 465 та ONU 466 з колекції культур кафедри мікробіології, вірусології та біо- технології ОНУ імені І.І. Мечникова. Штами культивували на м'ясо-пептоно- му агарі при 37 °С та зберігали при 4 °С.

Усі експерименти проводили на рідкому середовищі LB з таким складом (г/л): пептон - 15,0; дріжджовий екстракт - 10,0; хлорид натрію - 5,0.

Визначення маси біоплівки та кількості планктонних клітин проводили за культивування у 96-лункових плоскодонних планшетах Nuclon. У дослідні лунки додавали по 4 мкл розчинів досліджуваних сполук у димети-

лсульфоксиді (ДМСО) до кінцевих концентрацій 20, 40 та 80 мкМ, 20 мкл суспензій клітин тест-штамів S. enteritidis (103 КУО/мл) та 180 мкл середовища LB. У контрольні лунки замість сполук додавали 4 мкл ДМСО. Планшети інкубували при 37 °С впродовж 24 годин.

Кількість клітин у планктоні оцінювали спектрофотометрично при довжині хвилі 600 нм. Після ретельного відмивання лунок планшетів від неприкріплених клітин біоплівки фіксували 96% етанолом впродовж 10 хв, висушували і забарвлювали 1% розчином кристалічного фіолетового. Через 15 хвилин барвник видаляли, лунки промивали і після висушування додавали по 200 мкл лі- зувального розчину, що містив 0,1 М NaOH і 1% додецилсульфату натрію. Оптичну густину вимірювали при довжині хвилі 592 нм [4].

Спектрофотометричні вимірювання здійснювали на спектрофотометрі SmartSpec Plus (Bio-Rad, Hungary).

Усі експерименти проводили у 3-х незалежних дослідах з 8 повторами у кожному. Статистичне опрацювання результатів досліджень проводили з використанням загальноприйнятих методів варіаційного аналізу. Розраховували середні значення показників (Х ) та їх стандартну помилку (SX ). Достовірність відмінностей між середніми значеннями визначали за критерієм Стьюдента, оцінюючи вірогідність отриманих результатів на рівні значимості не менше 95% (р < 0,05). Математичні розрахунки проводили за допомогою комп'ютерної програми Excel [2].

Результати та їх обговорення

На першому етапі роботи було досліджено вплив похідних PQS на планктонні культури тест-штамів S. enteritidis Одержані дані (рис. 1 А-В) показали, що PQS та його аналоги C3Q і C5Q знижують кількість планктонних клітин S. enteritidis 262, і S. enteritidis 465 у 1,6-6 разів. При цьому чутливішим до цих сполук виявився штам S. enteritidis 465. Сполука iC3Q, яка має розгалужений алкільний радикал, не чинила впливу на цей показник. На вміст клітин у планктоні S. enteritidis 466 впливав лише сигнальний хінолон, який знижував їх кількість на 23% незалежно від концентрації. Аналоги зі зменшеною довжиною алкільного ланцюга не змінювали вміст клітин у планктоні (рис. 1В).

Дані щодо активності похідних з більшою ніж у PQS довжиною алкіль- ного ланцюга наведені на рис. 2.

Встановлено, що усі три сполуки цієї групи - C8Q, C9Q, С11Q, на відміну від PQS і його аналогів зі зменшеною довжиною алкільного ланцюга, суттєвих змін не викликали. Лише у концентрації 80 мкМ сполуки C8Q і C9Q достовірно зменшували вміст планктонних клітин у штамів S. enteritidis 262, і S. enteritidis 465.

У деяких випадках за дії сполук C8Q, C9Q, C11Q спостерігалося зростання кількості планктонних клітин, але воно не було достовірним (рис. 2

Визначення впливу досліджених сполук на утворення біоплівки S. enteritidis 262, 465 і 466 показало, що PQS та його синтетичні похідні C3Q, Ж3Q і C5Q різним чином змінюють цей показник у досліджуваних штамів (рис. 3). Так, у разі S. enteritidis 262 за концентрацій цих сполук 20 і 40 мкМ спостерігається тенденція до зменшення маси біоплівок, а за концентрації 80 мкМ - її достовірне зниження на 35-40%.

Рис. 1. Вплив синтетичних аналогів PQS зі скороченою довжиною

алкільного ланцюга на вміст планктонних клітин тест-штамів S. enteritidis

Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контролем

Fig. 1. Effect of PQS and its synthetic analogs with shortened alkyl chain

on S. enteritidis test-strains planktonic cells content

Note: * - the differences were significant in comparison with control

Рис. 2. Вплив синтетичних аналогів PQS з подовженим алкільним ланцюгом на вміст планктонних клітин тест-штамів S. enteritidis Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контролем

Note: * - the differences were significant in comparison with control

Рис. 3. Вплив PQS та його синтетичних аналогів з скороченою довжиною алкільного ланцюга на формування біоплівки тест-штамами S. enteritidis Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контролем

Fig. 3. Effect of PQS and its synthetic analogs with extended alkyl chain action on S. enteritidis test-strains biolilm formation

Note: * - the differences were significant in comparison with control

Рис. 4. Вплив PQS та його синтетичних аналогів з подовженим алкільним ланцюгом на формування біоплівки тест-штамами S. enteritidis

Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контролем

Fig. 4. Effect of synthetic analogs of PQS with extended alkyl chain on S. enteritidis

test-strains biolilm formation

Note: * - the differences were significant in comparison with control

Протилежна спрямованість дії PQS, C3Q і C5Q зареєстрована для штаму S. enteritidis 465 (рис. 3Б). За їх присутності у середовищі культивування формування біоплівок було найефективнішим, а маса зростала на 20-50%. У той же час, Ж3Q сповільнював цей процес і маса утворених біоплівок складала лише 40-55% від контролю. Співставлення змін кількості планктонних клітин і маси біоплівок даного штаму за присутності PQS та його аналогів зі зниженою довжиною алкільного замісника свідчить про різноспрямований характер їх впливу на дані показники.

Аналоги сигнального хінолону C8Q, C9Q і C11Q, навпаки, чинили од- носпрямовану дію на формування біоплівок усіма штамами (рис. 4 А, Б, В).

Найбільший пригнічувальний ефект спостерігався у разі S. enteritidis 262 і S. enteritidis 465. Сполуки C8Q і C9Q знижували масу біоплівок цих штамів у 2,8-3 рази. Вплив C11Q був дещо слабкішим і маса сформованих за його присутності біоплівок складала 50-60% від контрольного рівня (рис. 4 А, Б).

Штам S. enteritidis 466, як і в інших випадках (рис. 2), виявився більш стійким до впливу аналогів зі збільшеною довжиною алкільного ланцюга. За

присутності C8Q, C9Q і C11Q маса біоплівок була меншою у 1,5--2,5 разів.

Підсумовуючи одержані результати, можна зробити висновок про перспективність створення на основі аналогів PQS зі збільшеною довжиною алкільного ланцюга нових антимікробних засобів з антибіоплівковими властивостями. Зокрема, відомо, що сальмонели здатні утворювати біоплівки на поверхні жовчних каменів і завдяки цьому тривалий час зберігається загроза розвитку гострого сальмонельозу [10]. Здатність PQS і його аналогів зі зменшеною довжиною алкільного ланцюга стимулювати утворення біоплівки штамом S. enteritidis 466 може бути використана для створення на його основі родентоцидних препаратів. З цієї точки зору представляє інтерес дослідження впливу даних сполук на утворення біоплівки штамом Salmonella enteritidis var. Issatchenko, на основі якого виготовляється препарат «Бакторо- денцид-М».

Таким чином, показано, що аналоги сигнального хінолону Pseudomonas aeruginosa з подовженим алкільним ланцюгом є ефективними пригнічувача- ми утворення біоплівок бактеріями різних штамів S. enteritidis.Список використаної літератури

Галкін М.Б., Водзінський С.В., Стрезєва Л.М., Джура М.А., Галкін Б.М., Філіпова Т.О. Формування біоплівки штамами Pseudomonas aeruginosa з різним рівнем внутрішньоклітинного цикло-ди-ГМФ за присутності синтетичних аналогів сигнального хінолону // Мікробіологія і біотехнологія. - 2018. - № 42. - С. 26-38.

Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. - К.: Морион.

2001. - 260 с.

Мухлис Абедалабас, Галкин Н.Б., Семенец А.С., Филиппова Т.О. Образование биоплёнки и синтез рамнолипидов Pseudomonas aeruginosa АТСС 15692 в присутствии сигнального хинолона и его синтетических аналогів // Мікробіологія і біотехнологія. - 2013. - № 22. - С. 32-40.

Christensen G.D.. Simpson W.A, Younger J.J. et al. Adherence of coag- ulase-negative Staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of Staphylococci to medical devices // J. clin. microbiol. 1985.

V 22. - № 6. - P 996-1006.

Dietrich L.E.P., Price-Whelan A., Petersen A., et al. The phenazine pyocyanin is a terminal signaling factor in the quorum sensing network of Pseudomonas aeruginosa // Molecular Microbiology. - 2006. - V 61. - P. 1308-1320.

Marin C., Hernandiz A., LainezM. Biofilm development capacity of Salmonella strains isolated in poultry risk factors and their resistance against disinfectants // Poult. Sci. - 2009. - V 88. - P 424-431.

McKnight S.L., Iglewski B H., Pesci E C. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa // Journal of Bacteriology. - 2000. - V 182. - P 2702-2708.

Pang X., Yuk H.-G. Effect of Pseudomonas aeruginosa on the sanitizer sensitivity of Salmonella еnteritidis biofilm cells in chicken juice // Food Control.

2017. doi: 10.1016/j.foodcont.2017.11.012.

Pesci E. C., Iglewski B. H. The chain of command in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing // Trends Microbiol. - 1997. - Vol. 5. - P 132-134.

Prouty A.M., Schwesinger W.H., Gunn J.S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. // Infect Immun. - 2002.

V 70. - P. 2640-2649.

Somanathan R., Smith K.M. Synthesis of some 2-alkyM-quinolone and 2-alkyl-4-methoxyquinoline alkaloids // J. heterocycl. Chem. - 1981. - V 18, № 6. -P 1077-1079.

Soukarieh F , Oton E.V, Dubern J-F, et al. In silico and in vitro-guided identification of inhibitors of alkylquinolone-dependent quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa // Molecules. - 2018. - V 23. - P 257-272.

WelchM., Hodgkinson J.T., Gross J., et al. Ligand binding kinetics of the quorum sensing regulator PqsR // Biochemistry. - 2013. - V 52. - P. 4433-4438.

Zaborina O., Lepine F, GaopingXiao, et al. Dynorphin activates quorum sensing quinolone signaling in Pseudomonas aeruginosa // PLoS pathogens.

2007. - V 3. - № 3. - P. 1-15.

Размещено на Allbest.ru