Ненейтрализующие антитела к консервативным антигенам вируса гриппа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ненейтрализующие антитела к консервативным антигенам вируса гриппа

Авторы:

Е.С. Седова, Д.Н. Щербинин, А.А. Лысенко, С.В. Алексеева, Э.А. Артемова, М.М. Шмаров

На сегодняшний день актуальной остается разработка новых противогриппозных вакцин широкого спектра действия, которые позволят избежать ежегодного изменения штаммового состава вакцины. Создание новых вакцин на основе высококонсервативных белков вируса гриппа позволит подготовиться к возможным пандемиям и существенно снизить наносимый ими ущерб. Ключевым моментом в определении эффективности противогриппозных вакцин является оценка уровня гуморального ответа на вакцину. Для создания новых противогриппозных вакцин важно знать механизмы действия различных, в том числе ненейтрализующих, антител, а также иметь методы определения уровня таких антител после иммунизации. В данном обзоре рассмотрены такие механизмы противогриппозного действия, реализуемые ненейтрализующими антителами, как антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый фагоцитоз (АЗФ) и опосредованная антителом комплементзависимая цитотоксичность (АОКЗЦ). Запускают эти реакции такие антигены вируса гриппа, как гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA), так и высококонсервативные антигены - ионный канал М2, матриксный белок М1 и нуклеопротеин NP.

Грипп - высококонтагиозная инфекция, вызываю-щая ежегодные эпидемии и через неравные проме-жутки времени - пандемии. По данным ВОЗ, ежегод-но во всем мире гриппом заболевают 20-30% детей и от 5 до 10% взрослых, а от тяжелых осложнений, вызванных гриппозной инфекцией, умирают от 250 до 500 тыс. человек. При пандемиях масштабы ущер-ба и смертность значительно возрастают. Например, от пандемии гриппа в 1918-1919 годах умерли, по разным данным, от 50 до 100 млн человек [1].

Важнейшей мерой защиты от гриппозной инфек-ции и ограничения ее распространения является вак- цинопрофилактика. Современные гриппозные вакци-ны, как правило, индуцируют образование антител к поверхностным антигенам HA и NA вируса гриппа. Поверхностные белки вируса гриппа подвергаются постоянному антигенному дрейфу, поэтому необхо-димо ежегодное обновление штаммового состава вак-цин [2].

На сегодняшний день актуальна разработка новых противогриппозных вакцин широкого спектра дей-ствия, которые позволят избежать ежегодного из-менения штаммового состава вакцины. Кроме того, создание новых вакцин на основе высококонсерва-тивных белков вируса гриппа позволит подготовить-ся к возможным пандемиям и существенно снизить наносимый ими ущерб.

Ключевым моментом оценки эффективно-сти противогриппозных вакцин является опре-деление уровня гуморального ответа на вакцину. Нейтрализующие антитела к глобулярному доме-ну гемагглютинина вырабатываются при вирусной инфекции, а также служат основой защитных ме-ханизмов всех применяемых на сегодняшний день противогриппозных вакцин [3]. Большинство ви- руснейтрализующих антител связываются с гло-булярной частью HA, блокируют связывание НА с остатком сиаловой кислоты и предотвращают про-никновение вируса в клетки (рис. 1, б). Именно эти антитела определяют в классических реакциях тор-можения гемагглютинации и нейтрализации [4-6]. Кроме того, многие антитела к глобулярной части НА также способны блокировать выход вируса из клетки (рис. 1, г). Этот механизм защиты невозможно оце-нить в классических реакциях торможения гемаг- глютинации и нейтрализации, он обнаруживается при добавлении антител к клеткам, предварительно зараженным вирусом гриппа [7].

Антитела к различным консервативным антигенам вируса гриппа (таким, как NP, M1, M2) обычно не яв-ляются нейтрализующими и не могут предотвратить развитие вирусной инфекции, однако за счет различ-ных иммунных механизмов они способны выполнять защитную функцию. Таким образом, при создании новых противогриппозных вакцин широкого спек-тра действия актуальными становятся изучение ме-ханизмов действия различных, в том числе неней-трализующих, антител, а также разработка методов оценки уровня таких антител после иммунизации новыми противогриппозными вакцинами.

Антитела к консервативным антигенам вируса гриппа, участвующие в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности, антителозависимого фагоцитоза и комплементзависимой цитотоксичности, опосредованной антителами

Способность антител нейтрализовать вирус грип-па традиционно считалась важнейшим механизмом противогриппозной защиты. Однако исследования последних лет показали важность и других опосре-дованных антителами эффектов, которые также вно-сят свой вклад в защиту от вируса [3]. Существуют следующие механизмы противогриппозного дей-ствия, реализуемые ненейтрализующими антитела-ми: антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый фагоцитоз (АЗФ) и ком- плементзависимая цитотоксичность, опосредованная антителами (АОКЗЦ) [8]. Антигенами вируса грип-па, запускающими эти реакции, являются как HA и NA, так и такие высококонсервативные антигены, как ионный канал М2, матриксный белок М1 и нукле- опротеин NP.

В отличие от нейтрализующих антител, функции которых осуществляются с помощью вариабельных участков, эффект ненейтрализующих антител за-висит от консервативного Fc-региона. Fc-регион спо-собен взаимодействовать с как вариабельная часть антитела связана с антигеном. Для осущест-вления эффекторных функций ненейтрализующих антител наиболее значимы изотипы антител IgG и IgM, при этом наиболее высоким функциональным потенциалом обладает IgG3 [9].

Ненейтрализующие антитела могут связы-ваться своим Fc-регионом со специфическими Fc- рецепторами, экспонированными на поверхности большинства типов иммунных клеток, включая NK- клетки, макрофаги и нейтрофилы (рис. 1, е). После связывания с антителами эти иммунные клетки активируются и включаются в борьбу с патогеном. Описаны шесть различных рецепторов, вовлеченных в активацию (FcyRI, IIA, IIC, IIIA и IIIB) или ингиби-рование (FcyRIIB1/B2) иммунных клеток человека. Ненейтрализующие антитела могут также активи-ровать систему комплемента (рис. 1, ж) [9].

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ)

Клетки, инфицированные вирусом гриппа, не-сут на своей поверхности вирусные белки, в основ-ном НА и NA, так как новые вирионы образуют-ся путем отпочковывания от клеточной мембраны. Противогриппозные IgG могут связывать вирусные белки на поверхности клеток, опсонизируя таким образом инфицированные клетки. Рецептор IIIa Fc- гамма (FcyRIIIa), экспонированный на поверхности многих клеток врожденного иммунного ответа, таких, как NK-клетки, моноциты и макрофаги, связывает-ся с Fc-регионом IgG. В результате взаимодействия FcyRIIIa с IgG, связанным с инфицированной клет-кой, происходят фосфорилирование тирозинсодер-жащего активационного мотива (ITAM) и активация Са²⁺-зависимого сигнального пути. В результате NK-клетки начинают вырабатывать цитотоксиче-ские факторы (перфорины и гранзимы), приводящие к смерти инфицированной клетки, и антивирусные цитокины (IFNy, TNFa) и хемокины (рис. 2) [10].

Одной из основных мишеней для антител, участву-ющих в АЗКЦ, является консервативный стебель НА, одного из наиболее представленных поверхност-ных белков вируса гриппа. Так, показано, что анти-тела широкого спектра действия к консервативному стеблю НА защищают мышей от летальной гриппоз-ной инфекции через механизм, который включает взаимодействие Fc-FcyR. Напротив, протективность антител к вариабельному глобулярному домену НА проявлялась как в присутствии, так и в отсутствие взаимодействия с FcyR [11].

Так, повторное заражение макак вирусом гриппа приводило к быстрому появлению АЗКЦ-реакций. В бронхоальвеолярных лаважах животных были найдены антитела, способные индуцировать акти-вацию NK-клеток, что коррелировало со сниженным выделением вируса и уменьшением длительности за-болевания [12]. У людей высокие титры антител, спо-собных участвовать в АЗКЦ, также коррелировали со снижением заболеваемости при эксперименталь-ном инфицировании [13]. Кроме того, пожилые люди, перенесшие ранее грипп, вызванный вирусами, близ-кими к штамму, вызвавшему в 2009 году пандемию «свиного гриппа», и сохранившие значимые титры антител, способных участвовать в АЗКЦ, но не имею-щие вируснейтрализующих антител, были защище-ны от пандемичного вируса гриппа. Таким образом, ненейтрализующие антитела к стеблю НА, способ-ные индуцировать АЗКЦ, напрямую связаны с уров-нем защиты от вируса гриппа [14]. При этом, соглас-но опубликованным данным, вакцины от сезонных вирусов гриппа слабо индуцируют появление анти-тел, способных участвовать в АЗКЦ. А присутствие активирующих NК-клетки антител широкого спек-тра действия у пожилых людей позволяет предпо-ложить, что эти антитела накапливаются в течение жизни в результате многократного заражения раз-личными вирусами гриппа [15].

Рис.1

С использованием панели из 13 антител к НА вируса гриппа (как нейтрализующих, так и не-нейтрализующих как к стволовой, так и к глобу-лярной части НА) DiLillo и соавт. [16] показали, что для обеспечения защиты in vivo всем антителам широкого спектра действия требуются Fc-FcyR- взаимодействия. Аналогичный результат был полу-чен при сравнении двух антител к NA, одно из кото-рых обладало широким спектром действия, а другое было штаммоспецифичным. Это позволило пред-положить, что от Fc-FcyR-взаимодействия зависит широта спектра действия не только некоторых анти-тел, специфичных к НА, но также антител к другим антигенам вируса гриппа, представленным на по-верхности инфицированной клетки. Кроме того, за-висимость от Fc-FcyR-взаимодействия некоторых антител можно обойти путем значительного (в 8-10 раз) повышения количества антитела, участвующе-го во взаимодействии с вирусом гриппа. Стоит отме-тить, что при вирусной инфекции антитела широкого спектра действия генерируются в гораздо меньших количествах, чем штаммоспецифические. Таким об-разом, Fc-FcyR-взаимодействие, по-видимому, мо-жет увеличивать эффективность малочисленных антител широкого спектра, компенсируя тем самым их маленькое количество [16].

Антитела к консервативным вирусным белкам, например к нуклеопротеину NP, также вносят свой вклад в реакции АЗКЦ. Так, гриппозная инфек-ция и вакцинация индуцируют образование анти-тел к NP, белкам М1 и М2, участвующим в АЗКЦ [17, 18]. Показано, что NP вируса гриппа некоторое время экспрессируется на поверхности инфициро-ванных клеток и, следовательно, может служить целью для АЗКЦ [19-21]. Carragher и соавт. показа-ли, что вакцинация лабораторных мышей рекомби-нантным растворимым NP вируса гриппа А индуци-рует высокие титры антител к NP и крайне слабый Т-клеточный ответ. При этом вакцинация снижала проявление симптомов заболевания и уменьшала титры вируса гриппа в легких животных после за-ражения гриппозной инфекцией. Пассивный пере-нос сывороток иммунизированных мышей наивным животным также обеспечивал защиту от заражения вирусом гриппа [22]. Последующие исследования по-казали, что протективные свойства сыворотки мы-шей, иммунизированных рекомбинантным NP виру-са гриппа А, при пассивном переносе как животным с дефицитом В-клеток, так и мышам с нормальным количеством В-клеток проявляются через механизм, включающий FcyR [23]. Исследования на макаках по-казали, что анти^Р-антитела обладают способно-стью активировать NK-клетки in vitro [18, 24].

Сыворотки крови здоровых детей и взрослых (но не младенцев) содержат антитела к различным белкам вируса гриппа А H7N9, участвующие в ре-акциях АЗКЦ, причем уровень антител к NP был значительно выше, чем к НА и NA. Уровни участву-ющих в АЗКЦ антител к NP сезонных вирусов грип-па А коррелировали с уровнем антител к NP вируса гриппа А H7N9, поэтому предполагается, что образо-вание этих перекрестно реагирующих с H7N9 анти-тел происходило в результате вакцинации и заболе-вания сезонными вирусами гриппа А [25]. Антитела к NP вируса гриппа А, участвующие в АЗКЦ, обна-ружены у детей, вакцинированных сезонной инак-тивированной противогриппозной вакциной. У здо-ровых и инфицированных гриппом добровольцев выявлены антитела к NP, которые могут взаимо-действовать с FcyRIIIa и активировать NK-клетки.

Сыворотки здоровых доноров, содержащие антитела против NP, индуцировали активацию NK-клеток, на-правленную против экспрессирующих NP вирус-ин- фицированных клеток [13, 26].

Другой консервативный белок вируса гриппа, об-наруживаемый на поверхности инфицированных клеток, это ионный канал М2. Антитела к этому белку способны в лабораторных экспериментах за-щищать мышей от вируса гриппа, причем при им-мунизации животных эктодоменом ионного канала М2 как в растворимом виде, так и конъюгированных с различными носителями, протективность зави-сит главным образом от антител. Критически важ-ным для защиты было присутствие NK-клеток [27]. Эксперименты по пассивной иммунизации мышей как дикого типа, так и с фенотипом FcRy-/-, FcyRI-/-, FcyRIII-/- и (FcyRI, FcyRIII)-/- показали, что FcR (а именно FcyRIII) необходим для протективной актив-ности анти-М2е-антител [28, 29]. Моноклональное антитело человека к белку М2 вируса гриппа (Ab1- 10) было способно активировать NK-клетки и за-пускать АЗКЦ in vitro, причем АЗКЦ, направлен-ную как на клетки-мишени, экспрессирующие М2, так и на клетки, зараженные вирусом гриппа [30].

Для детального определения уровня противогрип-позных антител, участвующих в АЗКЦ, требуется постановка реакции с участием целевого антигена и эффекторных клеток (как правило, NK-клеток). В качестве антигена может выступать как реком-бинантный целевой белок, так и клетки, инфициро-ванные вирусом гриппа, или клетки-мишени, экс-прессирующие нужные антигены. Если в качестве антигена был выбран рекомбинантный белок, то его обрабатывают исследуемой сывороткой, а затем к по-лученному комплексу антиген-антитело добавляют эффекторные клетки. При таком способе постанов-ки реакции судить о АЗКЦ можно по активации эф- фекторных клеток и экспрессии ими поверхностных и секретируемых маркерных белков (как правило, это поверхностный маркер активации CD107a и ин-терферон-гамма) (рис. ЗА) [31]. В случае использо-вания в качестве антигенов инфицированных клеток или клеток-мишеней изучать АЗКЦ можно также путем оценки гибели обработанных антителами кле-ток-мишеней после взаимодействия с эффекторны- ми клетками (рис. ЗБ) [32].

Антителозависимый фагоцитоз (АЗФ)

Фагоцитоз - это важнейший иммунологический про-цесс, при котором фагоциты поглощают микробные и инфицированные клетки. Первым шагом АЗФ яв-ляется опсонизация микробной или инфицированной клетки антителами. После опсонизации фагоциты уз-нают связанные с чужеродными антигенами анти-тела, главным образом с помощью Fcy-рецепторов CD32 (FcyRIIA) и CD64 (FcyRIA), и Fca-рецептора CD89 [33]. Фагоциты, участвующие в АЗФ, включа-ют в себя моноциты, макрофаги, нейтрофилы и ден-дритные клетки [17, 34] (рис. 4). АЗФ - один из важ-нейших индуцированных антителом эффекторных механизмов защиты от вируса гриппа. Показано, что мыши FcyR-/- высокочувствительны к гриппу даже в присутствии противогриппозных антител, полученных от мышей FcyR+/ + . Причем отсут-ствие NK-клеток не было критичным для защиты. Показано также, что макрофаги мышей FcyR+/+ активно поглощали опсонизированные вирусные ча-стицы [35]. Dunand и соавт. показали, что некоторые ненейтрализующие моноклональные антитела чело-века широкого спектра действия защищают мышей от гриппозной инфекции через Fc-опосредованное привлечение эффекторных клеток, при этом защита связана исключительно с АЗФ, а не с АЗКЦ или ак-тивацией системы комплемента [36].

Рис.2

Согласно He и соавт., альвеолярные макрофаги критичны для индукции АЗФ моноклональными ан-тителами человека и мыши как in vitro, так и в экспе-риментах по защите животных от заражения гомоло-гичными и гетерологичными вирусами гриппа А [37]. Интересно, что у «пожилых» мышей снижена способ-ность альвеолярных макрофагов защищать легкие от повреждения при гриппозной инфекции [38].

В АЗФ-опосредованную защиту против виру-са гриппа помимо альвеолярных макрофагов могут включаться другие популяции эффекторных кле-ток. Так нейтрофилы, которые являются самыми многочисленными лейкоцитами крови, после акти-вации экспрессируют на своей поверхности высокие уровни FcyRIa/b/c, FcyRIIa и FcyRIIIb. Кроме того, нейтрофилы конститутивно экспрессируют FcaRI, который связывает IgA и активирует цитотоксиче-ские и фагоцитарные ответы [15]. Анализ Fc-FcyR- взаимодействий между различными IgG, специфич-ными к стеблю НА, и эффекторными нейтрофилами показал, что моноклональные антитела человека и мыши к стеблю НА способны индуцировать про-дукцию нейтрофилами активных форм кислоро-да (reactive oxygen species, ROS), которые клетка выбрасывает в фаголизосому. При этом подобный эффект не удалось обнаружить в случае антител к глобулярному домену НА [39]. Истощение нейтро-филов приводило к снижению выживаемости мышей при гриппозной инфекции [40, 41].

Рис.3

Изучение механизма АЗФ во время гриппозной инфекции показало, что как макрофаги, так и ней-трофилы быстро привлекаются в легкие и присут-ствуют в бронхоальвеолярном лаваже, дыхатель-ных путях и альвеолах, где способствуют быстрой очистке от инфицированных и мертвых клеток. Хотя супернатант инфицированных вирусом гриппа кле-ток может стимулировать фагоцитоз моноцитами независимо от вовлечения антител [40], антитела способствуют ускоренному выведению вирусных ча-стиц и инфицированных клеток благодаря взаимо-действию с FcyRIa и FcyRIIa на иммунных клетках. Опосредованный антителами вирусный фагоцитоз приводит к уменьшению распространения и тяже-сти инфекции, уменьшению симптомов и снижению выделения вируса [42]. Предполагается, что каждая последующая гриппозная инфекция, а также про-тивогриппозные вакцинации приводят к индукции небольших уровней перекрестных антител, участву-ющих в АЗФ, и их уровни возрастают с каждой по-следующей гриппозной инфекцией [17].

Способностью индуцировать АЗФ обладают раз-личные противогриппозные антитела, в том числе антитела к стеблю гемагглютинина [36, 37, 39] и анти-тела к ионному каналу М2 [28, 43].

Для изучения активности антител, отвечающих за АЗФ, обычно оценивают поглощение фагоцитирующими клетками клеток-мишеней, экспрессирующих гриппозные антигены и меченных каким-либо красителем, после обработки последних целевыми антителами [35].

Опосредованная антителом комплементзависимая цитотоксичность (АОКЗЦ)

Система комплемента состоит из растворимых и мембраносвязанных белков, которые встречаются в крови и тканях млекопитающих. Эти белки взаимо-действуют друг с другом и с другими компонентами иммунной системы, в результате чего образуется ряд эффекторных белков, способствующих элиминации различных патогенов [27].

Еще в 1978 году было показано, что система ком-племента необходима для защиты мышей от ле-тальной гриппозной инфекции [44]. В 1983 году уста-новлено, что сыворотка крови человека содержит антитела, способные нейтрализовать вирус гриппа путем активации классического пути комплемента [45]. В настоящее время известно, что вирионы виру-са гриппа активируют как классический, так и аль-тернативный пути комплемента, при этом для эф-фективного лизиса вирионов требуется опсонизация антителами [46].

В 2018 году была проведена работа по изучению эффективности иммунизации мышей с нокаутом С3-компонента комплемента вирусоподобными ча-стицами, несущими белки М2е вирусов гриппа А че-ловека, свиней и птиц, а также вирусоподобными ча-стицами, несущими НА вируса гриппа А подтипа Н5. Оказалось, что иммунизация М2е-вакциной не за-щищала мышей с нокаутом С3 от вирусов гриппа А, хотя даже низкие уровни антител к белку М2е обе-спечивали защиту животных дикого типа от зара-жения вирусами гриппа А при пассивном переносе. Напротив, мыши с нокаутом С3, иммунизированные НА-вакциной, индуцирующей образование штаммо-специфичных нейтрализующих антител, были защи-щены от заражения гомологичным вирусом гриппа, несмотря на низкий уровень антительного ответа [47]. Таким образом, можно говорить о способности анти-тел к ионному каналу М2 вируса гриппа защищать от вируса гриппа А путем активации системы ком-племента.

Система комплемента способна не только нейтра-лизовать вирусные частицы, но также участвует в лизисе инфицированных клеток. Так, вакцинация сезонной трехвалентной инактивированной противо-гриппозной вакциной приводила к увеличению уров-ня антител, способных активировать комплементза- висимый лизис инфицированных гриппом клеток in vitro, хотя эффект и не был ярко выраженным [48]. Индуцирующие АОКЗЦ антитела обнаружены как среди антител к глобулярному домену НА виру-са гриппа, так и среди антител к стволовому домену. Но при этом антитела к стволовому домену показали широту спектра действия и были способны индуци-ровать АОКЗЦ против различных штаммов вируса гриппа А [49].

Показано, что в активации системы комплемента участвуют антитела классов IgG1 и IgM [46]. Уровни антител, участвующих в АОКЗЦ, коррелировали с защитой от сезонного вируса гриппа у детей [32].

Активность антител в АОКЗЦ оценивают на клет-ках-мишенях, экспрессирующих целевой антиген или зараженных вирусом гриппа с помощью раство-ров, содержащих комплемент. Гибель клеток оцени-вают с помощью различных метаболических краси-телей [50].

Антитела к гемагглютинину и нейраминидазе вируса гриппа

НА и NA вируса гриппа являются высоковариабель-ными белками. Однако разрабатываемые на сегод-няшний момент вакцины широкого спектра действия могут включать также НА и/или NA и их эпитопы. Так стебель НА является достаточно консерватив-ной частью молекулы. Существуют различные стра-тегии перенаправления иммунного ответа при вак-цинации именно на этот антиген [51]. Большинство NA-специфических моноклональных антител, полу-ченных из сывороток людей, перенесших инфекцию, связываются с различными штаммами вирусов грип-па, что позволяет надеяться на создание вакцин ши-рокого спектра действия на основе этого антигена [52].

Антитела к стеблю НА вируса гриппа

Стебель НА более консервативен, чем глобуляр-ный домен, однако при этом он менее иммуногенен, возможно из-за того, что громоздкая глобуляр-ная часть белка стерически препятствует доступу антител к стеблю НА. Однако, кроме ненейтрали-зующих антител, участвующих в реакциях АЗКЦ, АЗФ и АОКЗЦ, у людей после гриппозной инфекции или вакцинации выявляется некоторое количество нейтрализующих антител к стеблю НА, причем ин-фекция более эффективно, чем вакцинация, индуци-рует образование антител этого типа.

Антитела против стебля НА могут препятство-вать слиянию вируса с эндосомальной мембраной. Для эффективного слияния необходимо присут-ствие 3-5 соседних НА со связавшимися с эндосо- мальной мембраной пептидами слияния (рис. 1, в). Нейтрализующие антитела к стеблю НА способны предотвратить рН-индуцированное экспонирова-ние пептида слияния и предотвратить формирова-ние сети НА, взаимодействующих с эндосомальной мембраной. Кроме того, некоторые антитела к стеблю НА способны ингибировать разрезание незрелого предшественника НА0 на субъединицы НА1 и НА2 (рис. 1, д), которые необходимы для успешного ин-фицирования клеток новой вирусной частицей [4]. Также антитела к стволовому домену НА способны подавлять выход вирусных частиц из клетки (рис. 1, г) [53], в том числе за счет стерического ингибирова-ния активности нейраминидазы [54].

Нейтрализующие антитела к стеблю НА невоз-можно определить с помощью реакции гемагглю- тинации. Основными способами оценки подобных антител являются реакции нейтрализации [5], ми-кронейтрализации [6] и нейтрализации на осно-ве псевдотипированных вирусных векторов [55]. Последние представляют собой химерные вирусы, несущие поверхностные антигены вирусов гриппа, которые не содержат генетический материал и не об-ладают инфекционностью. Такие псевдовирусы, как правило, получают на основе лентивирусных векторов и вируса везикулярного стоматита. Они по-зволяют при постановке реакции нейтрализации от-казаться от работы с высокопатогенными вирусами гриппа (что особенно важно при изучении антител широкого спектра действия). По некоторым данным такой способ оценки более чувствителен и больше подходит для выявления нейтрализующих антител к стеблю НА, чем классическая реакция нейтрали-зации [55].

Антитела к нейраминидазе вируса гриппа

Нейраминидаза вируса гриппа участвует в различ-ных стадиях инфекционного процесса. Она отреза-ет вирусную частицу от сиаловых кислот муцинов дыхательных путей, позволяя вирусу проникнуть в клетку. NA позволяет отпочковываться новым ви- рионам, не давая им оставаться связанными с сиало- выми кислотами на поверхности клетки. Кроме того, NA предотвращает агрегацию вирионов, связанную с взаимодействием НА одного вириона с сиалирован- ными гликанами другого [56]. Антитела к NA вируса гриппа могут препятствовать любому из этих про-цессов (рис. 1, а,г).

Показано, что в отсутствие антител к НА, антите-ла к NA способны обеспечить защиту лабораторных животных от заражения вирусом гриппа [57]. Более того, присутствие антител к NA также коррелирует с защитой людей от гриппозной инфекции. Показано, что титры анти^А-антител увеличиваются в крови человека с возрастом [56].

Появление антител к нейраминидазе индуциру-ется гриппозной инфекцией, хотя обычно их уровень ниже, чем антител к НА. Важно, что большинство NA-специфических моноклональных антител, полу-ченных из сывороток индивидов, перенесших инфек-цию, связываются с широким спектром современных и исторических штаммов вирусов гриппа, ингибиру-ют NA-активность и обеспечивают защиту лабора-торных мышей в экспериментах с пассивным пере-носом [52]. Возможны несколько стратегий создания вакцин широкого спектра действия, индуцирую-щих образование антител к NA вируса гриппа. Одна из них - создание пандемичной вакцины на основе коктейля из NA нескольких подтипов (N1, N2, N6, N7, N8, N9 и др.), ассоциированных с человеческими и зоонозными штаммами вируса гриппа. Возможно также включение NA как дополнительного антигена в вакцины на основе консервативных антигенов ви-руса гриппа - M2, NP и др. [58].

ИФА - это один из наиболее простых способов оценить иммунный ответ на NA. Для достоверной оценки уровня антител к NA в качестве антигена нужно использовать рекомбинантную, тетрамер- ную, гликозилированную и ферментативно актив-ную NA. При этом ИФА не дает никакой информации о функциональности измеренного уровня антител. Тесты на ингибирование ферментативной актив-ности NA основаны на разрезании нейраминидазой маленьких молекул, что приводит к появлению из-меряемого сигнала. Однако, в отличие от концевых сиаловых кислот, которые прикреплены к глика- нам на крупных белках, эти малые молекулы более легко поступают в активный центр NA [59]. Анализ, который позволяет получить наиболее реалистич-ные оценки анти^А-активности антител, - ELLA (enzyme-linked lectin assay) - лектин-ферментный анализ, где в качестве субстрата используют высокосиалированный гликопротеин фетуин. Метод основан на измерении количества галактозы, предпоследнего остатка сахара в составе фетуина, связанного с под-ложкой. NA отщепляет концевые сиаловые кислоты, после чего галактоза становится доступной для ана-лиза с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена лектина арахиса. ELLA был оптимизирован для рутинной серологии, он используется в совре-менных исследованиях для измерения титров анти-тел, ингибирующих нейраминидазу [58].

Ключевым компонентом ELLA является фер-ментативно активная NA, ингибирование которой и будет оцениваться. NA может находиться в форме очищенного белка или в составе вирусной частицы. При этом при использовании вирусной частицы необ-ходимо помнить, что антитела, связывающиеся с НА, могут снижать активность NA из-за стерических помех. Поэтому в этом анализе обычно используют реассортантные вирусы подтипов H6NX или H7NX. Несмотря на то что использование реассортантных вирусов не может полностью исключить влияния ан-тител к НА на активность NA, такой анализ признан золотым стандартом для измерения ингибирующей NA-активности антител [59].

Заключение

В этом обзоре рассмотрены основные механизмы работы противогриппозных антител и способы их обнаружения. Антитела могут обеспечивать защиту от гриппа через Fc-независимый или Fc-зависимый механизмы. Fc-независимые антитела непосредственно нейтрализуют вирус, препятствуя его проникновению в клетку, слиянию или отпочковыванию от нее. В прямой нейтрализации вируса гриппа в основном участвуют антитела к глобулярному домену гемагглютинина [5], которые, как правило, штаммоспецифичны. Fc-зависимые антитела обычно не являются нейтрализующими, но способны активировать антителозависимую клеточную цитоток-сичность, антителозависимый клеточный фагоцитоз или систему комплемента [18, 34, 49]. Такие антитела могут быть направлены к стволовому домену НА, белкам NA, M2 или NP вируса гриппа, и большинство из них это антитела широкого спектра действия [11, 21, 28, 58].

Разрабатываемые в настоящее время противо-гриппозные вакцины призваны формировать иммунный ответ не столько на «классические» антигены вируса гриппа НА и NA, сколько на различные консервативные вирусные антигены. При создании вакцин широкого спектра действия необходимо знать, какие критерии эффективности нужно учитывать при проведении доклинических и клинических испытаний. Привычные способы оценки гуморального иммунного ответа на противогриппозные вакцины с помощью реакций гемагглютинации и нейтрализации уже не будут актуальными для многих новых вакцин. Разработка методов оценки ненейтрализующих противогриппозных антител и изучение механизмов их действия необходимы для создания эффективных вакцин широкого спектра действия, способных обеспечить защиту как от сезонных, так и от потенциально пандемичных штаммов вируса гриппа. ¦

Список литературы

вакцина грипп белок вирус

1.Paules C., Subbarao K. // Lancet. 2017. V. 390. P 697-708.

2.Седова Е.С., Щербинин Д.Н., Мигунов А.И., Смирнов Ю.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Цыбалова Л.М., Народицкий Б.С., Киселев О.И., Гинцбург А.Л. // Acta Naturae. 2012. Т. 4. № 4(15). С. 17-27.

3.Krammer F. // Nat. Rev. Immunol. 2019. V. 19. № 6. P. 383-397.

4.Щербинин Д.Н., Алексеева С.В., Шмаров М.М., Смирнов Ю.А., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. // Acta Naturae. 2016. V. 8. № 1(28). C. 14-22.

5.Truelove S., Zhu H., Lessler J., Riley S., Read J.M., Wang S., Kwok K.O., Guan Y., Jiang C.Q., Cummings D.A. // Influenza Other Respi. Viruses. 2016. V. 10. P. 518-524.

6.Kitikoon P., Vincent A.L. // Meth. Mol. Biol. 2014. V. 1161. P. 325-35.

7.Brandenburg B., Koudstaal W., Goudsmit J., Klaren V., Tang Ch., Bujny M.V., Korse H.J., Kwaks T., Otterstrom J.J., Ju- raszek J. // PLoS One. 2013. V. 8. № 12. P e80034.

8.Lu L.L., Suscovich T. J., Fortune S.M., Alter G. // Nat. Rev. Immunol. 2018. Т. 18. Р 46-61.

9.Bruhns P, Jцnsson F. // Immunol. Rev. 2015. V. 268. № 1.

P. 25-51.

10.Vanderven H.A., Jegaskanda S., Wheatley A.K., Kent S.J. // Curr. Opin. Virol. 2017. V. 22. P 89-96.

11.DiLillo D.J., Tan G.S., Palese P, Ravetch J.V. // Nat. Med.

2014. V. 20. P. 143-151.

12.Jegaskanda S., Weinfurter J.T., Friedrich T.C., Kent S.J. // J. Virol. 2013. V. 87. P. 5512-5522.

Размещено на Allbest.ru