Склад жирних кислот бактерій штаму Enterococcus italicus ОНУ547

Размещено на http://www.allbest.ru/

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

Склад жирних кислот бактерій штаму Enterococcus italicus ОНУ547

А.Г. Мерліч

Н.В. Коротаєва

Анотація

жирний кислота бактерія штам

Мета. Визначення складу жирних кислот бактерій штаму E. italicus ОНУ547 продуцента бактеріоцину та його попередньої ідентифікації.

Методи. У роботі використовували штам E. italicus ОНУ547, який було виділено з ферментованої капусти з Таїланду. Бактерії культивували на 1,5% агаризованому середовищі de Man, Rogosa and Sharpe (MRS). Жирнокислотний склад бактерій штаму E. italicus ОНУ547 визначали за допомогою газового хроматографа Agilent 7890, оснащеного колонкою Ultra 2 (25 м х 0,2 мм) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США) з використанням автоматичної системи ідентифікації мікроорганізмів MIDI Sherlock. Результати. Вперше показано, що домінуючими жирними кислотами бактерій штаму E. italicus ОНУ547 є октадеценові кислоти (61,52%). Гексадеканова кислота також присутня у відносно високій концентрації та складала 26,41% від загальної кількості. Інші виявлені жирні кислоти (С10, C w7c, С10, С0, цикло w8c, С10, Cff С J присутні в значно менших кількостях, та складали від 0,18% до 6,30%.

У складі ліпідів досліджуваних бактерій переважають ненасичені жирні кислоти. За спектром жирних кислот досліджувані бактерії віднесено до виду E. italicus.

Вперше представника молочнокислих бактерій виду Enterococcus italicus було виділено та описано відносно недавно. В якості характерних ознак бактерій цього виду відмічено здатність до слабкого росту при температурі 10 °С та нездатність зростати в присутності 6,5% NaCl, відсутність пігментоутворення, нездатність утилізувати деякі цукри. Домінуючими жирними кислотами є С18:1 w7c та C16.0 [3]. Дослідниками було показано перспективи застосування бактерій цього виду у харчовій промисловості [4].

У попередніх дослідженнях з ферментованої капусти (Таїланд) нами було виділено штам E. italicus ОНУ547 продуцент бактеріоцину, що також проявляв властивості, які вказують на можливість його застосування у харчовій промисловості. Належність виділеного штаму до виду E. italicus було встановлено на основі результатів секвенування 16S рДНК [1]. Однак для надійної ідентифікації бактерій бажано використовувати різні підходи, що включають класичні мікробіологічні методи, генетичний аналіз та методи хемотаксономії [7], серед яких інформаційним вважається порівняння спектрів жирних кислот [3]. У зв'язку з цим метою роботи було визначення спектру жирних кислот бактерій штаму E. italicus ОНУ547 та підтвердження його попередньої ідентифікації.

Матеріали і методи

У роботі використовували штам бактерій E. italiens ОНУ547, який було виділено нами з ферментованої капусти Таїланду та попередньо ідентифіковано на основі результатів секвенування 16S рДНК [1]. Бактерії культивували на 1,5% агаризованому середовищі de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) за температури 28 °С.

Аналіз складу жирних кислот було виконано згідно з [5]. Підготовку проб здійснювали в декілька етапів. Спочатку, з метою здійснення омилення, до біомаси добової культури бактерій додавали 1 мл реагенту №2 1 (NaOH - 45 г, метанол - 150 мл, дейонізована дистильована вода - 150 мл), перемішували на вортексі впродовж 5-10 сек і прогрівали при 100 °С впродовж 5 хв. Потім, знову перемішували на вортексі, прогрівали при 100 °С впродовж 25 хв і охолоджували. Для здійснення метилування додавали 2 мл реагенту № 2 (6Н HCl - 325 мл, метанол - 275 мл), перемішували на вортексі впродовж 5-10 сек, прогрівали на водяній бані за 80 °С впродовж 10 хв і швидко охолоджували. Наступним етапом було екстрагування жирних кислот шляхом додавання 1,25 мл реагенту № 3 (гексан - 200 мл, метил-трет-бутиловий етер - 200 мл) та перемішування впродовж 10 хв, після чого суміш розділялась на дві фракції. До відібраної верхньої фракції, з метою здійснення промивання, додавали 3 мл реагенту № 4 (NaOH - 10,8 г, дейонізована дистильована вода - 900 мл), перемішували впродовж 5 хв і відбирали верхню фракцію, яка містила виділені жирні кислоти [8].

Газову хроматографію виконували за допомогою хроматографа Agilent 7890, який оснащений колонкою Ultra 2 з 5% фенілметилсилоксану (25 м х 0,2 мм) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). В якості рухомої фази використовували водень [8].

Результати та їх обговорення

У результаті проведених досліджень вперше виявлено, що до складу клітин бактерій штаму E. italicus ОНУ547 входять як насичені так і ненаси- чені жирні кислоти (табл. 1).

Серед насичених виявлено додеканову (С12.0), тетрадеканову (С14.0), гек- садеканову (С16.0), гептадеканову (С17.0), октадеканову С18.0 та циклопропанову (С19.0 цикло w8c) кислоти, тоді як серед ненасичених - суміш гексадеценових кислот (С16.^7с/С16.^6с), суміш октадеценових кислот (С18:1 w7c/С18.1w6c) та ейкозенову кислоту (С20.^7с). Загалом насичені жирні кислоти бактерій штаму E. italicus ОНУ547 складають 31,7% від загальної кількості екстрагованих, тоді як ненасичених - 68,3%. При порівнянні вмісту насичених та ненасичених жирних кислот їх співвідношення складає приблизно 1:2, отже, в складі клітин досліджуваного ентерококу переважають ненасичені жирні кислоти.

Аналіз складу ненасичених жирних кислот клітин E. italicus ОНУ547 виявив, що найбільший вміст серед них має суміш С18:1 w7c/С18:1w6c (90%), тоді як суміші С16.^7с/С16.^6с та С20.^7с наявною є в значно меншій кількості та складають 9,2% та 0,8%, відповідно. Серед насичених жирних кислот у найбільшій кількості представлені С16.0 (83,4%) та С14.0 (7,8%). Жирні кислоти С12.0, С17.0, С18.0 та С19.0 цикло w8c присутні в значно меншій кількості та складають лише 2%, 0,6%, 3,7% та 2,4% від загальної кількості насичених жирних кислот, відповідно.

Таблиця 1. Склад жирних кислот бактерій штаму E. italicus ОНУ547 Composition of fatty acids of bacteria of the strain E. italicus ONU547

Аналіз сумарного складу насичених і ненасичених жирних кислот клітин бактерій штаму E. italicus ОНУ547 показав, що суміш октадеценових жирних кислот домінує серед інших та складає 61,52%, а гексадеканова і ци- клопропанова - 26,41% і 0,77%, відповідно (рис. 1). Отримані нами результати повністю узгоджуються з даними наведеними у єдиній відомій публікації що до складу жирних кислот у E. italicus. У типового штаму E. italicus ТР1.5Т домінують жирні кислоти C18:1 (60,6%) та С16.0 (27,9%), тоді як жирні кислоти С19.0 виявлені у меншій кількості - лише 2,5% [3].

Оскільки штам E. italicus ОНУ547 ізольовано нами із рослинного матеріалу [1], а штам E. italicus ТР1.5Т було виділено із молочних продуктів [2, 3] то узгодження результатів їх жирнокислотного складу може вказувати на те, що він не залежить від джерела виділення. Це підтверджує можливість для надійного застосування аналізу складу жирних кислот для ідентифікації бактерій виду E. italicus.

Склад жирних кислот (особливо визначення складу С16.1) може бути також використаний для розмежування видів E. italicus та E. camelliae, оскільки ці два види ентерококів мають високу схожу послідовність нуклеотидів гену 16S рРНК (на 99,2%) [6]. У наших дослідженнях концентрація ненасичених жирних кислот С16:1 у E. italicus ОНУ547 складала лише 6,3% від загальної кількості виділених жирних кислот, тоді як для E. camelliae FP15-1T їх концентрація складає 30,5%. Крім того, концентрація іншої головної жирної кислоти - С18:1 була значно меншою для E. camelliae FP15-1T (20,9%) [6].

Рис. 1. Хроматограма спектру жирних кислот бактерій штаму E. italiens ОНУ547

Незважаючи на те, що інші жирні кислоти, такі як С^, С^, Сп.0, С^ та С20.1 також є у складі клітин E. italicus ОНУ547, як і у E. camelliae FP15-1T [6], проте вони визначені в значно меншій кількості та складають, відповідно, 0,65%, 2,47%, 0,18%, 1,18% та 0,52% від загальної кількості виділених жирних кислот.

Отже, проведені дослідження показали, що спектр жирних кислот бактерій E. italicus може слугувати важливою характеристикою цього виду і ознакою, яка диференціює його від генетично близького за послідовністю нуклеотидів 16S рРНК виду E. camelliae.

Список використаної літератури

1. Мерліч А.Г., Галкін М.Б., Ліманська Н.В., Швазе І., Ертле Т., Іваниця В.О. Характеристика бактеріоцину Enterococcus italicus ОНУ547, виділеного з квашеної капусти Таїланду // ХV з'їзд товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Одеса, 11-15 вересня, 2017 р.): тез. доп. - Львів: “Сполом”, 2017. - С. 281.

2. Fortina M.G., Ricci G., Acquati A., Zeppa G., Gandini A., Manachini P.L. Genetic characterization of some lactic acid bacteria occurring in an artisanal protected denomination origin (PDO) Italian cheese, the Toma piemontese // Food Microbiol. - 2003. - V 20. - P. 397-404.

3. Fortina M.G., Ricci G., Mora D., Manachini P.L. Molecular analysis of artisanal Italian cheeses reveals Enterococcus italicus sp. nov // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2004. - V 54. - P. 1717-1721.

4. Gaaloul N., Braiek O.B., Berjeaud J.M., Arthur T., Cavera V.L., Chikindas M.L., Hani K. and Ghrairi T. Evaluation of antimicrobial activity and safety aspect of Enterococcus italicus GGN10 strain isolated from Tunisian bovine raw milk // J. Food Saf. - 2014. - V 34 - P. 300-311.

5. Methods in Microbiology / Eds F Rainey and A. Oren. Academic Presss, 2011.

6. Sukontasing S., Tanasupawat S., Moonmangmee S., Lee J.-S. and Suzuki K. Enterococcus camelliae sp. nov., isolated from fermented tea leaves in Thailand // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2007. - V 57. - P 2151-2154.

7. Vandamme P, Pot B., Gillis M., de Vos P, Kersters K., and Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. - 1996. - V 60, № 2. - P. 407-438.

8. http://www.midi-inc.com/pdf/Sherlock_MIS_Operating_Manual.pdf.

Размещено на Allbest.ru