Новый кластер микроРНК, ответственный за репрограммирование к плюрипотентному состоянию

Размещено на http://www.allbest.ru/

Новый кластер микроРНК, ответственный за репрограммирование к плюрипотентному состоянию

В.В. Шерстюк^1,2,3,4#, Г.И. Давлетшина^1,2#, Ю.В. Вяткин^3,5,6, Д.Н. Штокало^5,6,7, В.В. Власов⁴, С.М. Закиян^1,2,3,4*

1Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН,

2Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения РФ,

³Новосибирский национальный исследовательский государственный университет,

4Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,

⁵ООО «АкадемДжин», 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 6 Институт Сен-Лорана,

⁷Институт систем информатики им. А.П. Ершова СО РАН,

РЕФЕРАТ. Репрограммирование соматических клеток к плюрипотентному состоянию - сложный, многоэтапный процесс, в регуляции которого участвует множество факторов, в том числе активно изучаемые в последнее время некодирующие РНК, в частности микроРНК. МикроРНК играют важную роль во многих процессах, включая и репрограммирование клеток. Нами изучена возможность репрограммирования фибробластов крысы с делецией участка ДНК, кодирующего кластер из 14 микроРНК (начиная с miR-743a и до miR-465). Показано, что делеция этого участка значительно снижает эффективность репрограммирования клеток. Клетки, полученные в ходе репрограммирования, отличаются от эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы, что свидетельствует о незавершенности процесса репрограммирования. Таким образом, можно предположить, что данный кластер микроРНК либо отдельные его представители участвуют в регуляции процесса репрограммирования клеток крысы к плюрипотентному состоянию.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА микроРНК, плюрипотентные стволовые клетки, репрограммирование, CRISPR/Cas9. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; мкРНК - микроРНК; ЭСК - эмбриональные стволовые клетки; CRISPR - Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats; PAM - мотив, прилежащий к протоспейсеру (Protospacer Adjacent Motif); ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией; ЩФ - щелочная фосфатаза.

ВВЕДЕНИЕ

Плюрипотентные стволовые клетки - это клетки, способные дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков. Одним из способов получения плюрипотентных стволовых клеток является репрограммирование соматических клеток путем сверхэкспрессии факторов плюрипотентности Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [1]. В результате получают так называемые индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), которые широко применяются для изучения процессов раннего развития и дифференцировки, моделирования наследственных заболеваний, а также в качестве перспективного источника клеточных производных, используемых в регенеративной медицине. Механизмы, отвечающие за процесс репрограммирования, хорошо изучены, известны изменения в экспрессии генов, организации хроматина и метаболизме. Кроме того, в данном процессе участвуют микроРНК (мкРНК) - класс малых некодирующих РНК длиной от 18 до 23 нуклеотидов, осуществляющих посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов. мкРНК играют важную роль в регуляции множества процессов, включая развитие организма и дифференцировку клеток. В настоящее время обнаружено множество мкРНК, экспрессирующихся в плюрипотентных стволовых клетках человека, мыши и крысы. Наиболее изученные мкРНК, участвующие в процессе репрограммирования, относятся к кластерам miR-290-295, miR-302-367 и семейству miR-200 [2]. При этом участие многих других мкРНК в репрограммировании клеток, а также их функции остаются неизвестными. Ранее нами был проведен анализ экспрессии мкРНК в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК), ИПСК и эмбриональных фибробластах крысы. В результате на X-хромосоме выявлен кластер мкРНК (начиная с miR-743a и до miR-465) с повышенным уровнем экспрессии в плюрипотентных клетках по сравнению с фибробластами [3]. Кроме того, экспрессия некоторых мкРНК данного кластера снижается в ходе спонтанной дифференцировки плюрипотентных клеток. Полученные данные позволили нам предположить, что эти мкРНК могут участвовать в процессах самообновления и поддержания плюрипотентного состояния стволовых клеток, а также в их репрограммировании. Для проверки участия данных мкРНК в процессе репрограммирования мы получили фибробласты крысы, несущие делецию участка генома, кодирующего изучаемые мкРНК. Делеция данного участка нарушает процесс репрограммирования к плюрипотентному состоянию, что свидетельствует в пользу участия этого кластера мкРНК либо некоторых его представителей в регуляции этого процесса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Направляющие РНК, фланкирующие целевой участок с мкРНК, подбирали с использованием онлайн платформы Benchling (https://benchling. com/crispr). В итоге выбраны следующие прото- спейсеры: 5'-CTTAGTTAACAGATTAGGAC-3' (PAM-TGG), 5'-TTGCTAGAGTAATACCAACT-3' (PAM-TGG). Олигонуклеотиды встраивали в вектор pX-458-2sgRNA по сайтам BbsI и BsaI. Вектор pX-458-2sgRNA получен путем гидролиза эндонуклеазами рестрикции XbaI и KpnI вектора pX333 (Addgene Plasmid #64073), выделения и очисткифрагмента размером 444 п.н. и встройке данного фрагмента в вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) (Addgene Plasmid #48138), гидролизованный XbaI и KpnI.

Фибробласты крысы культивировали при 37°С и 5% CO₂ в смеси сред DMEM и F12 (1 : 1) (Lonza) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, США), GlutaMAX (Gibco), смеси 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco). Для получения делеции фибробласты (4 х 10⁵) самцов крысы электропорировали плазмидой pX-458- 2sgRNA (5 мкг) с клонированными направляющими РНК с помощью прибора Neon Transfection System (Invitrogen, США). На следующий день клетки сортировали на приборе S3e Cell Sorter (Bio-Rad, США) и субклонировали в 96-луночные планшеты. Через 6-14 дней лунки просматривали под микроскопом и отбраковывали содержащие несколько островков роста, чтобы исключить поликлональные линии. Моноклональные линии размножали, выделяли ДНК и анализировали с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. Последовательности праймеров приведены в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров для ПЦР-анализа линий клеток с делецией целевого локуса

Для репрограммирования фибробласты (5 х 10⁴) трансдуцировали двумя препаратами лентиви- русов, кодирующих факторы плюрипотентности Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и тетрациклиновый трансактиватор. За 1 ч до трансдукции в среду добавляли 4 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich, США). Препараты лентивирусов получали с использованием векторов TetO-FUW-OSKM (Addgene Plasmid #20321) и FUdeltaGW-rtTA (Addgene Plasmid #19780) и векторов, кодирующих белки, необходимые для упаковки вирусных частиц, psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) и pMD2.G (Addgene Plasmid #12259), по протоколу, описанному ранее [4]. На следующие сутки после трансдукции в среду добавляли 2 мкг/мл доксициклина (Sigma-Aldrich), на четвертые сутки фибробласты пересаживали на слой митотически неактивных эмбриональных фибробластов мыши и культивировали в среде N2B27, состоящей из смеси N2 (DMEM/F12 с добавкой N2) (Gibco) и B27 (Neurobasal с добавкой B27) (Gibco), а также GlutaMAX, смеси 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 0.1 мМ 2-меркап- тоэтанола (Sigma-Aldrich), 1000 ед./мл LIF мыши (StemRD), 1 мкМ PD0325901 (StemRD) и 3 мкМ CHIR99021 (StemRD). Репрограммирование проводили в трех повторностях. На 10-14 день репрограммирования некоторые колонии частично механически пересаживали на отдельные ячейки для размножения и дальнейшего анализа, на 20 день окрашивали на щелочную фосфатазу (ЩФ) по протоколу, описанному ранее [4].

Иммунофлуоресцентное окрашивание осуществляли как описано ранее [4]. Для анализа использовали следующие первичные антитела: SSEA1 (sc-21702, 1:25), Oct4 (sc-5279, 1:200) и Sox2 (sc-20088, 1:200) (Santa Cruz Biotechnology, США). Для визуализации использовали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированные с флуоресцентными красителями Alexa 488 и Alexa 568 (Life Technologies, США).

РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) по протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием 500 нг РНК, обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen) и Random Hexamer primers (Thermo Scientific, США). Полученную кДНК анализировали на приборе LightCycler480 (Roche, Швейцария) с использованием набора БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue («Биолабмикс», Россия). Реакцию амплификации проводили при следующих условиях: 95°С, 5 мин; 40 циклов - 95°С, 15 с и 60°С, 1 мин. Последовательности праймеров приведены в табл. 2.

Таблица 2. Последовательности праймеров для анализа экспрессии маркеров плюрипотентного состояния

Поиск потенциальных мишеней проводили с использованием программ TargetSpy v1.1 [5], miRanda v3.3a [6] и TargetScan v7.0 [7]. Выбирали только гены-мишени, предсказанные всеми тремя программами и имеющие пониженный уровень экспрессии в ЭСК и ИПСК крысы по сравнению с фибробластами. Данные об экспрессии мРНК получены ранее [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследованный нами кластер мкРНК локализуется в участке 37 длинного плеча Х-хромосомы и состоит из 14 мкРНК: miR-743a, miR-743b, miR-742, miR-883, miR-471, miR-3551, miR-741, miR-463, miR-880, miR- 878, miR-881, miR-871, miR-3580, miR-465 (рис. 1А). Гипотезу об участии данного кластера мкРНК в процессе репрограммирования к плюрипотентному состоянию мы проверяли с использованием нокаута этих мкРНК путем делеции участка генома, их кодирующего. Делецию получали с помощью системы CRISPR/Cas9 с двумя направляющими РНК, фланкирующими делетируемый участок. В результате получены 94 субклонированные линии фибробластов самцов крысы, из которых семь несли делецию целевого участка ДНК (рис. 1Б). Наличие делеции в субклонированных линиях проверяли методом ПЦР с использованием фланкирующих праймеров. Кроме того, проверяли присутствие транслокации делетируемого участка с использованием вложенных праймеров (рис. 1В). В некоторых линиях наличие делеции подтверждали секвенированием по Сэнгеру (рис. 1Г).

Рис. 1. А - схема исследуемого кластера мкРНК. Горизонтальными стрелками обозначены праймеры, вертикальными - сайты внесения двухцепочечных разрывов. Б - результаты выявления делеции в субклонированных линиях. Использованы праймеры FL1 и FL2. В - анализ поликлональности субклонированных линий(слева) и наличия транслокации (справа) с использованием пар праймеров FL1-IN3 и IN1-IN2 соответственно. к+ и к-- положительный и отрицательный контроли ПЦР.

Г - примеры секвенирования по Сэнгеру ПЦР- продуктов, полученных с праймеров FL1 и FL2, при наличии делеции целевого участка. ДТ - дикий тип

Рис. 2. А - эффективность репрограммирования линий фибробластов - контрольной и с нокаутом. Звездочкой обозначены статистически значимые отличия, *р<0.05, критерий Манна-Уитни. Б - репрезентативные изображения колоний, полученных в результате репрограммирования, а также ЭСК крысы. Фазовый контраст сверху, окраска на ЩФ снизу. В - иммунофлуоресцентное окрашивание колоний, полученных в результате репрограммирования. Масштаб 100 мкм. Г - ОТ-ПЦР-анализ экспрессии маркеров плюрипотентного состояния. Звездочками обозначены статистически значимые отличия экспрессии генов в клетках с нокаутом по сравнению с контролем, *р<0.05, **р<0.005, /-критерий Стьюдента

Экспрессию экзогенных факторов плюрипотентности активировали параллельно в линиях фибробластов с делецией кластера мкРНК и в контрольной линии клеток, которую, во-первых, использовали для получения линий с нокаутом, а, во-вторых, электропорировали плазмидой pX-458-2sgRNA, не кодирующей направляющие РНК. Эффективность репрограммирования фибробластов с нокаутом мкРНК оказалась значимо ниже по сравнению с контрольной линией (рис. 2А). В ходе репрограммирования некоторые колонии как из контрольных, так и из экспериментальных лунок механически частично пересаживали для дальнейшего анализа. Морфология клеток, полученных в контрольном эксперименте, соответствует морфологии ЭСК крысы. Данные ИПСК-подобные клетки успешно культивируются, сохраняют морфологию и положительно окрашиваются на ЩФ после отмены экспрессии экзогенных факторов плюрипотентности (рис. 2Б). Они экспрессируют маркеры плюрипотентного состояния, что подтверждается иммунофлуоресцентным окрашиванием и ОТ-ПЦР в реальном времени (рис. 2В,Г).

Клетки, полученные при репрограммировании фибробластов с нокаутом кластера мкРНК miR- 743a-miR-465, имеют эпителиальную морфологию, что говорит о прохождении начального этапа репрограммирования - мезенхимально-эпителиальногоперехода. Однако эти клетки в отличие от контрольной линии образуют неплотные колонии. Процесс репрограммирования происходит не полностью, клетки гибнут в отсутствие доксициклина, что свидетельствует о зависимости от экспрессии экзогенных факторов плюрипотентности. Стоит отметить, что клетки с нокаутом кластера miR-743a-miR-465 положительно окрашиваются на ЩФ и SSEA1, подтверждая прохождение начальных этапов репрограммирования плюрипотентности (рис. 2Б,В). В этих клетках наблюдается также экспрессия маркеров плюрипотентности, но ее уровень значительно ниже, чем в контрольной группе клеток (рис. 2Г).

В число мишеней исследуемых мкРНК входят гены сигнального пути TGF-Я, ингибирование которого способствует репрограммированию [9]. Значительную долю составляют гены сигнального пути Wnt, ингибирование которого на ранних стадиях необходимо для успешного репрограммирования клеток [10]. Присутствуют также известные ингибиторы процесса репрограммирования Cdkn1a и Zeb1 [11, 12].

мкРНК играют важную роль в регуляции множества процессов, в том числе и в репрограммировании клеток к плюрипотентному состоянию. В настоящее время изучена лишь малая часть мкРНК, экспрессирующихся в плюрипотентных клетках и вовлеченных в процесс репрограммирования. Появление систем редактирования генома значительно ускорило прогресс в изучении функций как белоккодирующихгенов, так и некодирующих РНК. В отличие от ингибиторов мкРНК, основанных, например, на LNA- олигонуклеотидах, система CRISPR/Cas9 позволяет добиться более специфичного и постоянного нокаута мкРНК. Кроме того, использование CRISPR/Cas9 делает возможным нокаут целого кластера мкРНК.

Исследованный кластер мкРНК расположен вблизи белоккодирующего гена Slitrk2. Схожие кластеры мкРНК обнаружены у других видов млекопитающих, в том числе у мыши и человека [13]. Предполагается, что у разных видов эти кластеры мкРНК имеют общего предка, но значительные различия в последовательностях премкРНК и seed-регионов свидетельствуют о быстрой эволюции этих мкРНК [13, 14]. Высокий уровень экспрессии данных кластеров мкРНК выявлен в семенниках мыши и человека, а их участие в регуляции сперматогенеза у мышей показано путем делеции некоторых из них [13-15]. Функционально подтверждено существование общих генов-мишеней у данных мкРНК мыши и человека, несмотря на различия в их нуклеотидных последовательностях [14]. Стоит также отметить, что мкРНК данного кластера способны функционально компенсировать взаимное отсутствие [13]. В отличие от мыши, уровень экспрессии некоторых мкРНК у крысы, в частности mir-741, сравним в семенниках и плюрипотентных клетках, что может свидетельствовать о видоспецифичных особенностях плюрипотентных клеток крысы [3, 15]. Тем не менее, в огромном пуле потенциальных генов-мишеней могут быть представлены общие гены, участвующие в процессе репрограммирования у разных видов. Таким образом, этот кластер мкРНК может принимать участие в репрограммировании не только клеток крысы, но это требует дальнейшего изучения.

Нарушение процесса репрограммирования при делеции участка ДНК, содержащего кластер из 14 мкРНК (с miR-743a по miR-465), позволяет предположить вовлеченность всех или некоторых из них в данный процесс. Стоит отметить, что делеция такого значительного по размеру района могла затронуть либо неизвестные регуляторные элементы, либо неаннотированные гены. Тем не менее, наше исследование можно рассматривать как первый шаг в изучении данного кластера мкРНК в процессе репрограммирования клеток к плюрипотентному состоянию.

репрограммирование соматический клетка кодирующий кластер

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

2. Greve T.S., Judson R.L., Blelloch R. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2013. V. 29. P. 213-239.

3. Sherstyuk V.V., Medvedev S.P., Elisaphenko E.A., Vaskova E.A., Ri M.T., Vyatkin Y.V., Saik O.V., Shtokalo D.N., Pokushalov E.A., Zakian S.M. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 2787.

4. Grigor'eva E.V., Shevchenko A.I., Medvedev S.P., Mazurok N.A., Zhelezova A.I., Zakian S.M. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 4. P. 56-69.

5. Sturm M., Hackenberg M., Langenberger D., Frishman D. // BMC Bioinformatics. 2010. V. 11. P. 292.

6. Betel D., Wilson M., Gabow A., Marks D.S., Sander C. // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. Database issue. P. D149-153.

7. Agarwal V., Bell G.W., Nam J.W., Bartel D.P. // Elife. 2015. V. 4. e05005.

8. Vaskova E.A., Medvedev S.P., Sorokina A.E., Nemudryy A.A., Elisaphenko E.A., Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Kizilova

E.A., Zhelezova A.I., Evshin I.S., et al. // Stem Cells Dev. 2015. V. 24. № 24. P. 2912-2924.

9. Ichida J.K., Blanchard J., Lam K., Son E.Y., Chung J.E., Egli D., Loh K.M., Carter A.C., Di Giorgio F.P., Koszka K., et al. // Cell Stem Cell. 2009. V. 5. № 5. P. 491-503.

10. Aulicino F., Theka I., Ombrato L., Lluis F., Cosma M.P. // Stem Cell Reports. 2014. V. 2. № 5. P. 707-720.

11. Brosh R., Assia-Alroy Y., Molchadsky A., Bornstein C., Dekel E., Madar S., Shetzer Y., Rivlin N., Goldfinger N., Sarig R., et al. // Cell Death Differ. 2013. V. 20. № 2. P. 312-320.

12. Samavarchi-Tehrani P., Golipour A., David L., Sung H.K., Beyer T.A, Datti A., Woltjen K., Nagy A., Wrana J.L. // Cell Stem Cell. 2010. V. 7. № 1. P. 64-77.

13. Zhang F., Zhang Y., Lv X., Xu B., Zhang H., Yan J., Li H., Wu L. // Mol. Biol. Evol. 2019. V. 36. № 4. P. 663-678.

14. Ramaiah M., Tan K., Plank T.M., Song H.W., Dumdie J.N., Jones S., Shum E.Y., Sheridan S.D., Peterson K.J., Gromoll J., et al. // EMBO Rep. 2019. V. 20. № 2. P. e46566.

15. Ota H., Ito-Matsuoka Y., Matsui Y. // PLoS One. 2019. V. 14. № 2. P. e0211739.

Размещено на Allbest.ru