Зміни білкового складу тканин при розвитку експериментального ожиріння у щурів

Ключевые слова: ожирение, белковый состав, высококалорийная диета, диск-электрофорез, метаболический синдром.

The problem of obesity in modern world has a leading place along with other pathologies. Contrary to the settled ideas that the reason of obesity is hypodynamia and overeating, leading medical editions claim that investigating pathology has polymorphic origin and are linked to the cascade of various violations in organs and their systems. Recently collected data array on the basis of which participation of tissue-specific peptide pools in maintenance to a homeostasis is being postulated, in particular, their ability to regulate proliferation processes, differentiation and death of cells is established. We have characterized fractions of low-, medium- and high-molecular-weight protein homogenates from liver, kidney, muscle and adipose tissue samples of rats with experimental obesity. Protein fractions were separated by electrophoresis using the Laemmli method in 10 % PAAG with sodium dodecyl sulfate (SDS). Spreading between proteins in control and group of rats with obesity has showed a difference in quantity of fractions. We have investigated quantitative and qualitative composition of protein fractions in rat's tissues. Under experimental obesity conditions protein composition of tissues changes, the content of median-molecular fraction (67-35 kDa) and low molecular weight fraction (35-10 kDa) increases. Experimental data may indicate connection breach in protein-protein interactions in these viscuses and predict the formation of non-specific proteins and their fragments in the bloodstream, as a result of increased activity of proteolytic enzymes and destruction of viscuses cells. Future studies in specifics of protein composition changes and peptide pool of rat's tissues will improve understanding the biochemical processes under the conditions of this pathology, which is important in development of new approaches to diagnosis and treatment of obesity principles.

Проблема ожиріння в сучасному світі займає провідне місце поруч з іншими патологіями. Усупереч сталим уявленням про те, що причиною ожиріння є гіподинамія та надмірне надходження їжі, провідні медичні видання стверджують, що досліджувальна патологія має поліморфне походження та пов'язана каскадом різних порушень в органах та їх системах. Останнім часом накопичився масив даних, на основі яких постулюється участь тканино-специфічних пептидних пулів в підтриманні гомеостазу, зокрема, встановлена їх здатність регулювати процеси проліферації, диференціювання та загибелі клітин. Знання, отримані в результаті патофізіологічних аналізів захворювань людини, недостатні для того, щоб пояснити складні механізми їх патогенезу. Полігенні та багатофакторні розлади, такі як рак, захворювання серцево-судинної системи, ожиріння і діабет II типу, є прикладом захворювань, де моделі гризунів широко використовуються для дослідження фундаментальних механізмів шляхом відтворення деяких змін, які відбуваються в організмі людини [9]. Ожиріння змінює метаболічну і ендокринну функції жирової тканини і призводить до підвищеного вивільнення жирних кислот, гормонів і прозапальних молекул, які сприяють ускладненням, пов'язаним з ожирінням [14]. Ці розлади включають гіпертензію, дисліпідемію і резистентність до глюкози. Це фактор ризику для серцево- судинних захворювань, інсульту, цукрового діабету 2 типу та деяких видів раку [12]. Збільшення рівня чутливих до запалення білків плазми (ISP) фібриногену, альфа-1-кислий глікопротеїн (AGP), альфа1- антитрипсину, гаптоглобіну і церулоплазміну пов'язані зі збільшенням ваги [7]. У різних дослідженнях сироватковий альбумін і концентрація загального білка під час ожиріння не відрізнялися від контрольних [1]. Навіть під час дослідження зразків пацієнтів з ожирінням показали помітно знижену концентрацію альбуміну в сироватці порівняно з контрольною групою пацієнтів [2]. Крім того, концентрації сироваткового альфа 1-кислого глікопро- теїну, зв'язуючого білка гормону росту (GHBP), ферити- ну і ретинол-зв'язуючого білка 4 (RBP4), збільшуються зі збільшенням ваги.

У мишей, що знаходились на висококалорійній дієті (ВКД) спостерігається порушення толерантності до глюкози та резистентність до інсуліну, що призводить до гіперглікемії, гіперінсулінемії та порушення секреції глюкагону [4]. Глюкагон, що продукується панкреатичними a-клітинами, демонструє порушення секреції як при цукровому діабеті 1-го типу, так і при діабеті 2-го типу і сприяє гіперглікемії [5, 6, 8, 11, 13].

Частота нових випадків ожиріння продовжує зростати в усьому світі, що робить дослідження механізмів розвитку та пошук нових методів лікування даного захворювання вкрай актуальним. Таким чином, висока поширеність, рання смертність, прогресування і невисока ефективність сучасних методів корекції надмірної ваги і лікування ожиріння змушують шукати все нові терапевтичні підходи. При цьому більшість способів нормалізації ваги усувають наслідок, а не причину. Тому без сумніву, є актуальним дослідження різних експериментальних моделей ожиріння, які б на патогенетичному рівні відповідали розвитку цього захворювання у людини і могли б бути основою для пошуку нових перспективних засобів, шляхів корекції різноманітних ускладнень, які виникають за умов ожиріння.

Тому дослідження даної проблеми та її складових дають змогу отримати повну картину про розвиток та протікання цієї патології, її терапевтичне лікування та попередження.

Метою роботи було дослідити зміни вмісту білкового складу гомогенатів тканин щурів за умов розвитку експериментального ожиріння під впливом висококалорійної дієти.

Матеріали і методи. Досліди проводилися на білих нелінійних щурах-самцях з початковою масою 115-150 г. Впродовж 1 тижня експерименту всі тварини одержували стандартну їжу "Purinarodentchow" та воду ad libitum. На 8-й день експерименту тварини були рандомізовано поділені на 2 групи. Щури 1-ї групи ("Контроль") продовжували отримувати стандартний корм упродовж наступних 10 тижнів. Тварини 2-ї групи ("ВКД") перебували на висококалорійній дієті, яка складалась із стандартної їжі (60 %), свинячого жиру (10 %), курячих яєць (10 %), сахарози (9 %), арахісу (5 %), сухого молока (5 %) та рослинної олії (1 %) та отримували воду [16].

Кількість білку визначали за методом Bradford[3]. Цей метод ґрунтується на здатності барвника Кумасі діамантово-синього G-250 змінювати забарвлення при зв'язуванні з білком, при цьому максимум поглинання зміщується відповідно з 465 до 595 нм. За таких умов концентрація барвника, що зв'язалась з білком, прямо- пропорційна кількості білку в пробі.

Розділення білкових фракцій тканин щурів проводили методом диск-електрофорезу у 10 % поліакриламід- ному гелі (ПААГ) за наявності 0,1 % додецилсульфату натрію (ДДС-Na). Електрофорез проводили за методом Лемлі [10], в якому замість фосфатного буфера використовували трисгліцинову систему [15]. Електрофорез проводили у апараті для вертикального препаративного диск-електорофорезу ("BioRad") у скляних пластинах завтовшки 1 мм) за сили струму 19 мА для концентруючого та 35 мА для розділяючого гелів. Як маркери використовували "LMW Calibration Kit" ("Amersham Biosciences", США), до якого входять такі білки: 97 кДа - фосфорилаза Б, 66 кДа - альбумін, 45 кДа - овальбумін, 31 кДа - карбоангідраза, 21 кДа - соєвий інгібітор трипсину, 14 кДа - a-лактальбумін. Статистично достовірні розрахунки молекулярних мас та кількості білкових смуг на електрофореграмах проводили використовуючи програму "TotalLabTL120".

Статистичну обробку результатів дослідження проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики. Для статистичної обробки параметричних даних був використаний t-критерій Стьюдента для незалежних вибірок [17].

Експериментальні роботи з щурами проводили в умовах віварію Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Проведення експерименту здійснювалось із дотриманням принципів біоетики, що викладені у Хельсинській декларації Всесвітньої медичної асоціації про гуманне ставлення до тварин, а також згідно із Законом України "Про захист тварин від жорстокого поводження" від 15.12.2009 р. № 1759-VI та "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Київ, 2001).

Результати досліджень та їх обговорення. Білки посідають центральне місце у процесах життєдіяльності організму, входячи до складу всіх клітинних та міжклітинних структур, виконують каталітичну, структурну, регуляторну, рецепторну, транспортну, механічну, захисну та інші функції. Склад білків тканин організму змінюється залежно від функціонального стану і зумовлює їх роль в оцінці здоров'я, як у нормі, так і за умов різних патологій. ожиріння біохімічний метаболічний

Розподіл між білками у контрольній і групі щурів з ожирінням показав різницю у кількості фракцій (табл. 1). У контрольній групі щурів білки гомогенату печінки розділилися на 17 фракцій (рис.1). У групі щурів, які мали ожиріння, білки гомогенату печінки розділилися на 13 фракції (рис. 2). Білкові фракції гомогенату нирок інтактних тварин розподілилися на 10 фракцій (рис.3), у той час, як білкові фракції гомогенату нирок експериментальних тварин розподілилися на 18 фракцій (рис.4). Кількість білкових фракцій гомогенатів м'язової та жирової тканин інтактних тварин та тварин експериментальним ожирінням також відрізнялися.

Аналіз літературних даних дозволив нам поділити фракції, відповідно до молекулярної маси (м.м.), на високомолекулярні (100-150 кДа), середньомолекулярні (67-100 і 35-67 кДа) та низькомолекулярні (10-35 кДа) для всіх досліджувальних груп.

Встановлено, що за умов розвитку експериментального ожиріння розподіл білків гомогенатів тканин змінювався. Так в гомогенаті печінки експериментальних тварин спостерігалась відсутніть високомолекулярної білкової фракції (100-150 кДа), в той час, як середньо- молекулярна (100-67 кДа) білкова фракція знизилась на 27 % (р<0,05), у свою чергу низькомолекулярна фракція (35-10 кДа) знизилась на 10 % (р<0,05) порівняно з групою інтактних тварин.

У гомогенаті нирок експериментальних тварин спостерігалась поява високомолекулярної білкової фракції (150-100 кДа) та середньомолекулярної фракції (10067 кДа) та збільшення фракції середньомолекулярної білкової фракції 67-35 (кДа) на 36 % (р<0,05) та збільшення низькомолекулярної фракції (35-10 кДа) на 20 %. В гомогенаті м'язової тканини експериментальних тварин з'являється середньомолекулярна білкова фракція (100-67 кДа), білкова фракція (67-35 кДа) збільшилась на 40 % (р<0,05) відносно групи інтактних тварин. E гомогенаті жирової тканини експериментальних тварин спостерігалось поява високомолекулярної білкової фракції (150-100 кДа) та збільшення низькомолекулярної білкової фракції (35-10 кДа) на 10 % (р<0,05). Кореляції між вмістом низькомолекулярної фракцій (3510 кДа) e гомогенатах жирової та м'язової тканин у контрольній та експериментальній групі не спостерігалось.

Табл. 1

Аналіз літературних даних показав, що білкові фракції 115 кДа (CRP), 26 кДа (TNF-a) і 20 кДа (RBP4) позитивно корелюють з ожирінням і збільшенням ваги, тоді як білкові фракції 66 кДа (альбумін), 49 кДа і 43 кДа (а-1 кислота- гпікопротеї'ну) мають негативний вплив на ожиріння.

Рис 1. Типова електрофореграма розділення білків гомогенату печінки інтактних щурів: 8 - маркери молекулярної маси (97, 66, 45, 31,21,14 кДа); 1-7 - зразки гомогенату печінки інтактних тварин

Печінка, як основний орган детоксикації, та нирки, одними з перших зазнають змін біохімічних процесів, а враховуючи, що саме тут активно протікають процеси синтезу та розпаду білків, які мають важливе значення для забезпечення потреб організму, метою нашої роботи було дослідження білкових фракцій за умов розвитку ожиріння.

Рис. 2. Типова електрофореграма розділення білків гомогенату нирок інтактних щурів: 3 - маркери молекулярної маси (97, 66, 45, 31,21,14 кДа); 1-2, 4-8 - зразки гомогенату нирок інтактних тварин

Рис. 3. Типова електрофореграма розділення білків гомогенату нирок щурів з ожирінням: 3 - маркери молекулярної маси (97, 66, 45, 31,21, 14 кДа); 1-2, 4-7 -зразки гомогенату нирок тварин з ожирінням

Проведений кількісний аналіз виявив значне зростання вмісту всіх білкових фракцій відповідної молекулярної маси у гомогенаті нирок тварин, що перебували на висококалорійній дієті порівняно з групою інтактних тварин. Одержані нами дані в цілому узгоджуються з даними, представленими в літературі, відповідно до яких потенційним патогенетичним механізмом, що обумовлений метаболічним синдромом, є накопичення в цитоплазмі гепатоцитів білків. По-перше, це практично усі глікопротеїни, що синтезуються в печінці та потім транспортуються до кровотоку. Накопичення пов'язане з порушеннями функціонування апарату Гольджі та процесами посттрансляційного фолдингу білків, в результаті чого утворюється певна кількість білків з аномальними властивостями. Вплив метаболічного синдрому може реалізуватися на різних етапах білкового обміну, зокрема, на рівні їх синтезу, секреції та протеолітичного розщеплення. В печінці синтезується значна кількість білків плазми крові, зокрема, альбумін, транс- феррин, коагуляційні фактори, які є необхідними для підтримання належного гомеостазу, тому порушення їх секреції призводить до зміни буферності та об'єму крові, доставки іонів до периферійних тканин та обумовлює дефекти системи згортання крові. У нирках синтезується активатор плазміногену - урокіназа. В мозковій речовині нирки утворюються простагландини. Вони беруть участь, зокрема, в регуляції ниркового і загального кровотоку, збільшують виділення натрію з сечею, зменшують чутливість клітин канальців до АДГ.

Було досліджено кількісний та якісний склад білкових фракцій у гомогенатах тканин щурів. Виявлено, що за умов розвитку експериментального ожиріння білкові фракції гомогенатів тканин щурів змінюються, а саме збільшувався вміст середньомолекулярної фракції (67-35 кДа) та низькомолекулярної фракції (3510 кДа). У жировій тканині було виявлено зростання високомолекулярної фракції (150-100 кДа). Експериментальні дані можуть свідчити про порушення білок-білкових взаємодій у цих органах та передбачити появу в крово- тоці неспецифічних білків та їх фрагментів, як результат посилення дії протеолітичних ферментів та руйнування клітин органів. Подальші дослідження особливостей змін білкового складу та пептидного пулу тканин щурів сприятимуть кращому розумінню біохімічних процесів за умов даної патології, що є важливим для розроблення підходів діагностики та лікування ожиріння.

Література

1. Alterations in drug distribution and clearance due to obesity / R. Abernethy, D.J. Greenblatt, M. Divoll et al. // J. Pharmacol. exp. Ther. 217. - P. 681-685.

2. Andersen T. The liver in consecutive patients with morbid obesity: a clinical, morphological, and biochemical study / T. Andersen, P. Christoffersen, C. Gluud // Int. J. Obesity, 8. - P. 107-115.

3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analytical Biochemistry, 1976. - Vol. 72, № 1-2. - P. 248-254.

4. Glucagon receptor knockout mice are resistant to diet-induced obesity and streptozotocin-mediated beta cell loss and hyperglycaemia / Conarello S.L., Jiang G., Mu J. et al. // Diabetologia. 20o7. - 50(1). - P.142-150.

5. Failure of glucagon suppression contributes to postprandial hyperglycaemia in IDDM / S. Dinneen, A. Alzaid, D. Turk, R. Rizza // Diabetologia, 1995. - 38(3). - P. 337-343.

6. Dunning B.E.The role of alpha-cell dysregulation in fasting and postprandial hyperglycemia in type 2 diabetes and therapeutic implications / B.E. Dunning, J.E. Gerich // Endocr Rev., 2007. - 28(3). - P. 253-283.

7. Inflammation-sensitive plasma proteins are associated with future weight gain / G. Engstrцm, B. Hedblad, L. Stavenow et al. // Diabetes, 52. - P. 2097-2101.

8. Gromada J. Alpha-cells of the endocrine pancreas: 35 years of research but the enigma remains. / J. Gromada, I. Franklin, C.B. Wollheim // Endocr. Rev., 2007. - 28(1). - P. 84-116.

9. Jean-Charles Sanchez. The mouse SWISSD2D PAGE database: a tool for proteomics study of diabetes and obesity / Sanchez Jean-Charles // Proteomics, 2001. - Vol. 1, Iss. 1. - P. 136-163.

10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage / U.K. Laemmli // Nature, 1970. - P. 680-685.

11. Larsson H. Islet dysfunction in insulin resistance involves impaired insulin secretion and increased glucagon secretion in postmenopausal women with impaired glucose tolerance / H. Larsson, B. Ahren // Diabetes care, 2000. - 23(5). - P. 650-657.

12. Obesity-associated hypertension. New insights into mechanisms / K. Rahmouni, M. Correia, W.G. Haynes, A.L. Mark // Hypertension, 2005. - 45. - P. 9.

13. Lack of suppression of glucagon contributes to postprandial hyperglycemia in subjects with type 2 diabetes mellitus / P. Shah, A. Vella, A. Basu et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab., 2000. - 85(11). - P. 4053-4059.

14. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue / P. Stuart, D. Weisberg, M. Desai et al. // J. clin. Invest., 2003. - 112. - P. 1796-1808.

15. Weber K. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacriylamide gel electrophoresis / K. Weber., M. Osborn // J. Biol. Chem., 1969. - Vol. 244, № 16. - P. 4406-4412.

16. Vitamin E regulates adipocytokine expression in a rat model of dietary-induced obesity. / Xiu-Hua Shen, Qing-Ya Tang, Juan Huang, Wei Cai // Experimental Biology and Medicine, 2010. - № 235. - P. 47-51.

17. Плохинский Н.А. Методические консультации по биометрии / Н.А. Плохинский // Проблемы современной биометрии. - М. : МГУ, 1981. - С. 30-50.

Размещено на Allbest.ru