Виділення та характеристика мутантного N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази B. taurus із заміною Trp 87 та Trp 283 на аланін

Размещено на http://allbest.ru

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Виділення та характеристика мутантного N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази B. taurus із заміною Trp 87 та Trp 283 на аланін

О. Цуварєв, Л. Коломієць, В. Заєць,

І. Блащак, О. Корнелюк

Київ, Україна



Вступ

Аміноацил-тРНК синтетаза (АРСаза) є одним із основних ферментів білкового синтезу. На дорибосомному етапі трансляції у високоспецифічній енергозалежній реакції синтетаза каталізує активацію амінокислоти та приєднання її до гомологічної транспортної РНК, здійснюючи таким чином першу стадію декодування інформації про структуру білка, закладену в нуклеотидній послідовності ДНК та РНК [1, 2].

Тирозил-тРНК синтетаза Bos taurus складається із двох структурних модулів, N-кінцевого каталітичного (відповідає укороченій формі фермента міні BtTyrRS, 342 а.з.,39 кДа) та С-кінцевого цитокіноподібного (166 а.з., 20 кДа) [2]. У повнорозмірній BtTyrRS (528 а.з., 59,2кДа) N-кінцевий модуль здійснює каталітичну функцію ковалентного зв'язування відповідної амінокислоти із тРНК, тоді як С-модуль корегує та стабілізує розміщення тРНК в активному центрі фермента [1, 2]. Після розщеплення тирозил-тРНК синтетази еластазою на міні BtTyrRS та С-модуль останні виявляють цитокінові властивості [3-5].

Тести на цитокінову активність NH2-кінцевого каталітичного домену TyrRS виявили, що міні TyrRS є хемотоксичним фактором для нейтрофілів, а також стимулює ангіогенез по концентраційно залежному шляху. Уважається, що цитокінова активність міні TyrRS опосередковується консервативним мотивом ELR у каталітичному домені синтетази [4-5].

У фізіологічних умовах тирозил-тРНК синтетаза Bos taurus являє собою гомодимер а2 типу, мономером якого є повнорозмірний фермент. При виділенні BtTyrRS із печінки бика було показано, що поряд із основною формою виділяється також і функціонально активна протеолітично модифікована форма тирозил-тРНК синтетази з молекулярною вагою 39 кДа, яка має повну ферментативну активність в експериментах in vitro [2, 6-7].

Оскільки N-кінцевий каталітичний модуль синтетази являє собою інтерлейкін-подібний цитокін і виявляє проангіогенні властивості, він є перспективним об'єктом для досліджень з метою можливого використання в подальшому в якості лікарських препаратів. У структурі каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази містяться три залишки триптофану W40, W87 і W283, які розташовані, відповідно, в активному центрі ферменту, в області димеризации мономерів міні BtTyrRS та в сайті зв'язування триплета антикодону тРНІКГуг. Таке розташування залишків триптофану в амінокислотній послідовності білка робить дуже перспективним дослідження його властивостей методами флуоресцентної спектроскопії за умови наявності лише одного залишка в кожному із трьох положень у структурі ферменту. У зв'язку з цим за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу ми замінили в кДНК міні BtTyrRS, клонованої в плазміді pET30а-39KYRS, кодони Trp87 та Trp283 на кодони аланіну, залишивши лише один кодон триптофану в каталітичному центрі ферменту W40 (Стаття подана до друку).

Метою нашої роботи було отримання даного рекомбінантного однотриптофанового білка міні BtTyrRS для подальшого дослідження конформаційних змін фермента на стадії утворення тирозиладенілату та при взаємодії з акцепторним кінцем тРНКTyr, а також визначення впливу залишків триптофану в положенні 87 та 283 у його структурі на структурно-динамічні та функціональні властивості ензиму.

На сьогодні упроваджено декілька гетерологічних експресійних систем для отримання рекомбінантних білків. Вони засновані на клітинних лініях ссавців, клітинах дріжжів і бактерій, а також клітинних лініях комах [8]. Серед них найбільшим попитом користується бактеріальна система E. coli. Експресія білків у E. coli є недорогим, швидким і простим методом, який дозволяє отримати рекомбінантні білки у великих кількостях у нативному стані [9, 10]. Ми використали в нашій роботі бактеріальну систему E. coli для синтезу мутантної форми міні TyrRS Bos taurus.



Матеріали і методи

У роботі використовували штам-продуцент рекомбінантного білка, отриманий на основі реципієнта E. coli BL21(DE3)pLysE (Stratagene, США), трансформованого відповідною конструкцією за загально прийнятою методикою [11]. мутантний білок ензим тирозиладенілат

Плазмідна конструкція pET30а-39KYRSW40 була створена на базі вектора pET-30a(+) ("Novagen", США) і містила кДНК, що кодує синтез мутантної по залишках триптофанів у положенні 87 та 283 міні BtTyrRS під контролем промотора фага Т7.

Селективним маркером плазміди pET30a(+) є ген, який забезпечує стійкість трансформованих клітин до антибіотика канаміцину. Плазмідну ДНК виділяли за допомогою кіта Gene JET Plasmid Miniprep Kit фірми "Thermo Scientific".

Концентрацію плазмідної ДНК визначали на спектрофотометрі NanoDrop 2000 ("Thermo Scientific").

Для отримання рекомбінантної плазміди pET30а- 39KYRSW40, трансформації її у клітини E. coli та експресії кДНК каталітичного модуля тирозил-тРНК син- тетази Bos taurus використовували відповідно генно- інженерні штами E. coli DH5a та BL21(DE3)pLysE.

Компетентні клітини E. coli отримували відповідно до методів Нішимури і співавторів [І2] та Іное [13]. Усі процедури із трансформації плазмідної ДНК, що кодує послідовність мутантної міні BtTyrRS, проводили згідно із [13]. Плазмідні конструкції аналізували методом електрофорезу в 0,7-1 % агарозному гелі.

Вирощування культури E. coli та індукцію експресії рекомбінантної міні BtTирРСу бактеріальній культурі проводили в середовищі Луріа-Бертані (LB) із 30 мкг/мл антибіотика канаміцину.

Трансформовані рекомбінантною плазмідою pET30а-39KYRSW40 компетентні клітини E. coli BL21(DE3) pLysE вирощували на шейкері (Environmental Shaker Incubator ES-20) при 37° С до оптичної густини А₆₀₀ = 0,7 та індукували синтез цільового білка додаванням 1 М ізопропіл-в-D-тіогалакто-піранозида (IPTG) до 1 мМ концентрації з наступною інкубацією при 37о С та 25о С упродовж 4 та 16 год відповідно. Зібрану біомасу зі 100 мл культури ресуспендували у 12 мл буфера для лізису клітин (50 мМ натрій-фосфатний буфер, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 10 мМ імідазол, 5 мМ Я-меркаптоетанол). Лізис проводили за допомогою ультразвукового дезінтегратора УЗ-озвучуванням (шість циклів по 20 с, інтервали 20 с). Лізат освітлювали центрифугуванням при 13000 об/хв упродовж 30 хв при 4° С.

Супернатант наносили на врівноважену буфером для лізису клітин Ni-NTA агарозну колонку об'ємом 1 мл, промивали 10 мл буфера для промивки (50 мМ натрій-фосфатний буфер, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 20 мМ імідазол, 5 мМ Я-меркаптоетанол).

Рекомбінантний білок елюювали 5 мл буфера для елюції (50 мМ натрій-фосфатного буфер, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 200 мМ імідазол, 5 мМ Я-меркаптоетанол).

Фракції, у яких було виявлено білок, об'єднували і діалізували проти 200 мл буфера для діалізу (500 мМ натрій-фосфатний буфер рН 8,0, 150 мМ NaCl) упродовж 20-ти год при +4о С.

Електрофоретичний аналіз експресії рекомбінантного білка та елюату проводили у 12 % поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах буферної системи Леммлі [14] Гелі фарбували барвником Cumassie blue R250.

Концентрацію очищеного мутантного білка міні BtTyrRS визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі BioMate 5, використовуючи коефіцієнт екстинкції 9970M-1cm-1 за довжини хвилі 280 нм. Коефіцієнт оптичного поглинання визначали за даними амінокислотного аналізу за допомогою програми ProtParam.



Рис. 1. Модель просторової структури димера N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази Bos taurus

Спектри флуоресценції реєстрували на спектро- флуориметрі Hitachi M850 (Японія), який був обладнаний термостатованим кюветотримачем. Температуру в кюветі визначали з точністю до +0,20 С. Вимірювання проводили у кварцевій кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5 см. Спектральна ширина щілин для монохроматора збуджуючого світла та реєструючої системи становила 5-10 нм. Довжина хвилі збуджуючого світла дорівнювала 280 нм, інтервал довжини хвиль для спектрів флюоресценції становив 300-400 нм, реєстрацію флуоресценції проводили під кутом 90° до напрямку пучка збуджуючого світла за температури 250 С.

Результати та їх обговорення

У відділі білкової інженерії і біоінформатики Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ було отримано, клоновано та секвеновано повну нуклеотидну послідовність кДНК гену тирозил-тРНК синтетази Bos taurus [15], а також створено експресуючі конструкції pET-30a(+)-59KYRS та pET-30a(+)-39KYRS, які містили, відповідно, вставки кДНК повнорозмірної BtTyrRS (M1-S528) та каталітичного N-кінцевого модуля синтетази (M1-P342).

Вставка кДНК міні BtTyrRS містила також послідовність нуклео- тидів, які кодують міжмодульний лінкер (D343-E359), 10 а.з. С-модуля (P360-D369), 42 N-кінцеві амінокислоти вектора та 12 залишків полілінкера плазміди (Дубровський О. Л., неопубліковані дані).

Експресовані у штамі E. coli BL21 (DE3) рекомбінантні білки зберігали аміноацилюючу здатність, притаманну для нативної аміноацил-тРНК синтетази. Було побудовано комп'ютерну модель структурної організації N-кінцевого каталітичного модуля TyrRS Bos taurus [16]. Цю модель просторової структури гомодимера міні BtTyrRS із виділеними трьома триптофановими залишками в положенні 40, 87 та 283 у її структурі наведено на рис. 1.

Клоновані у плазмідах pET-30a-59KYRS та pET-30a- 39KYRS кДНК повнорозмірної тирозил-т-РНК синтетази BtTyrRS та міні BtTyrRS були використані для отримання кодованих ними рекомбінантних білків у системі E. coli BL21(DE3) pLysE після трансформації плазмід у бактеріальні клітини. Оскільки кінцевий вихід цільового рекомбінантного білка в бактеріальних системах значною мірою залежить від умов культивування, було експериментально визначено оптимальні параметри для експресії BtTyrRS та міні BtTyrRS у E. coli [17-18]. У роботах досліджувався вплив на експресію BtTyrRS і міні BtTyrRS таких основних факторів, як кількість індуктора синтезу білка, що вноситься в культуральне середовище, температура та час культивування культури до та після додавання індуктора.

Було показано, що найбільш високий рівень синтезу рекомбінантної міні BtTyrRS у E. coli досягався при додаванні в культуру індуктора синтезу IPTG у концентрації 1 мМ на 2 годину культивування при досяганні культурою оптичної густини OD600 = 0,7-0,9 та інкубації упродовж 4 год за 37о С.



Рис. 2. Електрофоретичний аналіз експресії нативної та мутантної форм каталітичного модуля тирозинової аміноацил-тРНК синтетази у штамі E. coli BL21(DE3)pLysE

М - Маркерна суміш білків ("Invitrogen'', Mark 12 Unstained Standart)

1 - Клітинний лізат бактеріальної культури трансформованої плазмідою pET-30a(+)-39KYRS штаму BL21(DE3)pLysE до індукції IPTG (контроль)

2 - Клітинний лізат бактеріальної культури трансформованої плазмідою pET-30a(+)-39KYRS штаму BL21(DE3)pLysE після індукції IPTG (контроль)

3 - Клітинний лізат бактеріальної культури трансформованої плазмідою pET30а-39KYRSW40 штаму BL21(DE3)pLysE до індукції IPTG

4 - Клітинний лізат бактеріальної культури трансформованої плазмідою pET30а-39KYRSW40 штаму BL21(DE3)pLysE після індукції IPTG



Ми використали ці умови культивування клітин E. coli штаму BL21(DE3)pLysE, трансформованих плаз- мідою pET30а-39KYRSW40, що кодує синтез мутантного по залишках триптофанів у положенні 87 та 283 каталітичного модуля аміноацил-тРНК синтетази, для отримання мутантної міні BtTyrRS.

Оскільки відомо, що послідовність клонованих генів в експресуючих векторах серії рЕТ із надзвичайно сильним промотором фага Т7 відіграє значну роль як у синтезі рекомбінантних білків, так і в отриманні розчинної фракції новосинтезо- ваних білків, заміна двох кодонів триптофану на кодони аланіну в структурі міні BtTyrRS у нашому випадку могла бути критичною і призвести до зниження синтезу ензиму чи його переходу в нерозчинні тільця включення [19].

Тому ми провели одночасно експресію в E. coli мутантної та нативної форм міні BtTyrRS із плазмід pET-30a(+)-39KYRS і pET30а-39KYRSW40. Як видно з електрофореграми на рис. 2, мутації не вплинули на експресію мутантного білка: кількість синтезованих у бактеріальній культурі після індукції IPTG нативної та мутантної форм каталітичного модуля тирозил-т-РНК синтетази практично однакова.

Аналіз клітинного осаду після освітлювання бактеріальних лізатів у процесі виділення білків показав, що значна кількість як контрольної, так і мутантної форм ензиму все ж знаходяться в цитоплазмі в нерозчинній фракції в тільцях включення приблизно в рівних пропорціях (результати не наведено). Хоча розчинна фракція білка в обох випадках дозволяє отримати достатню кількість рекомбінантних білків для дослідження їх властивостей як біохімічними, так і флуоресцентними методами, було вирішено проаналізувати синтез цільово го білка в культурі E. coli штаму BL21(DE3)pLysE після індукції IPTG за температури інкубації 25° С.

Результати показали в 1,5 рази вищу концентрацію синтезованого білка в розчинній фракції. Після хроматографічної очистки на Ni-NTA агарозі із 100 мл бактеріальної культури було отримано з урахуванням коефіцієнта екстин- ції 27850 M-1 cm'1 до 2,5 мг гомогенного рекомбінантно- го мутантного білка міні SfTyrRS, чистота якого згідно з електрофорезом досягає 95 % (рис. 3).

Рис. 3. Електрофоретичний контроль чистоти мутантного білка 39 K TyrRS після хроматографічної очистки на Ni-NTA агарозі (12-відсотковий розділяючий гель)

1. маркерна суміш (Unstained Protein Molecular Weight Marker #SM0431 Fermentas)

2. мутантна міні-TyrRS (39 kDa)

Флуоресцентні характеристики отриманого білка, зокрема ширина спектра флуоресценції АА біля 55 нм та його максимум, що припадає на 328 нм, показують екранування залишку триптофана 40 W гідрофобним мікрооточенням в активному центрі мутантної форми фермента (рис. 4).



Emission wavelength X, [nm]

Рис. 4. Спектр флуоресценції мутантної форми W87/283A каталітичного модуля тирозил-тРНКсинтетази B. Taurus за довжини хвилі збудження 280 нм

Це свідчить про компактний стан отриманого білка і нативність його структури [20]. За даними сервера ProtParam, молекулярна вага отриманої мутантної міні SfTyrRS дорівнює 47364,36 Да, ізоелектрична точка pI дорівнює 6,42.



Висновки

У результаті проведеної роботи нами показано, що заміна двох кодонів амінокислоти триптофана на кодони амінокислоти аланіна в кДНК каталітичного модуля тирозинової аміноацил-тРНК синтетази, клонованої в експресуючому векторі рЕТ30а- 39KYRSW40, не впливає на синтез та розчинність мутантної форми ферменту в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE.

Кількість розчинної форми рекомбінантної мутантної міні SfTyrRS у цитоплазмі бактеріальних клітин при експресії у штамі E. coli BL21(DE3)pLysE значно підвищується при інкубації бактеріальної культури за температури 25о С порівняно з температурою інкубації 37о С.

Вихід очищеного гомогенного білка мутантної міні SfTyrRS становить у середньому 2,5 мг із 100 мл культурального середовища, що є достатнім для проведення подальших структурно-функціональних досліджень мутантної форми ферменту.



Список використаних джерел

1. Pang Y. L. J. tRNA synthetase: tRNA aminoacylation and beyond / Y. L. J. Pang, K. Poruri, S. A. Martinis // WIREs RNA. - 2014. - Vol. 56, N 4. - P. 461-480.

2. Kornelyuk A. I. Structural and functional investigation of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase // Biopolym. Cell. - 1998. - Vol. 14, N 4. - P. 349-359.

3. Kornelyuk A. I. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase / A. I. Kornelyuk, M. P. Tas, A. Dubrovsky et al. // Biopolymers and Cell. - 1999. - Vol. 15, N 2. - P.168-72.

4. Wakasugi K. Induction of angiogenesis by the fragment of human tyrosyl-tRNA synthetase / K. Wakasugi, B. M. Slike, J. Hood et al. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277, N 23. - P. 20124-20126.

5. Guo M. Essential nontranslational function of tRNA syntetases / M. Guo M., P. Schimmel // Nature Chemical Biology. - 2013. - Vol. 9, N 3. - P.145-153.

6. Корнелюк А. И. Тирозил-тРНК синтетаза из печени быка. Выделение и физико-химические свойства / А. И. Корнелюк, И. В. Курочкин, Г. Х. Мацука // Молекулярная биология. - 1988. - Т. 22, N 1. - C. 176-186.

7. Gnatenko D. V. Isolation and characteristics of functionally active proteolytically modified form of tyrosyl-tRNA synthetase from the bovine liver / D. V. Gnatenko, A. I. Kornelyuk, I. V. Kurochkin et al. // Ukr. Biochem. J. - 1991. - Vol. 63, N 4. - P. 61-67.

8. Demain A. L. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms / A. L. Demain, P. Vaishnav // Biotechnol. Adv. - 2009. - Vol. 27, N 3. - P. 297-306.

9. Sahdev S. Production of active eucariotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies / S. Sahdev, S. K. Khattar, K. S. Saini et al. // Mol. Cell. Biochem. - 2008. - Vol. 307, № 2. - P. 249-264.

10. Rosano G. L. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges / G. L. Rosano, E. A. Cessarelli // Frontiers in Microbiol. - 2014. - Vol. 5. - P. 1-17.

11. Sambrook J. Molecular Cloning:A Laboratory Manual / J. Sambrook, T. Fritsch, T. Manniatis. - 2th ed. - New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

12. Nishsmura A. Rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells / A. Nishsmura, M. Morita, Y. Nishsmura et al. // Nucl. Acids Res. - 1990. - Vol. 18, № 20. - P. 6169.

13. Inoue H. High efficiency transformation of Escherichia coli plasmids / H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama // Gene. - 1990. - Vol. 96. - P. 23-28.

14. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227, № 5259. - P. 680-685.

15. Levanets O. V. PCR amplification, cloning and sequencing of cDNA fragment encoding a nucleotide binding domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase / O. V. Levanets, V. G. Naidenov, M. I. Woodmaska et al. // Biopolym. Cell - 1996. - Vol. 12, № 5. - P. 66-70.

16. Kravchuk O. V. Computational modeling and molecular dynamics simulations of mammalian cytoplasmic tyrosyl-tRNA synthetase and its complexes with substrates / O. V. Kravchuk, O. V. Savytskyi, K. O. Odynets // J. Biomol. Struct. Dynamics. - 2016. - Vol. 35, № 13. - P. 2772-2788.

17. Кондратюк Ю. Оптимізація процесу біосинтезу каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців та його досліження імунохіміч- ними методами / Ю. Кондратюк, М. Бабарик, Л. Сидорик та ін. // Вісн. Київ. ун-ту. Серія Біологія. - 2010. - Т. 56. - С. 33-35.

18. Кондратюк Ю. Ю. Оптимізація бактеріальної експресії тирозил- тРНК синтетази ссавців при культивуванні штаму Escherichia coli BL21(DE3) pLysE / Ю. Ю. Кондратюк, М. А. Бабарик, О. І. Корнелюк // Мікробіологія і біотехнологія. - 2009. - Т. 8. - С. 6-12.

19. Studier F. W. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high level expression of cloned genes / F. W. Studier, B. A. Moffat // J. Mol. Biol. - 1986. - Vol. 189, N 1. - P. 113-30.

20. Reshetnyak Y. K. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discretness of tryptophan classes in proteins / Y. K. Reshetnyak, E. A. Burnstein // Biophysical J. - 2001. - Vol. 81. - P. 1710-1734.



References (Scopus)

1. Pang YLJ, Poruri K, Martinis SA. tRNA synthetase: tRNA aminoacylation and beyond. WIREs RNA. 2014; 5(4): 461-480.

2. Kornelyuk AI. Structural and functional investigation of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase. Biopolym. Cell. 1998; 14(4):349-359.

3. Kornelyuk A.I, Tas M. P., Dubrovsky A., Murray C. J. Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase. Biopolym Cell. 1999; 15(2): 168-72.

4. Wakasugi, Slike BM, Hood J [et al.]. Inducction of angiogenesis by the fragment of human tyrosyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 2002; 277(23): 20124-20126.

5. Guo M., Schimmel P. Essential nontranslational function of tRNA syntetases. Nat Chem Biol. 2013; 9(3): 145-153.

6. Корнелюк А.И., Курочкин И.В., Мацука Г.Х. Тирозил-тРНК синте- таза из печени быка. Выделение и физико-химические свойства. Молекулярная биология. 1988; 22(1):176-186.

7. Gnatenko D.V., Kornelyuk A.I., Kurochkin I.V., Ribkinska T.A., Matsuka GKh, Isolation and characteristics of functionally active proteolytically modified form of tyrosyl-tRNA synthetase from the bovine liver. Ukr Biochem J. 1991; 63(4): 61-67.

8. Demain A.L., Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organism. Biotechnol Adv. 2009; 27(3): 297-306.

9. Sahdev S., Khattar S.K., Saini K.S. Production of active eucariotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem. 2008; 307(2): 249-264.

10. Rosano G.L., Cessarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014; 5:1-17.

11. Sambrook J., Fritsch T., Manniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2th ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

12. Nishimura A., Morita M., Nishimura Y., Sugino Y. Rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucl Acids Res. 1990; 18(20): 6169.

13. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli plasmids. Gene. 1990; 96: 23-28.

14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685.

15. Levanets O.V., Naidenov V.G., Woodmaska M.I., Odynets K.A., Matsuka G.H., Kornelyuk A.I. PCR amplification, cloning and sequencing of cDNA fragment encoding a nucleotide binding domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase. Biopolym Cell. 1996; 12(5):66-70.

16. Kravchuk O.V., Savytskyi O.V., Odynets K.O., Mykuliak V.V., Korneliuk A.I. Computational modeling and molecular dynamics simulations of mammalian cytoplasmic tyrosyl-tRNA synthetase and its complexes with substrates. J Biomol Struct Dynamics. 2016; 35(13): 2772-2788.

17. Кондратюк Ю.Ю., Бабарик М., Сидорик Л., Корнелюк О. Оптимі- зація процесу біосинтезу каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази ссавців та його досліження імунохімічними методами. Вісник Київського нац.. університету імені Тараса Шевченка. Серія Біологія. 2010; 56:33-35.

18. Кондратюк Ю.Ю., Бабарик М.А., Корнелюк О.І. Оптимізація бактер експресії тирозил-тРНК синтетази ссавців при культивуванні штаму Escherichia coli BL21(DE3) pLysE. Мікробіологія і біотехн. 2009; 8:6-12.

19. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high level expression of cloned genes. J Mol Biol. 1986; 189(1):113-30.

20. Reshetnyak Y.K., Burnstein E.A. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discretness of tryptophan classes in proteins. Biophysical J. 2001; 81:1710-1734.



Анотація

Виділення та характеристика мутантного n-кінцевого каталітичного модуля тирозил-трнк синтетази B. taurus із заміною Trp 87 та Trp 283 на аланін. О. Цуварєв, асист. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, Україна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, Україна, Л. Коломієць, в. о. наук. співроб., В. Заєць, канд. біол. наук, І. Блащак, студ., О. Корнелюк, д-р біол. наук Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, Україна

Аміноацил-тРНК синтетаза є одним із основних ферментів білкового синтезу. Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) ссавців складається із двох структурних одиниць, N-кінцевого каталітичного (міні TyrRS) та С-кінцевого цитокіно- подібного модулів. У повнорозмірній TyrRS N-кінцевий модуль здійснює каталітичну функцію зв'язування амінокислоти із тРНК, тоді як С-модуль корегує та стабілізує розміщення тРНК в активному центрі фермента. Після розщеплення тирозил-тРНК синтетази еластазою на міні TyrRS та С-модуль, останні виявляють цитокінові властивості.

Метою роботи була оптимізація експресії клонованої у плазміді pET30а-39KYRS кДНК міні TyrRS Bos taurus, в якій за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу кодони триптофана в положенні 87 та 283 замінені на кодони аланіна, та отримання мутантного однотриптофанового білка міні BtTyrRS для подальшого дослідження за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії конформаційних змін фермента на стадії утворення тирозиладенілату та при взаємодії з акцепторним кінцем тРНКTyr, а також визначення впливу залишків триптофану в положенні 87 та 283 в його структурі на структурно-динамічні й функціональні властивості ензиму. Установлено, що заміна двох кодонів амінокислоти триптофана на кодони амінокислоти аланіна в кДНК міні BtTyrRS, клонованої в експресуючій плазміді pET3Ца- 39KYRSW4Ц, не впливає на синтез і розчинність мутантної форми ферменту в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE. Кількість розчинної форми рекомбінантної мутантної міні BtTyrRS у цитоплазмі бактеріальних клітин при експресії в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE значно підвищується при інкубації бактеріальної культури за температури 25о С порівняно з температурою інкубації при 37 о С. Вихід отриманого очищеного білка мутантної міні BtTyrRS становить у середньому 2,5 мг із 100 мл культурального середовища, що є достатнім для проведення подальших структурно-ункціональних досліджень мутантної форми ферменту. Методом флуоресцентної спектроскопії показано компактну структуру рекомбінантного білка.

Ключові слова: тирозил-тРНК синтетаза, міні TyrRS, бактеріальна експресія.



Аннотация

Выделение и характеристика мутантного n-концевого каталитического модуля тирозил-трнк синтетазы B. taurus с заменой Trp 87 и Trp 283 на аланин. А. Цуварев, асист. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, Украина,

Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина, Л. Коломиец, и. о. научн. сотруд., В. Заец, канд. биол. наук, И. Блащак, студ., А.Корнелюк, д-р биол. Наук, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина

Аминоацил-тРНК синтетаза является одним из основных ферментов белкового синтеза. Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) млекопитающих состоит из двух структурных единиц, N-концевого каталитического (мини TyrRS) и С-концевого цитокиноподобного модулей. В полноразмерной TyrRS N-концевой модуль осуществляет каталитическую функцию связывания аминокислоты с тРНК, тогда как С-модуль корректирует и стабилизирует размещения тРНК в активном центре фермента. После расщепления тирозил- тРНК синтетазы эластазой на мини TyrRS и С-модуль, последние проявляют цитокиновые свойства.

Целью работы была оптимизация экспрессии клонированной в плазмиде pET30a-39KYRS кДНК мини TyrRS Bos taurus, в которой с помощью сайт-направленного мутагенеза кодона триптофана в положении 87 и 283 заменены на кодоны аланина и получение мутантного однотриптофанового белка мини BtTyrRS для дальнейшего исследования с помощью методов флуоресцентной спектроскопии конформационных изменений фермента на стадии образования тирозиладенилата и при взаимодействии с акцепторным концом тРНКTyr, а также определение влияния остатков триптофана в положении 87 и 283 в его структуре на структурно-динамические и функциональные свойства фермента.

Установлено, что замена двух кодонов триптофана на кодоны аланина в кДНК мини TyrRS, клонированной в экспрессирующей плазмиде pET30а-39KYRSW40, не влияет на синтез и растворимость мутантной формы фермента в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysE. Количество растворимой формы рекомбинантной мутантной мини BtTyrRS в цитоплазме бактериальных клеток при экспрессии в штамме E. coli BL21 (DE3) pLysE значительно повышается при инкубации бактериальной культуры при температуре 25о С по сравнению с температурой инкубации при 37о С. Выход полученного очищенного белка мутантной мини BtTyrRS составляет в среднем 2,5 мг с 100 мл культуральной среды, что является достаточным для проведения дальнейших структурно-функциональных исследований мутантной формы фермента. Методом флуоресцентной спектроскопии показана компактная структура рекомбинантного белка.

Ключевые слова: тирозил-тРНК синтетазы, мини TyrRS, бактериальная экспрессия.



Abstract

Isolation and characterization of the mutant n-terminal catalytical module of the B. taurus tyrosyl-trna synthetase with the replacement of Trp 87 and Trp 283 by alanine. O. Tsuvarev, assistant, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, Ukraine, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine, L. Kolomiiets, research assistant., V. Zayets, Ph.D., I. Blaszczak, student., A. Kornelyuk, Dr.Sc. Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, Kyiv, Ukraine

Aminoacyl-tRNA synthetase is one of the major enzymes of protein synthesis. The mammalian tyrosyl-tRNA synthetase consists of two structural units, the N-terminal catalytic (mini TyrRS) and the C-terminal cytokine-like modules. In a full length TyrRS, the N-terminal module carries out the catalytic function of binding the amino acid to tRNA, while the C-module adjusts and stabilizes the placement of tRNA in the active center of the enzyme. After cleavage of tyrosyl-tRNA synthetase with elastase on the mini TyrRS and C-module, the latter exhibit cytokine properties.

The aim of the work was to optimize the expression of cloned cDNA miniTyrRS Bos taurus in plasmid pET30a-39KYRS in which the tryptophan codons at position 87 and 283 are replaced with alanine codons using the site-directed mutagenesis, and to obtain the mutant one-tryptophan protein of the mini BtTyrRS for further study on using methods of fluorescence spectroscopy of conformational changes of the enzyme at the stage of tyrosyladenylate formation and in interaction with the acceptor end of tRNATyr, as well as determination of the effect of tryptophan residus in positions 87 and 283 in its structure on the structurally dynamic and functional properties of the enzyme.

It was found that the replacement of two tryptophan codons into the alanine codons in the cDNA of the mini TyrRS cloned in the expressing plasmid pET30a-39KYRSW40 does not affect the synthesis and solubility of the mutant form of the enzyme in the strain E.coli BL21 (DE3) pLysE. The amount of soluble form of the recombinant mutant mini BtTyrRS in the cytoplasm of bacterial cells, when expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysE strain, is significantly enhanced by incubation of bacterial culture at a temperature 25 ° C compared to a culture incubation at 37 ° C. The yield of the obtained purified protein of the mutant mini BtTyrRS is 2.5 mg per average from 100 ml of culture medium, which is sufficient for further structural and functional studies of the mutant form of the enzyme. The compact structure of the recombinant protein is shown by fluorescence spectroscopy.

Key words: tyrosyl-tRNA synthetase, mini TyrRS, bacterial expression.

Размещено на Allbest.ru

...