Аналіз секрету шкірних залоз часничниці звичайної (Pelobates fuscus) на присутність потенційних ефекторів системи гемостазу

ANALYSIS OF THE COMMON SPADEFOOT TOAD (PELOBATES FUSCUS) SKIN SECRETIONS ON THE PRESENCE OF THE POTENTIAL HEMOSTASIS SYSTEM EFFECTORS

Since nowadays the chemical synthesis of new bioactive compounds is a complicated and expensive procedure, alongside with the increased price for drugs based on synthetic biologically active compounds, scientists lay emphasize on natural sources as a promising raw material for various biologically active substances. Amphibian skin glands secretions are a powerful source of potential pharmacological agents. Currently their antimicrobial, antiviral, cardiotonic and antidiabetic activities have been studied in detail, although almost nothing is known about the effects of the tailless amphibians' skin secretions on the functioning of the hemostasis system. The aim of this study was to analyze the potential effects of the components of skin glands secretions of a representative of Ukrainian batrakhofauna - the Common spadefoot toad (Pelobates fuscus) on some parameters of hemostasis system. In the result of chromatographic separation of general skin secretions, 4 protein fractions were obtained, containing a variety of proteins with molecular masses ranging from 17 to 150 kDa. The components of fraction 1 activated prothrombin and factor X in plasma. Several components of fraction 4 had proteolytic activity and substrate specificity for collagen. The components of fractions 1 and 2 prolonged plasma coagulation time in the APTT. Thus, it was proved the presence of biologically active compounds in the P. fuscus skin secretions, that indicates the prospects for further research to identify the individual components responsible for the manifestation of the shown effects in order to provide clues in understanding the structural and functional characteristics and mechanism of action. Moreover, advances in this area will further increase the use of amphibian skin secretions as a raw material for the development of new original pharmaceutical agents and/or biotechnological products.

Вступ. Сьогодні не існує жодних сумнівів у тому, що лікарські засоби природного походження представляють велику цінність для медицини. При вмілому і грамотному використанні, біологічно активні сполуки, виділені з природної сировини, можуть бути корисними у лікуванні патологічних станів, знайти своє застосування в діагностиці захворювань, а також бути цінним інструментарієм у різних лабораторних дослідженнях.

Отрути земноводних і отриманні з них компоненти міцно увійшли в практичну й експериментальну медицину [1,2]; їх властивості продовжують вивчатися, а область застосування розширюватися. В межах світової наукової спільноти в останні десятиліття у цьому напрямку досягнуті важливі успіхи, зокрема, із шкірних секретів земноводних виділено ряд активних компонентів, що мають кардіотонічні [3], антидіабетичні [4], імуномодулюючі [5], антимікробні [6, 7] та антивірусні [8, 9] активності. Більш того, були виявлені седативні [10] та аналгетичні [11] властивості компонентів секретів. Однак широке використання цих речовин у лікувальній практиці поки ускладнено тим, що механізм їх дії та можливі побічні ефекти залишаються недостатньо вивчені.

Біологічні ефекти компонентів шкірного секрету Часничниці звичайної (Pelobates fuscus (Laurenti, 1768)) вперше зацікавили науковців ще на початку минулого сторіччя. Так, Gessner (1927) у своїх дослідженнях показав, що шкірний секрет даного виду викликав гемоліз у експериментах in vitro та мав летальний ефект на різних представників безхвостих амфібій, включаючи P. fuscus. Пізніше Labler та співавтори [12] повідомили про летальний ефект у мишей при внутрішньоввеному введенні їм отрути P. fuscus. Автори також відзначили зниження летального ефекту секрету при підшкірному введенні та майже повну його відсутність - за умов перорального введення секрету мишам [12]. У експериментах на щурах, при внутрішньошкірному застосуванні отрути P. fuscus, показано геморагічну активність компонентів секрету [12]. Незважаючи на те, що була доведена присутність гемолізинів у секреті P. fuscus [13], більш детальні дослідження показали, що причиною загибелі тварин не був прямий гемолітичний ефект активного компоненту [12]. Отже, проаналізувавши ряд літературних джерел ми відмітили певний інтерес науковців до компонентів отрути P. fuscus, однак, нам не вдалося відшукати науково-обґрунтованої інформації щодо природи та біологічного потенціалу конкретних складових секрету.

Беручи до уваги необхідність якісної та кількісної оцінки біологічно активних речовин, що містяться у таких мало вивчених джерелах природного походження як секрети шкірних залоз земноводних, метою даної роботи було дослідити потенційні ефекти компонентів шкірного секрету P. fuscus на параметри системи гемостазу у експериментах in vitro.

Матеріали та методи. Статевозрілих особин виду P. fuscus (n=15; обох статей) відловлювали біля р. Десна, Чернігівської області, з подальшим утриманням у фаунобоксах віварію КНУ імені Тараса Шевченка. Водні суспензії шкірних секретів отримували шляхом промивання поверхні шкіри невеликою кількістю дистильованої води (близько 5 мл) після інтенсивного механічного подразнення шкірних залоз, розміщених паралельно повздовжньої осі тіла. Отримані суспензії ліофільно висушували (Telstar LyoQuest), сухий матеріал зберігали при 4°C. Ліофілізований секрет, перед використанням розчиняли з розрахунку 100 мг сухого матеріалу на 1 мл 50 мМ Тріс-HCl буфера (рН 7,4), що містив 0,2 М NaCl. З метою відокремлення нерозчинних компонентів суспензію центрифугували при 3000 g протягом 10 хв. Концентрацію білка у супернатанті визначали за методом Бредфорд [14]. Білки секрету фракціонували методом хроматографії, що поділяє за розміром. Як хроматографічний носій використовували Superdex 75 16/60 GL (GE Healthcare Limited, Сполучене Королівство Великої Британії). Фракції збирали по піках за швидкості потоку 1 мл/хв. Білково-пептидний склад отриманих фракцій досліджували методом диск-електрофорезу у 15 % поліакриламідному гелі згідно з описаною методикою [15]. Ензим-електрофорез проводили відповідно до методики [16]. Розділювальний гель полімеризували за присутності желатину, колагену та фібриногену з розрахунку 1 мг відповідного субстратного білка на 1 мл розділяючого гелю. Аналіз одержаних електрофореграм здійснювали з використанням програми TotalLab 2.04. Представлені електрофореграми є типовими для серії повторних дослідів.

Плазму крові отримували згідно зі стандартним протоколом із стабілізованої цитратом венозної крові кроля. Час зсідання плазми крові досліджували у хронометричних тестах: "тромбіновий час" (ТЧ), "протромбіно- вий час" (ПЧ) та "активований частковий тромбопластиновий час" (АЧТЧ) з використанням готових реактивів відповідних комерційних наборів (Ренам, РФ). У кюветі коагулометра змішували 45 мкл плазми крові та 5 мкл загального секрету P. fuscus або 5 мкл зразків фракцій, отриманих у результаті хроматографічного розділення загального секрету. Для визначення ТЧ до суміші вносили 50 мкл розчину тромбіну з активністю 3 МО/мл; для визначення ПЧ - 100 мкл тромбопластин-кальцієвої суміші; для визначення АЧТЧ - 50 мкл АЧТЧ-реагенту з подальшим додаванням 50 мкл розчину 0,025 М СаСь. Час зсідання у секундах фіксували на коагулометричному аналізаторі (Rayto RT-2201C, Китай).

Протеолітичну активність визначали за здатністю гідролізувати амідний зв'язок у складі наступних синтетичних хромогенних субстратів: Phe-Pip-Arg-pNA (S2238, субстрат до тромбіну), Val-Leu-Lys-pNA (S2251, субстрат до плазміну), Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (S2222, субстрат до фактору Ха), pyroGlu-Pro-Arg-pNA (S2366, субстрат до активованого протеїну С). Реакцію проводили у лунках 96-лункового мікропланшету. Кінцевий об'єм інкубаційного середовища становив 250 мкл. У ході дослідження до 0,05 М Тріс-НСІ буфера, рН 7,4, додавали зразок загального секрету P. fuscus або зразок фракцій, отриманих у ході хроматографічного розділення загального секрету, з вмістом загального білка - 20 мкг. Після 5 хв інкубації за 37° С реакцію ініціювали додаванням відповідного специфічного хромогенного субстрату, кінцева концентрація кожного з них становила 0,3 мМ. Контрольний зразок включав ті ж компоненти, але замість відповідних фракцій секрету містив рівний об'єм 50 мМ Тріс-HCl буфера, рН 7,4. Інкубацію проводили за 37° С протягом 90 хв. Оптичну щільність проб визначали через рівні проміжки часу при довжині хвилі 405 нм, використовуючи мікропланшеточний спектрофотометр (|jQuant, BioTek Instruments, США). Активність виражали у нмоль пара-нітроаніліну (п-НА), вивільненого за 1 хв у перерахунку на 1 мг білка.

Для вивчення здатності компонентів секрету P. fuscus активувати певні проферменти системи гемостазу, використовували інкубаційне середовище аналогічного складу як описано вище, куди окрім досліджуваних зразків також вносили 20 мкл плазми крові. Реакцію ініціювали додаванням відповідного хромогенного субстрату з кінцевою концентрацією 0,3 мМ. Контрольний зразок включав ті ж компоненти, але замість досліджуваних зразків секрету містив рівний об'єм 50 мМ Т ріс- HCl буфера, рН 7,4. Визначення кількості вільного п-НА проводили за тотожних умов, описаних вище. При аналізі потенційного ефекту компонентів секрету P. fuscus на проензими плазми обрахунок отриманих результатів проводили наступним чином: значення, що відповідали кількості п-НА, вивільненого з відповідного синтетичного субстрату за умов прямої гідролітичної дії компонентів секрету, віднімали від значень, що відповідали кількості п-НА, який вивільнявся у експерименті з додаванням до інкубаційного середовища плазми. Така маніпуляція дозволила виокремити активність активних ензимів плазми, що потенційно могли утворитися внаслідок дії компонентів секрету на відповідні проензими. Одержані дані було оброблено методом варіаційної статистики. Різниця вважалася достовірною при р<0,05.

Результати та їх обговорення. Питання щодо потенційних терапевтичних властивостей секретів шкіри земноводних останнім часом все частіше стає предметом дискусії на наукових конференціях. Особливо гостро підкреслюється те, що отрути земноводних є комплексним матеріалом, що водночас містить низку біологічно активних речовин, які відрізняються своїми біологічними ефектами на організм. А отже використання цих перспективних агентів з лікувальними цілями, їх подальше впровадження в фармацевтичну промисловість та/або біотехнологічне виробництво вимагає обов'язкового поділу вихідної сировини на окремі компоненти, ідентифікації природи та механізму дії даних компонентів.

З метою фракціонування загального секрету шкірних залоз P. fuscus нами було застосовано метод хроматографії, що поділяє за розміром. Для забезпечення оптимального поділу як хроматографічний носій ми використовували Superdex 75, оскільки даний носій характеризується оптимальною, на нашу думку, хроматографічною зоною для поділу шкірного секрету (від 3 до 70 кДа), високою фізико-хімічною стабільністю та інертністю до утворення неспецифічних взаємодій зі зразком, що аналізується [17]. Як робочий буфер використовували 0,05 M Тріс-HCl, pH 7,4 з вмістом 0,2 M NaCl і вихідною кондуктивністю 29,5 мС; швидкість потоку становила 1 мл/хв. Оптимальний склад буферного розчину та швидкість хроматографування були попередньо підібрані експериментальним шляхом (дані не представлені). Зокрема, у ході хроматографічного розділення загального секрету шкірних залоз P. fuscus було отримано 4 піки, які було використано як об'єкт для подальших досліджень (рис. 1).

Якісний аналіз білкового складу отриманих фракцій із застосуванням методу одновимірного диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі за присутності додецилсульфату натрію показав присутність у досліджуваних зразках широкого спектру білкових молекул, що різняться за молекулярними масами (рис. 2).

Рис. 2. Типова електрофореграма поділу білків секрету шкірних залоз P. fuscus. Цифрами (1-4) позначено номери піків хроматографічного розділення. Треки М1 та М2 - маркери молекулярних мас (кДа)

Подальший аналіз ензим-електрофореграм за допомогою програми TotalLab 2.04 дозволив ідентифікувати білки у діапазоні молекулярних мас від 17 до 150 кДа (табл. 1).

Таблиця 1. Молекулярні маси (ММ) білків у фракціях, отриманих у результаті хроматографічного поділу секрету шкірних залоз P. fuscus