Патоморфологические особенности регенерации конъюнктивы и склеры на фоне интраоперационной аппликации раствора циклоспорина А

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сибирский государственный медицинский университет (СибГМУ)

Национальный исследовательский Томский политехнический университет (НИ ТПУ)

Патоморфологические особенности регенерации конъюнктивы и склеры на фоне интраоперационной аппликации раствора циклоспорина А

Жигальская Т.А., Кривошеина О.И.,

Дзюман А.Н., Хлусов И.А.

г. Томск

РЕЗЮМЕ

Цель работы: в эксперименте in vivo изучить особенности регенерации конъюнктивы и склеры крыс после хирургического вмешательства и интраоперационной аппликации 0,05%-го раствора циклоспорина А.

Материалы и методы. Экспериментальные животные (самцы крыс, n = 48) были разделены на основную группу, включающую подгруппы а (n = 16) и b (n = 16), и группу сравнения (n = 16).

Всем животным выполняли сквозной разрез конъюнктивы и непроникающий надрез поверхностных слоев склеры одного из глаз. На область хирургической травмы в основной группе накладывалась гемостатическая губка, пропитанная 0,05%-м раствором циклоспорина А: в подгруппе а длительностью 3 мин, в подгруппе b - 6 мин. В группе сравнения интраоперационно накладывалась гемостатическая губка без цитостатика.

Результаты. У животных группы сравнения послеоперационный период протекал со стереотипной динамикой смены клеточных фаз в поврежденных тканях. В исходе отмечено развитие плотного конъюнктивально-склерального сращения в зоне хирургической травмы. Интраоперационная аппликация 0,05%-м раствором циклоспорина А приводила к замедлению регенерации, препятствовала формированию грубого конъюнктивально-склерального рубца.

Заключение. Интраоперационные аппликации 0,05%-го раствора циклоспорина А меняют стереотипную динамику течения воспалительно-репаративной регенерации в зоне хирургического вмешательства, подавляя практически в три раза миграцию клеток, и значительно (в два раза) увеличивая продолжительность макрофагальной фазы. Это обусловливает замедление репаративной регенерации, препятствующее избыточному рубцеванию в операционной зоне.

Ключевые слова: глазное яблоко крыс, послеоперационное рубцевание, цитостатическая профилактика избыточной регенерации.

ABSTRACT

конъюктива склера крыса хирургический

Pathomorphological features of conjunctival and scleral regeneration associated with intraoperative application of Cyclosporin A

Zhigalskaya T.A.¹, Krivosheina O.I.¹, Dzyman A.N.¹, Khlusov I.A.^{1, 2}

Siberian State Medical University (SSMU)

National Research Tomsk Polytechnic University (NR TPU)

Purpose. In experiment in vivo to study the features of regeneration of the conjunctiva and sclera of rats after surgery with intraoperative application of a 0.05% Ciclosporin A.

Materials and methods. Experimental animals (rats) (n = 48) were divided into the main group, including the subgroups a (n = 16) and b (n = 16) and the comparison group (n = 16). Performed a through cut of the conjunctiva and damage to the surface layers of the sclera one of the eyes of all animals. Further on the surgical trauma zone in the main group, the intraoperative application of the cytostatic was performed. In the subgroup a with a duration of 3 minutes, in the subgroup b - 6 minutes. In the comparison group a hemostatic sponge without a cytostatic was used intraoperatively.

Results. In the comparison group postoperative period proceeds with a stereotyped dynamics of cell phase changes in damaged tissues. In the end the development of dense conjunctival-scleral fusion in the area of surgical trauma was noted. Intraoperative application of 0.05% Cyclosporine A leads to a slowing of regeneration, preventing formation of rough conjunctival-scleral scar.

Conclusions. Intraoperative applications of 0.05% Cyclosporin A change the stereotyped dynamics of the inflammatory-reparative regeneration in the surgical intervention zone, inhibiting the migration of cells almost in 3 times and significantly (in 2 times) prolonging the duration of the macrophage phase. This causes a slowdown of reparative regeneration, prevents excessive scarring in the operating area.

Key words: rat eye bulb, postoperation scarring, cytostatic prophylaxis of abundant regeneration.

ВВЕДЕНИЕ

Профилактика избыточной регенерации тканей в послеоперационном периоде является одной из актуальных проблем медицины. Для предотвращения грубого рубцевания используются антиметаболические средства, местное применение которых существенно уменьшает выраженность воспалительно-репаративной реакции в зоне оперативного вмешательства и препятствует интенсивному фиброгенезу. В офтальмохирургии, в частности в ходе антиглаукомных операций, применяются аппликации 5-фторурацила и митомицина С на область хирургически созданных путей оттока внутриглазной жидкости [1-6]. Однако широкое использование указанных средств ограничено из-за высокого риска развития осложнений: несостоятельность швов, цилиохориоидальная отслойка, прогрессирование катаракты, гипотония глазного яблока [7, 8]. В связи с вышеизложенным перспективным антипролиферативным средством может быть интраоперационное применение цитостатика нового поколения -- 0,05%-го раствора циклоспорина А.

Цель работы - в эксперименте in vivo изучить особенности регенерации конъюнктивы и склеры крыс после хирургического вмешательства и интраоперационной аппликации 0,05%-го раствора циклоспорина А.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на базе лаборатории биологических моделей СибГМУ (руководитель - канд. биол. наук В.В. Иванов). Эксперимент выполнен на 48 самцах крыс породы вистар (48 глаз) массой 200-250 г. Всем животным в условиях операционной под общей анестезией в верхнем отделе правого глазного яблока выполняли сквозной разрез конъюнктивы склеры и непроникающий надрез поверхностных слоев склеры. В зависимости от хода операции животных разделяли на две группы: основную группу (n = 32) и группу сравнения (n = 16).

Животным основной группы во время операции, после проведения сквозного разреза конъюнктивы и непроникающего надреза поверхностных слоев склеры, на зону вмешательства накладывали гемостатическую губку, пропитанную 0,05%-м раствором циклоспорина А. Животных основной группы разделяли на две подгруппы: подгруппу а (п = 16, длительность аппликации 3 мин) и подгруппу b (п = 16, длительность аппликации 6 мин). Крысам группы сравнения (п =16) на зону вмешательства на 3 мин накладывали гемостатическую губку без раствора циклоспорина А. По окончании аппликации гемостатическую губку у крыс всех групп убирали, закапывали раствор Тобрекса, швы не накладывали. В послеоперационном периоде всем животным в конъюнктивальную полость оперированного глаза закапывали раствор Тобрекса три раза в день. Общая продолжительность эксперимента составила 21 сут. На 3-и, 7-, 14- и 21-е сут после операции из эксперимента выводили по четыре животных из каждой группы с последующей энуклеацией.

Умерщвление экспериментальных животных на всех этапах эксперимента осуществляли с соблюдением правил и норм Европейского общества (86/ 609EEC), Хельсинской декларации и приказов Министерства здравоохранения СССР (№ 742 от 13.11.1984 г. и № 48 от 23.01.1985 г.).

Выведение животных из эксперимента выполняли методом декапитации после проведения общего наркоза. Материал фиксировали с последующей окраской гематоксилином и эозином и по методу Маллори для световой микроскопии, *100, ^х 200. С помощью цифровой фотокамеры Canon Power Shot G10 (Япония) производили съемку 10 случайных полей зрения для каждого среза, с использованием программы ImageJ 1.46 и плагина Cell Counter подсчитывали абсолютное и относительное содержание клеток в конъюнктиве и склере глаз крыс в области операции. Статистический анализ результатов проводили с использованием статистического пакета IBM SPSS Statistics 20. Нормальность распределения показателей проверяли с помощью закона Колмогорова - Смирнова. Результаты представлены в виде M ± т, где M - выборочное среднее, т - ошибка среднего. В связи с несоответствием распределения данных нормальному закону распределения использовали непараметрический {/-критерий Манна - Уитни. Статистически значимыми различия считали при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По данным световой микроскопии, на 3-и сут после операции у крыс подгруппы а основной группы в области вмешательства с аппликацией 0,05%-го раствора циклоспорина А длительностью 3 мин в конъюнктиве выявлялся диффузный отек, в склере - выраженное расслоение коллагеновых волокон. В клеточном составе в зоне вмешательства преобладали мононуклеарные лейкоциты (МНЛ) - 846 ± 14,0 (76%) клеток в поле зрения, численность полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЛ) и фибробластов составляла 38 ±(3,4%) и 229 ± 9,0 (20,6%) соответственно.

У крыс подгруппы b на 3-и сут в области вмешательства с аппликацией раствора цитостатика длительностью 6 мин отмечались выраженное истончение эпителия конъюнктивы, субэпителиальные щелевидные полости, нарушение ориентации и фрагментация коллагеновых волокон в склере. В клеточном составе преобладали МНЛ - 339 ± 7,0 (80,2%) клеток в поле зрения, число ПМЛ и фибробластов составляло 6,0 ± 1,0 (1,4%) и 78 ± 3,0 (18,4%) соответственно.

У крыс группы сравнения эпителий конъюнктивы в зоне операции был уплощен, в склере обнаруживались периваскулярный отек, извитой ход коллагеновых волокон. Среди клеток преобладали МНЛ - 795 ± 23,0 (67,8%) клеток в поле зрения, численность ПМЛ составляла 46 ± 4,0 (3,9%), фибробластов - 332 ± 8,0 (28,3%).

На 7-е сут у животных подгруппы а начиналось постепенное восстановление нормальной архитектоники эпителия конъюнктивы, однако коллагеновые волокна склеры были расслоены. В клеточном составе преобладали МНЛ - 637 ±(57,4%) клеток в поле зрения. Число ПМЛ увеличилось в 2,2 раза, до 82 ± 1,0 (7,4%), р < 0,05; число фибробластов - в 1,7 раза, до 391 ± 15,0 (35,2%) клеток по сравнению с показателями на 3-и сут, р < 0,05.

У крыс подгруппы Ь в области аппликации цитостатика отмечались истончение эпителия конъюнктивы, субэпителиальные мелкие щели. Ориентация и тинкториальные свойства коллагеновых волокон склеры были значительно нарушены. Среди клеток преобладали МНЛ - 442 ± 14,0 (66,1%) клеток в поле зрения. Число ПМЛ увеличилось в 4,5 раза, до 27 ± 7,0 (4,1%), фибробластов - в 2,6 раза, до 199 ± 11,0 (29,8%) клеток по сравнению с уровнем на 3-и сут, р < 0,05. Однако на 7-е сут эти показатели у крыс подгруппы а были меньше в 3,0 и 2,0 раза соответственно, р < 0,05.

У крыс группы сравнения на 7-е сут эпителий конъюнктивы в области операции имел нормальное строение, склера представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью. В клеточном составе уменьшилось количество МНЛ в 1,5 раза, до 530 ± 16,0 (46,1%) клеток в поле зрения по сравнению с 3-ми сут, р < 0,05. Число ПМЛ увеличилось в 2,0 раза, до 91 ± 11,0 (7,9%), фибробластов - в 1,6 раза, до 529 ± 18,0 (46,0%) клеток в поле зрения по сравнению с результатами на 3-и сут, р < 0,05.

На 14-е сут у крыс подгруппы а в области аппликации цитостатика эпителий конъюнктивы имел нормальное строение, коллагеновые волокна склеры располагались рыхло. Среди клеток преобладали фибробласты - 201 ± 13,0 (57,7%) клеток в поле зрения, однако их численность по сравнению с уровнем на 7-е сут уменьшилась в 2,0 раза, р < 0,05. Число МНЛ сократилось в 4,8 раза, до 132 ± 12,0 (38%) клеток, число ПМЛ уменьшилось в 5,5 раза, до 15 ± 9,0 (4,3%) клеток по сравнению с показателями на 7-е сут, р < 0,05.

У крыс подгруппы Ь в области аппликации цитостатика эпителий конъюнктивы имел нормальное строение, однако субэпителиально обнаруживались мелкие щели. Пучки коллагеновых волокон склеры в зоне операции располагались рыхло. В клеточном составе преобладали фибробласты - 120 ± 12,0 (50%) и МНЛ - 106 ± 10,0 (44,2%) клеток в поле зрения, при этом численность клеток данных популяций была меньше, чем у крыс подгруппы а на 14-е сут - в 1,7 и 1,3 раза соответственно, р < 0,05. Количество ПМЛ сократилось в 1,9 раза по сравнению с показателем на 7-е сут - 14 ± 2,0 (5,8%) клеток в поле зрения, р < 0,05.

У крыс группы сравнения на 14-е сут после операции конъюнктива глазного яблока в области вмешательства имела нормальное строение, толстые пучки коллагеновых волокон склеры располагались плотнее. Число фибробластов сократилось в 2,2 раза, до 241 ± 12,0 (51,9%) клеток в поле зрения, что, однако, в 2,0 раза превышало данный показатель у животных подгруппы Ь на 14-е сут, р < 0,05. Численность ПМЛ по сравнению с уровнем на 7-е сут уменьшилась в 1,7 раза, МНЛ - в 4,2 раза, составив 88 ± 3,0 (18,8%) и 136 ± 8,0 (29,3%) клеток соответственно, р < 0,05.

На 21-е сут у животных подгруппы а в области аппликации цитостатика конъюнктива имела нормальное строение и плотно прилежала к склере, однако не была с ней спаяна (рис. 1). Ход коллагеновых волокон склеры в области операции был упорядоченным. Среди клеток преобладали фибробласты - 121 ± 12,0 (68,8%) клеток в поле зрения, их численность по сравнению с уровнем на 14-е сут уменьшилась в 2,0 раза, р < 0,05. Число ПМЛ сократилось в 1,7 раза, до 9 ± 1,0 (5,1%), МНЛ - в 1,5 раза, до 46 ± 8,0 (26,1%) клеток в поле зрения по сравнению с показателями на 14-е сут, р < 0,05.

Рис. 1 Состояние конъюнктивы и склеры глазного яблока в области вмешательства у экспериментального животного подгруппы а основной группы на 21-е сут после операции с 3-минутной аппликацией 0,05%-го раствора циклоспорина А. Окраска гематоксилином и эозином, *200

У крыс подгруппы Ь конъюнктива в области аппликации цитостатика имела нормальное строение, однако субэпителиально сохранялись мелкие щели. При этом конъюнктива была отделена от склеры щелевидным пространством (рис. 2). Пучки коллагеновых волокон склеры в области вмешательства были расслоены. В клеточном составе преобладали фибробласты - 105 ± 11,0 (52,2%) клеток в поле зрения и МНЛ - 84 ± 7,0 (41,8%) клеток. При этом численность фибробластов была в 1,2 раза меньше, чем у крыс подгруппы а на 21-е сут (р < 0,05). Число ПМЛ по сравнению с показателем на 14-е сут сократилось в 1,2 раза, до 12 ± 2,0 (6%) клеток в поле зрения Р < 0,05).

Рис. 2 Щелевидное пространство между конъюнктивой и склерой в области вмешательства у экспериментального животного подгруппы b основной группы на 21-е сут после операции с 6-минутной аппликацией 0,05%-го раствора циклоспорина А. Окраска гематоксилином и эозином, х100

У крыс группы сравнения на 21-е сут после операции конъюнктива глаза в области вмешательства имела нормальное строение, была плотно спаяна с подлежащей склерой (рис. 3). Склера представлена плотной соединительной тканью. Численность фибробластов сократилась в 1,7 раза от уровня на 14-е сут, составив 138 ± 12,0 (78,7%) клеток в поле зрения. Однако это в 1,3 раза превышало таковой показатель у крыс подгруппы b на 21-е сут (р < 0,05). Число ПМЛ сократилось в 6,3 раза по сравнению с уровнем на 14-е сут, МНЛ - в 5,7 раза, составив 14 ± 2,0 (7,9%) и 24 ±(13,4%) клеток соответственно (р < 0,05).

Рис. 3 Конъюнктивально-склеральный рубец в области вмешательства у экспериментального животного группы сравнения на 21-е сут после операции без местной аппликации 0,05%-го раствора циклоспорина А. Окраска гематоксилином и эозином, х 100

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования свидетельствуют о развитии воспалительно-репаративной реакции в конъюнктиве и склере после операции у крыс всех экспериментальных групп. В группе сравнения реакция протекала со стереотипной динамикой смены клеточных фаз, что отражает ее защитно-приспособительный характер. На протяжении всего эксперимента клеточная плотность в зоне операции у крыс группы сравнения была максимальной среди всех экспериментальных групп (табл. 1). На 21-е сут выявлено развитие плотного конъюнктивально-склерального сращения в зоне вмешательства, что свидетельствует о достижении конечной цели воспалительно-репаративной реакции - максимального анатомического восстановления тканей.

Применение 0,05%-го раствора циклоспорина А в виде интраоперационной аппликации оказало значительное влияние на течение послеоперационного периода, зависящее от длительности аппликации. По-видимому, за счет подавления синтеза провоспалительных интерлейкинов [9], цитостатик существенно уменьшил миграцию в зону хирургической травмы клеток, ответственных за интенсивность воспаления. На 3-и сут после операции клеточная плотность в области вмешательства в подгруппе а была в 1,05 раза меньше, чем в группе сравнения, однако в подгруппе b данный показатель был в 2,8 раза меньше (р < 0,05), чем в группе сравнения (таблица). Подобная динамика наблюдалась вплоть до 14-х сут после операции.

Интраоперационная аппликация цитостатика оказала влияние и на смену клеточных фаз воспалительно-репаративной реакции в тканях в зоне вмешательства, увеличив продолжительность макрофагальной фазы и подавив миграцию клеток фибробластической популяции в область хирургической травмы. На 3-и сут после операции плотность фибробластов в подгруппе а была в 1,5 раза меньше (р < 0,05), в подгруппе Ь - в 4,3 раза меньше (р < 0,05), чем в группе сравнения. На 7-е сут количество фибробластов в группе сравнения увеличилось в 1,6 раза. В подгруппах а и Ь сдвиг клеточного состава инфильтрата в сторону фибробластической популяции произошел только на 14-е сут после операции.

Таблица

Динамика клеточной плотности инфильтрата в 1 мм² среза у животных экспериментальных групп, M ± m

Интраоперационная аппликация 0,05%-го раствора цикоспорина А в ходе операции на конъюнктиве и склере глазного яблока крыс в эксперименте in vivo изменяет стереотипную динамику течения воспалительно-репаративной реакции в области вмешательства, подавляя практически в три раза миграцию клеток, и значительно (в два раза) увеличивая продолжительность макрофагальной фазы. Это обусловливает замедление репаративной регенерации, препятствующее избыточному рубцеванию в операционной зоне. Полученные результаты могут быть полезными в клинических ситуациях.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Сахнов С.Н., Науменко В.В., Волик С.А. и др. Способ хирургического лечения рефрактерной глаукомы. Глаукома. 2013; 1: 29-34. [Sakhnov S.N., Naumenko V.V., Volik S.A. et al. The method of surgical treatment of refractory glaucoma. Glaukoma. 2013; 1: 29-34 (in Russ.)].

2. Bettin P., Di Matteo F. Glaucoma: present challenges and future trends. Ophthalmic Res. 2013; 50 (4): 197-208. DOI: 10.1159/000348736.

3. Sengupta S., Venkatesh R., Ravindran R.D. Safety and efficacy of using off-label bevacizumab versus mitomycin C to prevent bleb failure in a single-site phacotrabeculectomy by a randomized controlled clinical trial. J. Glaucoma. 2012; 21 (5): 450-459.

4. Ал Немер Д.М. Результаты комбинированной дренажной хирургии рефрактерных форм глаукомы. Медицинский вестник Башкортостана. 2014; 9 (2): 2830. [Al Nemer D.M. Results of combined drainage surgery of refractory forms of glaucoma. Medicinskij vestnik Bashkortostana. 2014; 9 (2): 28-30 (in Russ.)].

5. Петров С.Ю. Нидлинг как метод активации фильтрационных подушек: показания, особенности техники. Глаукома. 2013; 2: 75-84. [Petrov S.Yu. Nidling as a method of activation of filtration pads: indications, technical features. Glaukoma. 2013; 2: 75-84 (in Russ.)].

6. Lindemann F., Plange N., Kuerten D. et al. Three-year follow-up of trabeculectomy with 5-fluorouracil. Ophthalmic Res. 2017; 58 (2): 74-80. DOI: 10.1159/000464446.

7. Coppens G., Maudgal P. Corneal complications of intraoperative Mitomycin C in glaucoma surgery. Bull. Soc. Belge Ophtalmol. 2010; 314: 19-23.

8. Фабрикантов О.Л., Николашин С.И., Пирогова Е.С. Хирургия рефрактерной глаукомы - показания, осложнения, исходы. Медицина. 2016; 21 (1): 204-207. [Fabrikantov O.L., Nikolashin S.I., Pirogova E.S. Surgery of refractory glaucoma - indications, complications, outcomes. Meditsina. 2016; 21 (1): 204-207 (in Russ.)].

9. Германова В.Н., Волжанин А.В., Золотарев А.В., Карлова Е.В., Перов С.Ю. Циклоспорин А в хирургическом лечении глаукомы: перспективы и возможности. Национальный журнал глаукома. 2017; 16 (2): 92-100. [Germanova V.N., Volzhanin A.V., Zolotarev A.V., Karlova E.V., Perov S.Yu. Cyclosporin A in the surgical treatment of glaucoma: perspectives and opportunities. Natsion- al'nyy zhurnal Glaukoma. 2017; 16 (2): 92-100 (in Russ.)].

Размещено на Allbest.ru