Оцінка чутливості Daphnia magna до дії наноаквацитратів цинку in vivo

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оцінка чутливості Daphnia magna до дії наноаквацитратів цинку in vivo

Ольга Кравченко Віктор Максін

Анотація

Досліджено токсичність цитратованих наночасток цинку, отриманих ерозійно-вибуховою нанотехно- логією, для D. magna методами біотестування. Визначено токсикометричні показники за допомогою пробіт- аналізу. Оцінено можливість використання різних концентрацій препарату на практиці.

Ключові слова: токсичність, наноаквацитрати, Daphnia magna, біотестування, пробіт-аналіз

Кравченко Ольга, Максин Виктор. Оценка чувствительности Daphnia magna к действию наноаква-цитратов цинка in vivo. Проведено исследование токсичности различных концентраций наноаквацитратов цинка для модельного объекта водной токсикологии Daphnia magna методом биотестирования. Определены токсикометрические показатели с помощью пробит-анализa. По результатам 96-часовых опытов медианная концентрация наноаквацитратов цинка составляет 0,067 ± 0,008 мг/дм3. Экспериментально доказано, что диапазон концентраций 0,1-1 мг/дм3 является остро токсичным для дафний и полностью подавляет все жизненно важные функции тест-объекта.

Концентрации в пределах 0,05 мг/дм3 являются потенциально опасными для дафний, поскольку влияют на репродуктивную функцию вследствие гибели яиц и эмбрионов в выводковых камерах самок. Такие нарушения в природных экосистемах неизменно приведут к возрастным и пространственным изменениям структуры популяций.

Установлено, что концентрации наноаквацитратов в пределах 0,01 мг/дм3 являются безопасными для планктонных тест-объектов и могут быть использованы в практических целях.

Ключевые слова: токсичность, наноаквацитраты, Daphnia magna, биотестирование, пробит-анализ.

Kravchenko Olga, Maksin Viktor. Sensitivity Daphnia Magna to Action of zinc Nanoaquacitrates in Vivo.

The research of the toxicity of zinc naTOaquacitrates in various concentrations for modeling test-object of aqua toxicology (Daphnia magna) by bioassay method was conducted. It was identified the toxic metric parameters using probit-analysis According to the results of 96-hour experiments, the median concentration zinc nanoaquacitrates was 0,067 ± 0,008 mg /l. It was experimentally proved that the range of 0,1-1 mg / dm3 of zinc nanoparticle was acutely toxic to Daphnia and completely inhibited all essential functions in the body of the test object. Concentration in the range of 0,05 mg/dm3 was potentially dangerous for daphnia because impact on reproductive function due to loss of eggs and embryos in the brood pouch. These violations invariably led to changes of the age and spatial structure of populations in natural ecosystems. The concentrations of 0,01 mg / dm3 were safe to plankton test-objects that's why can be used for practical purposes.

Key words: toxicity, nanoaquacirtate, Daphnia magna, boiassay, probit-analysis.

Постановка наукової проблеми та її значення. Перше десятиліття XXI ст. характеризується бурхливим розвитком нанотехнологій, спрямованих на одержання нових видів матеріалів, що скла - даються з наночастинок. Проте їх широке практичне впровадження можливе лише за умов усебічного дослідження токсикологічних аспектів впливу наночасток на біоту та навколишнє середовище. Особливо цінну інформацію можна отримати, вивчаючи гідроекосистеми, оскільки саме вони здатні накопичувати полютанти з усієї водозбірної площі та найуразливіші до забруднень [5; 7].

Біотестування як інтегральний метод оцінки токсичності водного середовища - не тільки важливе доповнення до наявної системи хіміко-аналітичного контролю водних об'єктів, а й засіб отримання принципово нової інформації щодо складу та властивостей полютантів [4; 12]. На відміну від фізичних та хімічних підходів до оцінки ризику, біологічне тестування має прогностичне значення - за станом біоти, її кількісними та якісними порушеннями можна передбачати зміни, які очікують на живі організми при такому рівні забруднення [2].

Розповсюдження безхребетних у прісних та солоних водоймах зумовлює використання їх як аналітичних індикаторів якості гідроекосистем. Як тест-об'єкти застосовують циклопів, амфіпод, артемій [10], однак найрозповсюдженішим є Daphnia magna - планктонний ракоподібний з підряду гіллястовусих (Cladocera), який відповідає низці вимог до біотестів: доступність у природі, простота Кравченко О., Максін В., 2015 лабораторного утримування, високий темп розмноження та достатні для візуального спостереження розміри [1]. Дафнії як фільтратори відіграють важливу роль у процесах самоочищення гідроеко- систем і їх трофодинаміці. Встановлено, що молодь D. magna сенситивніша до дії полютантів, тому рекомендовано як біотести використовувати ракоподібних віком 15 - 26 годин [12].

Доведено [6; 8, с. 7] інгібуючу дію металів на репродуктивну функцію особин: зростання пе - ріоду ембріонального розвитку, зменшення чисельності народженої молоді, сповільнення швидкості статевого дозрівання.

Таким чином, мета дослідження - оцінити токсичність різних концентрацій наноаквацитратів цинку для D. magna за показниками виживаності та розмноження, а також обґрунтувати можливість практичного використання препаратів.

Матеріали та методи досліджень. Вплив наноаквацитратів на дафній вивчали за стандартними методиками, затвердженими як національні стандарти України, які в модифікованій формі відпо-відають міжнародним - ISO 6341:1996 і ISO 10706:2000.

Суть методів полягає в реєстрації різниці між виживанням або плодючістю дафній у контролі (культуральне середовище), приготовленому у лабораторних умовах (табл. 1), та в досліджуваних розчинах, приготовлених способом додавання до контролю різних концентрацій наноаквацитратів цинку.

Таблиця 1 Вміст солей у культуральному середовищі

Біотестування проводили на синхронізованій культурі лабораторії біомаркерів та біотестування вод ІКХХВ ім. А. В. Думанського.

Для випробування на дафніях використовували посудини місткістю 100 см3, у які наливали по 80 см3 випробуваного розчину. У кожну ємність поміщали по 10 дафній. Експерименти проводили в трьох повторностях. Для оцінки токсичності розчинів наноаквацитратів за критеріями виживаності та плодючості підтримували оптимальну температуру повітря 20 ± 2 °С, тривалість світлової доби - 16 год. Експоновані проби розчинів не аерували.

Під час оцінки гострої токсичності наноаквацитратів (тривалістю 96 год) облік D. magna про-водили через 1, 6, 24, 48, 72, 96 год; живими вважалися особини, які вільно пересувалися у водній товщі або спливали з дна ємності не пізніше ніж через 15 с після легкого збовтування.

В експериментах обчислювали абсолютно летальну концентрацію (LC100), вітальну, або недіючу, концентрацію (LC0) і медіанну летальну концентрацію (LC50). Медіанну летальну концентрацію розраховували за методом Міллера і Тейнтера, який дає змогу встановити довірчі межі похибок для значень LC50 [3]. Використовували програму MS Excel.

Виклад основного матеріалу й обґрунтування отриманих результатів дослідження. Прове-дено низку дослідів щодо впливу різних концентрацій наноаквацитратів цинку на процеси життє-здатності дафній. Відзначалися показники смертності та морфологічні зміни. Дані щодо виживання рачків у культурному середовищі додаванні сполук цинку протягом 96-годинної експозиції представлено на рисунку 1.

При найбільших концентраціях наноаквацитратів цинку 0,5 -1 мг/дм3 було зафіксовано повну загибель організмів на четверту добу досліду. При експозиції в 0,1 мг/дм3 препарату перший ле-тальний випадок встановлено протягом другої доби проведення експерименту. Наприкінці досліду летальний ефект при вказаних концентраціях досягав майже 80 %, а в особин, які вижили, спосте-рігалися значні морфологічні відхилення - освітлення панцира, зменшення яєць у виводкових камерах. При концентрації сполук у діапазоні 0,025 - 0,05 мг/дм3 відмічено незначне зростання відсотка смертності порівняно з контролем. Тоді як у варіанті з концентрацією 0,05 мг/дм3 зрідка фіксували судомні, невпорядковані рухи антен. У контрольному варіанті та при концентрації 0,01 мг/дм3 летальних випадків морфологічних змін не зафіксовано.

Рис. 1. Вплив різних концентрацій наноаквацитратів цинку при додаванні до культурального середовища на виживання D. magna

Проте ще із середини 1930-х рр. було показано, що залежність «доза-ефект», які виражені в координатах «концентрація (доза) речовини - процент лабораторних тварин, які мали біоефект», не підпорядковується закону нормального розподілення. При такому представленні немає можливості оцінити ефективність речовини та прогнозувати її дію при малій концентрації [9].

Експерти в галузі статистичних методів аналізу розробили спосіб обробки результатів спостере-жень - пробіт-аналіз, який ґрунтується на таких положеннях: на осі абцис - відкладається логарифм дози, на осі ординат замість відсотків уражених тварин - величини ймовірності «пробіти» (англ. probability unties - probites). Конвертація відсотків у пробіти відбувається за допомогою аналітичних функцій і таблиць [3].

На рисунку 2 відображено «пробіт-аналіз» виникнення летальних ефектів у дафнії залежно від концентрацій наноаквацитратів цинку при 96-годинній експозиції. Крім того, подано значення коефі-цієнтів кореляції, які виявилися досить високими.

Рис. 2. Залежність «пробіт ефекту-логарифм концентрації» наноаквацитратів цинку для D. magna

У таблиці 2 наведено значення вітальних, летальних та медіанних концентрацій наноаквацитра-тів цинку, розраховані за методом Міллера і Тейнтера. Наведені вище показники використовуються у порівняльно-токсикологічних експериментах для виявлення механізму дії полютантів та екстра - полювання отриманих даних на природні популяції тест-об'єктів [10]. цитратований наночастка цинк концентрація

Таблиця 2 Показники гострої токсичності наноаквацитратів цинку для молоді D. magna, мг/дм3

Згідно із пробіт-аналізом кривих летальності медіанна концентрація наноаквацитратів цинку за результатами 96-годинних дослідів становить 0,067 ± 0,008 мг/дм3 (діапазон 0,059 - 0,075 мг/дм3).

Концентрацію 0,01 мг/дм3 наноаквацитратів цинку можна віднести до вітальної, оскільки вона не викликала порушень життєдіяльності та морфологічних змін у популяції дафнії.

Репродуктивна функція лежить в основі існування та відтворення дафній. Від неї залежить вікова, статева та просторова структури популяції. Тест щодо пригнічення розмноження дафній є складником комплексу стандартів OECD, присвячених методам випробування хімічних речовин, які складають потенційну небезпеку для довкілля [4; 10].

Зважаючи на перераховані вище факти, наступним етапом досліджень було обрано оцінку дії наноаквацитратів на показники розмноження дафній.

Результати дослідження представлено на рисунку 3.

Рис. 3. Вплив наноаквацитратів цинку на репродукцію D. magna. Умовні позначення: 1 - контроль;

2 - 0,01 мг/дм3; 3 - 0,05 мг/дм3; 4 - 0,1 мг/дм3; 5 - 0,5 мг/дм3; 6 - 1,0 мг/дм3 (р < 0,05)

При експозиції дафній в 0,5 мг/дм3 та 1 мг/дм3 наноаквацитрату цинку 100 % смертність мате-ринських особин наставала упродовж перших 96-ти год проведення експерименту, що унемож-ливило спостереження дії названих вище концентрацій на розмноження дафній.

При концентрації препаратів цинку 0,1 мг/ дм3 кількість молоді становила 4 особини, що майже учетверо менше за показники в контрольній групі.

Особливу увагу привертає вплив концентрації наноаквацитратів цинку 0,05 мг/дм3 на дафній. Незважаючи на те, що летальний ефект перевищував контрольні значення всього на 20 %, середній показник кількості потомства був на рівні 61 % від контролю, тобто знижувався майже на 40 %. Отримані значення дають підстави вважати встановлену концентрацію речовини потенційно не - безпечною для D. magna у природних гідроекосистемах. Через низьку народжуваність можна очіку- вати зміну вікової та просторової структури угруповання, що з часом може призвести до загибелі популяції дафній [Error! Reference source not found.; 8].

При концентрації 0,01 мг/дм3 наноаквацитратів цинку встановлено зниження народжуваності порівняно з контролем на 10 %, що входить в межі статистичної похибки. Порушень у розвитку яєць не було відмічено.

Висновки

Встановлено, що D. magna має високу чутливість до дії наноаквацитратів цинку і може використовуватися як тест-об'єкт для діагностики та оцінки ризику препаратів, отриманих методами нанотехнологій.

Згідно з пробіт-аналізом медіанна концентрація наноаквацитратів цинку за результатами 96-годинних дослідів становить 0,067 ± 0,008 мг/дм3 (діапазон 0,059 - 0,075 мг/дм3).

Експериментально доведено, що діапазон концентрацій наноаквацитратів цинку 0,1-1 мг/дм3 дуже токсичний для гіллястовусих ракоподібних, оскільки повністю пригнічує усі життєво важливі функції тест-об'єкта. Проте концентрації в межах 0,05 мг/дм3 можна віднести до сублетальних, тому що їхня дія призводить до зниження репродуктивної функції дафній внаслідок загибелі яєць та ембріонів у виводкових камерах самок, що з часом може призвести до загибелі популяції дафній. Отримані дані свідчать про неприпустимість застосування названих вище концентрацій поблизу розташування водних об'єктів.

Аналіз результатів дослідження дає підстави стверджувати, що концентрації наноаквацитратів цинку 0,01 мг/дм3 безпечні для планктонних тест-об'єктів і можуть використовуватися на практиці.

Джерела та література

1. Александрова В. В. Применение метода биотестирования в анализе токсичности природных и сточных вод (на примере Нижневартовского района Тюменской области) / В. В. Александрова. - Нижне-вартовск : Изд-во Нижневарт. гос. гуманит. ун-та, 2009. - 92 с.

2. Архипчук В. В. Биотестирование качества воды на клеточном уровне / В. В. Архипчук, В. В. Гончарук // Химия и технология воды. - 2001. - № 5. - С. 531-544.

3. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - 2-е изд. перераб. и доп. - Л. : Медгиз, 1963. --152 с.

4. Брагинский Л. П. Биологические тесты как метод индикации токсичности водной среды / Л. П. Бра-гинский // Проблеми аналитической химии. - М. : Наука, 1977. - Т. 5. - С. 27-38.

5. Гандзюра В. П. Продуктивність біосистем у токсичному середовищі: автореф. дис ... д-ра біол. наук : 03.00.16 / Гандзюра В. П. ; Чернів. нац. ун-т ім. Ю. Федьковича.- Чернівці, 2004.- 36 с.

6. Еколого-морфологічна характеристика роду Daphnia O. F. Muller, 1785 (Crustacea, Cladocera) Україн-ського Розточчя / О. Р. Іванець // Біологічні студії. - 2014. - Т. 8, № 2. - С. 169-186.

7. Злацький І. А. Особливості впливу іонів Cu2+, Pb2+, Ni2+, Cd2+ на продукційні показники окремих гідро-біонтів та їх популяцій : автореф. дис. ... канд. біол. наук : 03.00.16 / Злацький І. А. ; Нац. акад. наук України, Ін-т колоїд. хімії та хімії води ім. А. В. Думанського. - К., 2012. - 19 с.

8. Лесников Л. А. Сравнение различных методик проведения водно-токсикологических экспериментов / Л. А. Лесников // Изв. НИОРХ. - 1976. - С. 3-7.

9. Пробит-метод в оценке эффектов физиологически активных веществ при низких уровнях воздействия / Н. А. Лошадкин, В. Д. Гладких, В. А. Голденков и др. // Рос. хим. журн. - 2002. - Т.46, № 6. - С. 63-67.

10. Черкашин С. А. Биотестирование: терминология, задачи, основне требования и применение в рыбо - хозяйственной токсикологии / С. А. Черкашин // Изв. ТИНРО. 2001. - Т. 128. - С. 1020-1035.

11. Чувствительность Daphnia magna к действию пестицидов биогенного происхождения in vivo / Кула-гина К. В., Коровина Е. В. [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10-1. - С. 99-102.

12. Anderson B. G. The Apparent Thresholds of Toxicity to Daphnia Magna for Chlorides of Various Metals When Added to Lake Erie / Bertil G. Anderson // Water Transactions of the American Fisheries Society. - 1950, Vol. 78, Issue 1 - Р. 96-113.

Размещено на Allbest.ru