Ультраструктура зародківв’юна за впливу новосинтезованих аміднихпохідних 1,4-нафтохінону

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ультраструктура зародків в'юна за впливу новосинтезованих амідних похідних 1,4-нафтохінону

Андрій Безкоровайний

У статті наведено результатидослідженьультраструктуризародківв'юнаМі^итпж/ояяііія Ь. на стадіяхпершого та десятого поділівбластомерів у середовищіінкубації з 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінона та аміднимипохідними (ФО-1 і ФО-2) у концентраціях 10^-5 М та 10^-7 М. Діядосліджуванихсполук у концентрації 10^-5 М призводить до значнихультраструктурнихзмінклітиннихорганел, гіпертрофії гранулярного й агранулярногоендоплазматичногоретикулуму, дезорганізаціїмітохондрій, підвищеннякількостілізосом.

Ключові слова: ультраструктура зародківв'юна, 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінон, амідніпохідні 1,4-нафто- хінону.

В роботе приведены результаты исследования ультраструктуры зародышей вьюна MisgurnusfossilisL.на стадиях первого и десятого делений бластомеров в среде инкубации с 2-хлор-3-гидрокси-1,4-нафтохиноном и амидными производными (2-хлор-3-(3-оксо-3- (пипередин-1-ил)-пропиламино)-1,4-нафтохинон и 2-хлор-3-(3-(морфолин-4-ил)-3-оксопропила- мино)-1,4-нафтохинон ) в концентрациях 10^-5 М и 10^-7 М. Влияние исследуемых соединений в концентрации 10^-5 М ведет к значительным ультраструктурным изменениям клеточных органелл: гипертрофии гранулярного и агранулярного эндоплазматического ретикулума, дезорганизации митохондрий, повышению количества лизосом. Следует отметить, что в отличие от влияния амидных производных ФО-1 и ФО-2, изменения ультраструктуры клеток зародышей при действии 2-хлор-3-гидрокси-1,4-нафтохинона более выраженое влияние, то есть для последнего характерная высокая степень эмбриотоксичности.

Ключевые слова: ультраструктура зародышей вьюна, 2-хлоро-3-гидрокси-1,4-нафтохинон, амидные производные 1,4-нафтохинона.

The research results of the loach embryos Misgurnusfossilis L. ultrastructure on the first and tenth stages of blastomeres division in their incubation environment with 2-chloro-3-hydroxy-1,4-naphthoquinone and amide derivatives (2-chloro-3-(3-oxo-3-(piperidine-1- yl)propylamine)-1,4-naphthoquinone and 2-chloro-3-(3-(morpholine-4-yl)-3-oxopropylamine)-1,4-naphthoquinone) at the concentration of 10-5 M and 10-7 M are presented. The influence of the studied compounds at the concentration of 10-5 M lead to significant changes of the ultrastructure of cell organels as hypertrophy of granular and agranularendoplasmatic reticulum, mitochondria disruption, lysosome increase. It should be noted more pronounced chages in the ultrastructure of the embryo cells under the action of 2-chloro-3-hydroxy-1,4-naphthoquinone compared to effects of amide derivates FO-1 and FO-2; it shows higher degree of embryotoxicity.

Key words: ultrastructure loach embryos, 2-chloro-3-hydroxy-1,4-naphthoquinone, amide derivatives of 1,4-naphthoquinone.

Постановка наукової проблеми та її значення. Нафтохінони - група органічних сполук, що посідає важливе місце серед природних речовин та їхніх синтетичних похідних, котрі володіють широким спектром біологічної активності [9; 12]. У науковій літературі описано вплив амідних похідних 1,4-нафтохінону на ракові клітини різних ліній - КВ (рак ротової порожнини), КСІ-И187 (дрібноклітинний рак легень), МСТ-7 (рак молочної залози) та лінії клітин Уего (епітелій нирки мавпи) [10]. Складними є механізми, за допомогою яких нафтохінони здатні викликати ці ефекти, [9]. Хінони володіють високою відновною активністю: вони можуть брати участь у редоксциклі через їхні семихінонові радикали. Це призводить до формування активних форм оксигену (АФО), уключаючи супероксид, пероксид водню й особливо гідроксильний радикал.

З іншого боку, хінони - акцептори в реакції Міхаеля й клітинні пошкодження можуть відбуватися внаслідок алкілування важливих клітинних білків та / або ДНК [9].

Проведені нами дослідження на зародках та личинках в'юна [1] засвідчили, що амідні похідні:

2- хлоро-3-(3-оксо-3-(піпередин-1-іл)-пропіламіно)-1,4-нафтохінон (далі - ФО-1, Мг=346) і 2-хлоро-3- (3-(морфолін-4-іл)-3-оксопропіламіно)-1,4-нафтохінон (далі ФО-2, Мг= 348) у концентраціях 10^-3-10^-5 М проявляють ембріотоксичну дію, зумовлюючи сповільнення та аномалії розвитку зародків і личинок, що свідчить про здатність досліджуваних похідних нафтохінону проникати через перивітелінову оболонку й плазматичну мембрану бластомерів та, у результаті, призводить до загибелі зародків. У личинок, які вижили, простежено зміни у хвостовому відділі (він був коротшим, порівняно з інтактними личинками) і незначне збільшення розмірів голови. Вони були малорухливими, в окремих із них спостерігали порушення координації рухів та набрякання перикарда. Проте в зародків і личинок в'юна за розвитку в середовищі, що містило ФО-1 та ФО-2 у концентраціях 10^-6 і 10^-7 М, не було відхилень від норми.

Дослідженнями підтверджено [8], що 2-гідрокси-3-хлоро-1,4-нафтохінон (Мг=211) й амідні похідні ФО-1, ФО-2 у концентраціях 10^-3, 10^-5, 10^-7 М сприяють зниженню вмісту вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ТБК-активних продуктів) у зародках в'юна. За їхньої дії зростає активність супероксиддисмутази та каталази, порівняно з контролем.

Мета роботи - вивчити ультраструктуру зародків в'юна за дії похідних 1,4-нафтохінону впродовж раннього ембріогенезу, що дасть змогу виявити їх вплив на компоненти клітин і встановити причинно-наслідкові зв'язки за різних патологічних станів.

Матеріали та методи Об'єкт дослідження - зародки прісноводної костистої риби в'юна Mіsgurnusfossіlіs Ь., які в період раннього ембріогенезу є адекватною тест-системою для вивчення впливу різноманітних фармакологічних і хімічних чинників на живі організми [2; 3; 5]. Коротка тривалість періоду ембріогенезу, легкість отримання статевих продуктів і простота утримання цих риб у лабораторії - основні критерії, що визначають їх використання як об'єкта дослідження.

Під час роботи з в'юнами дотримувалися вимог Європейської конвенції із захисту хребетних тварин, яких використовують з експериментальною й науковою метою (Страсбург, 1986).

Сім'яники отримували декапітацією та розтином черевної порожнини самців. Ікру запліднювали в чашках Петрі суспензією сперміїв за Нейфахом [4]. Через 5-10 хв після запліднення зиготи відмивали й інкубували у фізіологічному розчині Гольтфретера (рН 7,4; ї = 20-22 °С) за присутності 2-хлоро-з-гідрокси-1,4-нафтохінону та амідних похідних 1,4-нафтохінону (ФО-1 і ФО-2) у концентрації 10^-5 та 10^-7 М. Контрольні зародки інкубували в розчині Гольтфретера. нафтохінон ембріогенез патологічний

Ультраструктурні дослідження проводили на стадіях розвитку зародків: 2 бластомери і 1024 бластомери (10 поділ). Обрані стадії ембріогенезу відповідали початку синхронного поділу (2 бластомери,

1 год) та закінченню синхронних поділів (1024 бластомерів, 6 год) зародкових клітин. Досліджувані зародки в'юна фіксували 1,5 % розчином глютарового альдегіду в 0,2 М какодилатному буфері (рН 7,2) при 1=4°С, протягом 1 год. Зразки промивали какодилатним буфером і додатково фіксували

2 % розчином чотирьохокису осмію в тому самому буфері протягом 1 год (і=4°С). Потім їх відмивали від фіксаторів та зневоднювали за допомогою проведення через батарею етилового спирту зростаючоїміцності (50°, 70°, 90° і 100°). Додатково зневоднювали у 2-х змінах окису пропілену й поміщали в епоксидну смолу епон-812 [6]. Зрізи отримували за допомогою ультрамікротома УМИ 1-6, використовуючи алмазний ніж, контрастували 2 % розчином уранілацетату протягом 15 хв і додатково цитратом свинцю за Рейнольдсом[11]. Отримані зрізи переглядали та фотографували за допомогою електронного трансмісійного мікроскопа ПЕМ-100.

Виклад основного матеріалу й обґрунтування отриманих результатів дослідження. Установлено, що на етапі раннього розвитку в'юна (2 бластомери) у клітинах добре помітні мітохондрії правильної й неправильної форми з чіткими зовнішніми та внутрішніми мембранами. Матриксмітохондрій є електронно щільним і містить уключення. Гіалоплазма зародкових клітин у контролі має цистерни агранулярного(аЕПР) та гранулярного ендоплазматичного ретикулуму(гЕПР), скупчення полісом, поодинокі лізосоми, автофаголізосоми й невеликі за розмірами ліпопротеїдні краплі (рис. 1, а). Поруч із мітохондріями трапляються травні вакуолі значних розмірів, які обмежені власною мембраною.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Ультраструктура зародківв 'юна на стадії 2-х бластомерів за умов впливупохідних 1,4-нафтохінона

за концентрації 10-5 М:

а) контроль; б) 2-гідрокси-3-хлоро-1,4-нафтохінон; в) ФО-1; г) ФО-2)

М - мітохондрія; ПС - пероксисома; ТВ - травна вакуоля.

На етапі 2-х бластомерів клітини ще використовують як живильний матеріал жовток материнської клітини, що підтверджується електронограмою, на якій добре помітні жовткові гранули.

Ультраструктура зародків в'юна, які перебували в середовищі з похідними 1,4-нафтохінону в концентрації 10^-5 М протягом першої години розвитку (2 бластомери) характеризувалася зміною електронної щільності гіалоплазми та дезорганізацією органел, порівняно з контролем. Так, плазматична мембрана бластомерів залишалася суцільною (рис. 1). Цитоплазма клітин зародків в'юна на стадії 2-х бластомерів була негомогенною, із підвищеною електронною щільністю гіалоплазми. Органели втрачали свої обриси, що свідчить про часткове руйнування цілісності їхніх мембран. Більшість мітохондрій за умов впливу 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінону та амідних похідних ФО-1 та ФО- 2 у вищезазначеній концентрації змінювали свою форму та перебували в стані набряку, а їхній матрикс заповнений речовиною низької електронної щільності, на відміну від зародків, що розвивалися за нормальних умов. Потрібно відзначити, що в зародкових клітинах виявлено мітохондрії з «розпушеними» кристами, проте цілісною зовнішньою мембраною (рис. 1, б-г). Гіалоплазма містить багато розширених цистерн аЕПР, уміст гЕПР зменшений, порівняно з контролем [7]. У клітині збільшується кількість первинних і вторинних лізосом, наявна значна кількість травних вакуоль, що свідчить про початковий етап лізису клітин.

Рис. 2. Ультраструктура зародківв 'юна на стадії 2-х бластомерів за умов впливупохідних 1,4-нафтохінона за концентрації 10-7М:

Додавання в середовище інкубації 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінону та амідних похідних у концентрації 10^-7 М веде до найменш виражених змін ультраструктури всіх органел бластомерів, порівняно з контролем (рис. 2). Гіалоплазма клітин є неоднорідною, у ній простежено велику кількість

мітохондрій. Частина з них - округлої, частина - купчастої форми, у них добре проглядаються кристи. Потрібно відзначити, що за впливу вихідної сполуки (2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінона) для синтезу амідних похідних (ФО-1 та ФО-2) частина мітохондрій перебувала в стані набрякання та з «розпушеними» кристами. У таких мітохондріях цілісність мембрани не порушена. За впливу досліджуваної сполуки жовткові гранули не зазнавали змін, були невеликих розмірів. У цитоплазмі простежено збільшення кількості розширених цистерн ЕПР, переважно гранулярного. Уміст первинних, вторинних лізосом та травних вакуоль - у межах норми.

У зародках в'юна на етапі 10-го поділу цитоплазма клітин у контролі менш щільна, порівняно зі стадією 2 бластомерів. Наявна велика кількість вільних рибосом і полісом. На цьому етапі розвитку зафіксовано збільшення кількості мітохондрій із паралельно розміщеними кристами(рис. 3). Їхній матриксгомогенний та електроннощільний. Відомо, що протягом дроблення мітохондрії подовжуються, у них з' являється велика кількість пластинчастих крист, які можуть бути розтягнутими та вакуолізованими, виявляючи велику морфологічну мінливість, порівняно з раннім ембріогенезом [7]. Мітохондрії є джерелом АТФ, кругообіг якого в період дроблення дуже високий.

У гіалоплазмі зародків в'юна на етапі розвитку 10-го поділу трапляються вакуолі, які, імовірно, є пероксисомами, у котрих наявний фермент каталаза.

Рис. 3. Ультраструктура зародківв 'юна на стадії 10 поділубластомерів за умов впливупохідних 1,4-нафтохінона за концентраціїIff5М:

а) контроль; б) 2-гідрокси-3-хлоро-1,4-нафтохінон; в) ФО-1; г) ФО-2 (Позначення, як на рис. 1).

За умов розвитку зародків в'юна в середовищі інкубації, що містить досліджувані похідні 1,4-нафто- хінону в концентрації 10^-5 М, на шосту годину розвитку встановлено більш виражені зміни, порівняно з початковим етапом розвитку (рис. 3). Гіалоплазма зародків в'юна, що перебували в середовищі з 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохіноном у концентрації 10^-5 М, була високої електронної щільності.

Внутрішні органели таких клітин набряклі. Гіалоплазма бластомерів зародків в'юна на шостій годині розвитку за нормальних умов - із низькою електронною щільністю, а міжбластомерні простори великі та заповнені речовиною дрібнозернистої консистенції [7]. Плазматична мембрана бластомерів за дії хінонових похідних переважно нечітка, у стані «натягу», що свідчить про набрякання клітини. Міжклітинний простір відсутній. Цитоплазма бластомерів, що прилягає до мембрани клітини, збагачена органелами. Ними насичені й глибокі шари дрібнозернистої гіалоплазми. Як у глибоких, так і в кортикальних шарах цитоплазми виявлено велику кількість набряклих мітохондрій. Більшість таких мітохондрій - із непошкодженою зовнішньою мембраною, проте їхні кристилізовані. Потрібно відзначити, що найменш виражені зміни в ультраструктурі зародків установлено за впливу амідного похідного ФО-1. Також простежено збільшення розмірів вторинних лізосом з електронно-темним умістом. Виявлено збільшення розмірів мультивезикулярних тілець із вакуолями усередині, що може свідчити про процеси руйнування в клітині.

За інкубування в зародків у середовищі з хіноновими похідними в концентрації 10^-7 М на стадії десятого поділу бластомерів ультраструктурні зміни були незначними (рис. 4). Простежено велику кількість мітохондрій, які нерівномірно розміщувалися як у кортикальних, так і в примембранних шарах. Цистерни гЕПР та аЕПР зазнавали незначних змін так само, як і цитоплазма клітин, яка була дещо неоднорідною та дрібнозернистою, порівняно з етапом розвитку двох бластомерів. Такі зміни відповідають нормі на певну годину розвитку.

Рис. 4. Ультраструктура зародківв 'юна на стадії 10 поділубластомерів за умов впливупохідних

1,4-нафтохінону в концентрації 10-7М:

Більш виражені зміни зародкових клітин простежено за наявності в середовищі інкубації 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінону в концентрації 10^-7 М (рис. 4, а). Виявлено дрібнозернисту електронно- щільну гіалоплазму, у якій наявні локальні ділянки з низькою електронною щільністю. Це може бути пов'язано з певними точковими змінами в цитоплазмі за дії препарату. Простежено наявність поодиноких мітохондрій зі зруйнованими кристамита автофаголізосом із рештками лізованих органел усередині. Трапляються цистерни аЕПР і гЕПР, скупчення полісом та рибосом.

Висновки та перспективи подальшого дослідження. На основі наведених результатів можна зробити висновок, що 2-хлоро-3-гідрокси-1,4-нафтохінон проявляє шкідливу дію на зародки, зумовлює деструктивні зміни всіх органел. Амідні похідні ФО-1 і ФО-2 виявляють менш виражений негативний вплив на зародки в'юна на етапі розвитку 2 бластомерів та 1024 бластомерів. Потрібно відзначити, що досліджувані сполуки у вищих концентраціях (10^-5 М) справляють руйнівну дію на структуру клітин зародків, що проявляється в порушенні цілісності мембран, пошкодження мітохондрій, утраті ними крист, підвищеній кількості лізосом. Набрякання структури мітохондрій призводить до дисфункції іонних транспортних систем на внутрішній мембрані, що впливає на архітектуру мембрани й міжмембранний простір. Отже, відбувається зниження синтезу АТФ та утворення вільних радикалів.

Джерела та література