Размещено на http://www.allbest.ru/

Лекция

2 Методы индуцирования гаплоидов

В природе гаплоиды возникают из мужских или женских половых клеток, прошедших через редукционное деление мейоз в результате апогамии, гиногенеза или андрогенеза.

Редуцированная апогамия- возникновение зародыша из синергид или (реже) из антипод.

Гиногенез (женский партеногенез) происходит, когда при опылении спермий, войдя в яйцеклетку, дегенерируют до слияния с ней. В результате стимулированная к делению, но неоплодотворенная яйцеклетка формирует гаплоидный зародыш.

Андрогенез (мужской партеногенез) возникает, когда спермии, попадая в яйцеклетку, вызывает дегенерацию ее ядра. Ядро же спермия начинает делиться вместе с цитоплазмой яйцеклетки, в результате развивается гаплоидный зародыш с отцовским набором хромосом.

С появлением экспериментальной гаплоидии ин витро источником получения гаплоидных тканей стали либо микроспоры, либо клетки зародышевого мешка при культивировании соответственно пыльников или семяпочек на питательных средах.

В настоящее время применяют следующие методы индуцирования гаплоидов:

1) индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы; 2) селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше (метод гаплопродюссера (используется в селекции злаковых); 3) псевдогамия - развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки, или же гиногенез - развитие изолированной семяпочки.

Индуцированный андрогенез. Метод применяется наиболее часто в клеточной инженерии и в селекции растений. Впервые гаплоидные растения были получены индийскими исследователями S. Guha и S. Maheshwari (1964) при культивировании пыльников Datura innoxia. L. Этим методом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур (они преимущественно относятся к семействам пасленовых, злаковых, крестоцветных).

Наибольших успехов в этом достигли селекционеры Китая, где созданы новые высокоурожайные и устойчивые сорта риса и пшеницы, уже занимающие большие посевные площади: рис- 170000 га и пшеница- 70000 га. В нашей стране также созданы тысячи исходных линий риса, табака, картофеля.

Методы, с помощью которых индуцируют деление и регенерацию незрелой пыльцы, можно разделить на 1) методы культуры пыльников, при которых пыльца содержится внутри соматических тканей пыльника, и 2) методы культуры пыльцы, при которых эти соматические ткани удаляются.

Метод культуры in vitro пыльников (культура пыльников).

В основе метода лежит открытый в 1964 г. уникальный феномен андроклинии (в другой терминологии, андрогенез in vitro), состоящий в образовании гаплоидного растения-регенеранта из морфогенетически компетентной клетки пыльника. При этом клетка переключает программу развития с обычного гаметофитного пути, ведущего в естественных условиях к формированию пыльцевого зерна (гаметофита) на принципиально иной - спорофитный - путь развития, ведущий в условиях культуры in vitro к формированию растения (спорофита). Как правило, 0,5-5,0% пыльцевых зерен подвергается андроклинному развитию. У пасленовых эти проценты составляют довольно большое количество растений.

Для культуры пыльников используют целые пыльники, стерильно выделенные из бутонов в определенной фазе развития. В редких случаях культивируют бутоны либо соцветия.

Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу. Для установления необходимой стадии, например, у злаковых, колосья донорных растений срезают в утренние часы и проводят цитологический контроль. Анализируют пыльники из разных ярусов колоса на временных ацетокарминовых препаратах.

Для культивирования пыльников используют агаризованные или жидкие среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества, неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов, ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей, в питательные среды часто добавляют активированный уголь.

Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 0-2-4-6о С на протяжении в течение 2-14 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2о С.

Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников может идти по трем направлениям: 1) индукция соматического эмбриогенеза из культуры изолированных микроспор (культура пыльцы); 2) прямой андрогенез (образование эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов); либо 3) косвенный андрогенез, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды - морфогенный каллус и регенеранты (рис. 2).

Пыльцевой соматический эмбриогенез обусловлен функциональной и структурной детерминацией пыльцевого ядра и клеток гаметофита, поэтому в развитии могут принимать участие: - лишь вегетативные клетки, - лишь генеративные клетки, - оба типа клеток, если вегетативные и генеративные клетки сольются, при этом образуется диплоидный эмбриоид.

Для ряда экономически важных видов растений ведутся поиски оптимальных условий культивирования, питательных сред, индукторов каллусообразования и эмбриогенеза. Изучается генетическая способность к калусообразованию пыльниковых эксплантов, физиологическое состояние донорного растения, стадия развития микроспоры.

Культура пыльников. В настоящее время большое значение приобретает метод получения гаплоидных растений при культивировании пыльников, в которых часть микроспор продуцирует эмбриоиды или каллусную ткань. Из эмбриоидов при определенных условиях культивирования сразу же удается получить проростки с гаплоидным числом хромосом. Это так называемый прямой андрогенез, когда эмбриоиды (и соответственно регеперанты) развиваются непосредственно из микроспор (например, у табака).

В большинстве же случаев формированию регенерантов предшествует фаза каллусогенеза (как это происходит, например, у риса)- косвенный андрогенез. В случае возникновения из микроспор каллусной ткани процесс получения гаплоидов оказывается более сложным, поскольку вначале необходимо индуцировать стеблевой органогенез, что не всегда удается, а затем укоренить образовавшиеся побеги. Кроме того, каллусная ткань, как уже отмечалось выше, не обладает генетической стабильностью и поэтому полученные из нее регенераты не всегда сохраняют ценные признаки исходных растений и нередко оказываются к тому же частично диплоидными. В связи с этим для генетических и селекционных целей первый путь получения гаплоидов следует считать наиболее перспективным, хотя возникновение из микроспор жизнеспособных эмбриоидов- явление сравнительно редкое.

Сам метод получения гаплоидов в культуре пыльников сводится к следующему. Исходные объекты, т.е. пыльники, изолируют в асептических условиях из предварительно простерилизованных бутонов. Их сразу же помещают на питательные среды, состав которых приходится подбирать для каждого объекта эмпирически. Очень важно, чтобы к моменту изоляции пыльников микроспоры в них достигли оптимальной для перехода к эмбриогенезу фазы развития.

В подавляющем большинстве случаев оптимальный срок изолирования пыльников - стадия так называемых средних или поздних микроспор. На этой стадии микроспоры, освободившись из тетрад, вакуолизируются и готовятся к первому митозу. Однако оптимум для разных видов может варьировать от стадии тетрад до двуядерного пыльцевого зерна. Например, у крестоцветных оптимальной является ранняя одноядерная стадия развития пыльцы.

В результате отклонения микроспоры от нормального развития она может перейти к прямому апдрогенезу, при котором гаплоидный зародыш возникает прямо из микроспоры (вегетативной или генеративной клетки) без каллусообразования, или начать формировать каллус.

В первом случае (прямой путь или андрогенез) микроспора делится и образуется 40-50-клеточный проэмбрио. Зародыш в глубулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные стадиям развития нормального зародыша.

При образовании каллусной ткани (непрямой путь) пыльца также делится, но клетки, возникающие в результате деления, быстро увеличиваются в размере и, разрывая оболочки пыльцевого зерна, образуют массу каллуса.

При культивировании пыльников риса, пшеницы, ячменя обычно из микроспор образуется каллус, для табака свойствен андрогенез.

Появление и эмбриоидов, и каллусов из микроспор одного пыльцевого гнезда наблюдается у картофеля, томатов, хлопчатника.

Важную роль в судьбе микроспор играют ткани изолированного пыльника (эндотеции и тапетум).

Характеристика полученных при культивировании пыльников растений зависит от того, возникли ли они путем прямого андрогенеза или при регенерации из каллусных тканей.

При андрогенезе можно ожидать получения истинных гаплоидов. Из каллуса могут быть получены ди-, три-, тетра- и т.д. эуплоиды и анеуплоиды, а также другие генетические изменения, в таком случае образуются растения, называемые гаметоклональными вариантами.

Полиплоидия клеток может достигаться благодаря эндоредупликации хромосом и слиянию ядер, а также в результате формирования микроспор с нередуцированным числом хромосом. Одно из проявлений гаметоклональной изменчивости- появление растений-альбиносов в культуре пыльников злаков. Количество их и соотношение с нормальными зелеными растениями зависят от вида растения, стадии развития пыльцы в момент изолирования пыльников, условий культивирования.

Выход гаплоидов зависит от видовых и сортовых особенностей растений.

Так, очень существенно различаются между собой отдельные виды пшеницы, табака, сорта картофеля. У целого ряда видов до сих пор не удалось найти условии, при которых бы из микроспор формировались жизнеспособные гаплоидные проростки.

Наиболее часто используются следующие условия выращивания растений-доноров: короткий день (8 часов), высокая интенсивность освещения (20000 лк), пониженная температура (12°С).

Возраст растения-донора, положение цветочной почки на растении, время, прошедшее с начала зацветания также влияют на выход гаплоидов.

Рекомендуется изолировать бутоны с растений, находящихся в начале периода цветения.

Имеет значение и состав питательных сред. Так, при культивировании пыльников картофеля положительное влияние на переход микроспор к эмбриогенезу оказывало увеличение содержания сахарозы до 6%.

Для культур пыльников других растений оптимальной оказалась более низкая концентрация сахарозы (2-3%), причем замена сахарозы глюкозой или другими сахарами приводила к гибели пыльцы.

В качестве стимулирующего условия в большинстве работ используют предварительную обработку изолированных пыльников низкой положительной температурой (4-6°C). Время обработки варьируется для разных видов от 2 до 28 суток.

Вероятно, под влиянием холода подавляются процессы нормальной дифференцировки пыльцы, что приводит к увеличению ее эмбриогенного потенциала

Аналогичное действие на эмбриогенез оказывало предварительное центрифугирование бутонов или изолированных пыльников. По-видимому, такое стрессовое воздействие также блокирует нормальный ход спорогенеза пыльника, а это способствует переходу микроспор на путь эмбриогенеза или каллусогенеза. Выход эмбриоидов в культуре пыльцы повышался в тех случаях, когда пыльники культивировали после предварительной холодовой обработки бутонов еще некоторое время на питательной среде, после чего пыльцу изолировали и высевали на питательную среду.

Культуре пыльников присущи два основных недостатка.

Во-первых, растения в таких культурах развиваются не только из пыльцы, но и из различных клеток стенки пыльника, поэтому они могут различаться по уровню плоидности.

Во-вторых, стенка пыльника может продуцировать некоторые вещества, ингибирующие процесс пыльцевого эмбриогенеза. В связи с этим изучалась возможность получения гаплоидов непосредственно из изолированной пыльцы.

Культура пыльцы

Несмотря на теоретическую привлекательность, этот метод применим лишь для отдельных видов (морковь, табак). Однако даже у них конечный выход растений-регенерантов на один пыльник обычно ниже, чем из микроспор, развивающихся внутри пыльника. А у злаков микроспоры невозможно отделить от других тканей пыльника без резкого снижения их жизнеспособности, а значит, выживаемости и развития в культуре.

Культура пыльцы представляет собой культивирование в жидкой среде микроспор, освобожденных от соматических тканей пыльника. Микроспоры начинают делиться, формировать эмбриоиды, которые затем развиваются в гаплоидные растения. (Эмбриоиды - зародышеподобные структуры.)

Разработаны различные методы отделения пыльцы от соматических тканей пыльника:

1 Спонтанное высвобождение (пассивный способ) - пыльники определенным образом обрабатываются (чтобы получить определенную стадию развития пыльцы), инкубируются на жидкой среде, где лопаются, а пыльца высвобождается и всплывает наверх.

2 Гомогенизация и фильтрация. Пыльники, культивируемые в жидкой среде в течение 3-4 дней, разрушают, надрезая скальпелем и осторожно надавливая, затем полученную суспензию фильтруют (поры фильтра 50-100 мкм) и центрифугируют. Удаляют надосадочную жидкость. Осадок с пыльцой промывают и суспендируют выращивают пыльцу в жидкой среде с плотностью 5 х 104 в 1 мл.

3 Метод разрезания - разрезают стенку пыльника, чтобы дать выход каллусам или зародышам, образовавшимся из микроспор. Этот метод применяется редко, так как трудоемок и длителен.

Во втором случае на питательных средах внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен формируются проэмбриональные структуры (40-50-клеточные гаплоидные зародыши), которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям.

В третьем - пыльца делится, но клетки, возникшие в результате делений, быстро увеличиваются в размерах и, разрывая оболочку пыльцевого зерна, образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения. Либо на каллусе сначала формируются эмбриоиды, а затем - растения. При этом растения могут иметь разную степень плоидности - моно-, ди-, поли-, анеуплоидные. Последние часто стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы.

При культивировании пыльцы используются два способа:

1) первый- суспензия пыльцевых зерен помещается на поверхность фильтра, смоченного питательной средой и лежащего на пыльниках, которые играют роль "няньки";

2) второй- суспензию пыльцы наносят на плотную питательную среду с агаром.

Исследования показали, что частота образования эмбриоидов при культивировании изолированной пыльцы значительно меньше, чем при культивировании целых пыльников. Это указывает на большую роль тканей пыльника в индукции перехода микроспор к эмбриогенезу или образованию каллуса.

Факторы, существенно определяющие способность растений к андрогенезу:

- видовая принадлежность растений. Так, некоторые виды семейств Solanaceae и Brassicaceae имеют очень высокую способность к андрогенезу, тогда как у Poaceae она несколько слабее, а у Fabaceae - сильно ограничена (Лутова, 2003).

- существенная разница наблюдается также между отдельными линиями и сортами. Дигаплоиды характеризуются более высокой частотой андрогенеза по сравнению с исходными (донорными) растениями.

- Способность к андрогенезу наследуется при скрещивании.

Для пасленовых характерен только эмбриогенез, для злаковых - образование как каллусов, так и эмбриоидов. Среди гаплоидов много альбиносов (особенно у злаков). Наибольший выход регенерантов-альбиносов в культуре пыльцы, что вызвано, по-видимому, нарушениями развития пыльцы. Причина пока не установлена, возможно, это результат мутаций в микроспорах при культивировании.

Селективная элиминация хромосом (=метод гаплопродюссера, ="Бульбозум"-метод). При отдаленной гибридизации некоторых видов установлено явление селективной элиминации (утраты) хромосом одного из родителей на ранней стадии развития гибридного зародыша. Это явление хорошо изучено у ячменя. При скрещивании диплоидных ячменей Hordeum vulgare (культурный) и H. bulbosum (многолетний луковичный дикий - гаплопродюсер) на стадии роста зародыша и эндосперма (через 5 дней после оплодотворения) происходит выпад хромосом дикого вида. Возникает гаплоид с набором хромосом H. vulgare. Через 15 суток после оплодотворения рост гибридного зародыша на материнском растении прекращается, но при культивировании in vitro из таких зародышей развиваются проростки. Частота и количество образовавшихся растений при этом способе очень высоки. Кроме того, растения-альбиносы не образуются. Метод позволяет получать гаплоиды в большом количестве при комплексной работе группы культуры тканей с селекционными отделами. С помощью этого метода были выведены сорта ячменя Исток и Одесский -115 - за 4 года вместо 10-12 лет обычной селекции. В Канаде так были получены сорта ячменя Минго и Родео.

Элиминация хромосом встречается и у других родов. Например, у кукурузы. Если в качестве опылителя использовать дикий ячмень, то можно индуцировать гаплоиды у ржи и пшеницы.

Этот метод нашел широкое применение в селекционной работе с ячменем, при скрещивании с диким видом Hordeum bulbosum. В первых делениях зиготы, возникшей в результате оплодотворения яйцеклетки Hordeum vulgare пыльцой Hordeum bulbosum вследствие генетической несовместимости происходит элиминация отцовских хромосом и начинает развиваться гаплоидный зародыш. Предполагают, что в геноме H. bulbosum отсутствуют механизмы присоединении хромосом к нитям митотического веретена. Однако часто нормальное развитие зародыша на материнском растении тормозится, его приходится изолировать и выращивать на питательной среде в культуре ин внтро. Затем гаплоидные проростки обрабатывают колхицином для удвоения числа хромосом и получения гомозиготных изогенных линий. Этим методом в Канаде созданы сорта ячменя Минго и Родео. Во Всесоюзном селекционно-генетическом институте на основе гаплоидной селекции и метода гаплопродюсера созданы за короткий срок (за 4-5 лет вместо 8-10) сорта ячменя Исток и Одесский 5, отличающиеся высокой продуктивностью и повышенной устойчивостью к полеганию, засухе, пыльной и твердой головне. В НПО "Элита Поволжья" этим методом создано более 700 засухоустойчивых линий ячменя, в НИИСХ Юго-Востока- многочисленные линии яровой пшеницы и ячменя, в НИИКХ линии картофеля, используемые в селекционном процессе, во ВНИИСХБ- перспективные андрогенетические линии пшеницы.

Псевдогамия. Работы по получению гаплоидов в культуре женского гаметофита начались в 50-е годы 20 века. В последнее время интерес к ним возрос. У растений с мужской стерильностью (например, у кукурузы) культивирование неоплодотворенных семяпочек является единственной возможностью получения гаплоидов. Женский гаметофит может быть источником получения гаплоидов и у растений с низким морфогенетическим потенциалом каллусной ткани, либо если каллусная ткань регенерирует растения-альбиносы. У некоторых растений, например, у ячменя и риса, индукция зеленых растений намного выше при гиногенезе по сравнению с андрогенезом.

В зависимости от того, какая клетка зародыша даст начало новому организму, различают партеногенез и апогамию. Партеногенез - развитие яйцеклетки без оплодотворения. При апогамии зародыш развивается из синергид(ы) или антипод(ы).

Гиногенез (женский партеногенез, развитие изолированной семяпочки) - происходит, когда при опылении спермий, войдя в яйцеклетку, дегенерирует до слиянии с ней. В результате стимулированная к делению, но неоплодотворенная яйцеклетка формирует гаплоидный зародыш.

Гиногенез может идти двумя путями - через эмбриогенез и через каллусогенез. Таким способом получены гаплоиды у гингко, ячменя, риса, табака и др. культур.

В ранних работах наблюдалась пролиферация соматических тканей зародышевого мешка. Впервые гаплоидный каллус из неоплодотворенной семяпочки был получен в 1964 году Тулеком в культуре гингко, но органогенез индуцировать не удалось. Это случилось лишь в 1976 году, когда Сан Ноум при работе с культурой неоплодотворенных завязей ячменя получил нормальные зеленые гаплоидные растения.

В работах Сан Наума с ячменем было показано, что гаплоидные эмбриоиды преимущественно образовывались из антипод, а каллус - из синергид. У риса и эмбиогенез, и каллусогенез давали синергиды, а антиподы в итоге дегенерировали. У табака гаплоидный эмбриогенез характерен для яйцеклеток, у скерды - для антипод.

Возникновение гаплоидов в процессе псевдогамии

При некоторых комбинациях межвидовой гибридизации зародыш и семя развиваются без оплодотворения женской гаметы. Псевдогамия может также иметь место при опылении облученной пыльцой того же вида или при скрещивании видов с разным уровнем плоидности.

Скрещивания, приводящие к гипогепезу- развитию гаплоидного зародыша из неоплодотворенной яйцеклетки- после несовместимого опыления, использовались для картофеля, люцерны, пшеницы.

Исследование процессов, происходящих при культивировании неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы, показало, что гиногенетические зародыши развиваются в данном случае либо из яйцеклетки, либо из антипод. Синергиды обычно разрушаются. Частота образования гаплоидов- 2 растения на 1000 культивируемых семяпочек. Гомозиготные дигаплоидные растения были получены при обработке колхицином и изучены в полевых условиях.

Размещено на Allbest.ru