Содержание супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в проростках гороха под влиянием температуры и инокуляции клубеньковыми бактериями

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Статья по теме:

Содержание супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в проростках гороха под влиянием температуры и инокуляции клубеньковыми бактериями

Г.Г. Васильева, А.К. Глянько, Н.В. Миронова

Изучали влияние низкой положительной температуры на содержание супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в проростках гороха при инокуляции клубеньковыми бактериями (Rhizobium leguminosarum bv. viceae). Оценивали активность цитохром-с-редуктазы и супероксиддисмутазы в корнях и эпикотилях проростков в зависимости от продолжительности воздействия температуры и инокуляции.

Рациональное использование симбиотической азотфиксации позволяет повышать плодородие почвы и получать высокие стабильные урожаи сельскохозяйственных культур, не загрязняя почву, как при использовании минеральных удобрений, так как биологический азот наиболее полно усваивается растениями и способствует повышению качества продукции. Однако формирование и функционирование бобово-ризобиального симбиоза зависит от многих факторов внешней среды (особенно от температуры), которые могут оказывать большее влияние, чем генотипы обоих партнеров (1-3). Низкая положительная температура оказывает негативное влияние как на активность клубеньковых бактерий, так и на растения-хозяева, что отражается на продуктивности последних, несмотря на то, что отдельные бобовые культуры, в том числе и горох, характеризуются высокой холодоустойчивостью (4).

Особенно чувствительны к неблагоприятной температуре стадии инфицирования и ранней нодуляции (5). В условиях низкой температуры в инокулированном растении происходит пролонгирование инфекционного процесса и нодуляции (1, 6, 7). Показано, что при низкой температуре проникновение ризобий в корневой волосок задерживается в большей степени, чем образование клубеньков и ассимиляция азота (1, 5, 6).

Одной из ранних и неспецифических реакций на различные стрессовые воздействия, в том числе и гипотермию, является повышение содержания активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион-радикал (О2.-) и перекись водорода (Н2О2), которые участвуют в запуске холодового повреждения, особенно у неустойчивых к этому фактору растений (8, 9). Однако при низком содержании АФК устойчивость растений можно повысить посредством активации функциональной активности антиоксидантной системы, что свидетельствует об участии этих соединений в закаливании. Не исключено, что задержка инфицирования корней ризобиями при низкой положительной температуре также может быть связана с АФК. В настоящее время влияние низкой положительной температуры на содержание АФК и состояние антиоксидантной системы на начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза остается малоизученным.

В задачу нашей работы входила оценка содержания О2.- и активности супероксиддисмутазы (СОД) в проростках гороха сорта Марат после инокуляции клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae при низкой положительной (8 оС) и оптимальной (22 оС) температуре с целью выявления возможных механизмов отрицательного влияния температурного фактора на формирование бобово-ризобиального симбиоза.

Методика. Объектом исследования служили проростки гороха сорта Марат (селекция Тулунской государственной селекционной станции). Семена проращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге в термостате при температуре 22 оС. Затем проростки помещали в специальные камеры в вертикальном положении, чтобы исключить попадание инокулята на эпикотили. Корни 2-суточных проростков инокулировали суспензией клеток эффективного производственного штамма Rhizobium leguminosarum bv. viceae CIAM 1026* в концентрации 2108 кл/мл (объем суспензии -- 1 мл на один корень). После инокуляции одну часть проростков продолжали выращивать при тех же условиях в течение 2 сут, а другую -- выдерживали в термостате при низкой положительной температуре (8 оС) в течение 7 сут. Контролем служили неинокулированные проростки.

Мы оценивали цитохром-с-редуктазную активность в корнях и эпикотилях проростков, так как определение содержания радикалов О2.- основано на их способности восстанавливать окисленный цитохром с (10). Для этого по 10 проростков из каждого варианта промывали проточной, а затем дистиллированной водой, слегка обсушивали фильтровальной бумагой, отделяли от них корни и эпикотили, срезы которых длиной 1,0-1,5 мм помещали в микрокюветы (объем 3 мл) с калий-фосфатным буфером (0,01 М, рН 7,8), содержащим 210-5 М цитохрома с («Aldrich», США), 0,01 М азида натрия (NaN3), 10-7 М ЭДТА, 0,05 М NaCl. Для оценки окислительно-восстановительной реакции через 1 ч после инкубации в диффузате (2 мл) регистрировали оптическую плотность ( = 550 нм) на двухлучевом спектрофотометре «Spekord» (фирма «Carl Zeiss», Германия).

На основании разности коэффициента экстинкции между окисленной и восстановленной формами цитохрома с (E550 = 2,21104 М-1см-1) рассчитывали цитохром-с-редуктазную активность корней и эпикотилей (мкмoль/ч восстановленного цитохрома с на 1 г сырой массы). Влияние СОД («ICN», США) на восстановление цитохрома с в корнях проростков оценивали при добавлении последней в дозе 100 мкг/мл к реакционной смеси, в которую не вводили NaN3. При определении активности СОД использовали метод, основанный на ингибировании реакции окисления гидроксиламинхлорида, идущей в присутствии генераторов О2.- с образованием нитрита (система ксантин--ксантиноксидаза) (11). Для этого растительный материал растирали в фарфоровых ступках в натрий-фосфатном буфере (0,065 М, рН 7,8), гомогенат центрифугировали в течение 30 мин при 20000 g, а затем проводили диализ супернатанта против буфера в течение 21 ч при температуре 2-4 оС для освобождения от низкомолекулярных антиоксидантов.

Для определения содержания общего белка в диализованном супернатанте применяли амидо-черный краситель (12). В реакционную смесь общим объемом 2 мл входили следующие ингредиенты: дистиллированная вода (0,5 мл); фосфатный буфер (1 мл, 6,510-5 М, рН 7,8); ксантиноксидаза («Sigma», США) (0,3 мл суспензии фермента, содержащей 60 мкг белка); раствор ксантина («ICN», США) (0,1 мл, 1,510-6 М)

и водный раствор гидроксиламинхлорида (0,1 мл, 10-6 М). Реакцию инициировали добавлением ксантиноксидазы и проводили на водяной бане при температуре 25 оС в течение 20 мин. Для определения содержания нитрита в реакционной среде как продукта окисления гидроксиламинхлорида к 0,5 мл вышеуказанной реакционной смеси добавляли 0,5 мл сульфаниловой кислоты и 0,5 мл раствора -нафтиламина («Serva», Германия). Полученную смесь встряхивали и оставляли при комнатной температуре для окрашивания. Оптическую плотность регистрировали через 20 мин на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) при = 530 нм.

Известно, что при добавлении в реакционную смесь вместо воды диализованного экстракта растительной пробы происходит ингибирование окисления гидроксиламинхлорида и образования нитрита, что свидетельствует о присутствии СОД. Поэтому активность СОД мы рассчитывали по калибровочной кривой на основе определения степени ингибирования этой реакции при использовании различных концентраций СОД. Активность СОД выражали в единицах активности (Е) на 1 мг белка (1 Е соответствовала 2 мкг белка, при этом полностью ингибировалось образование нитрита из гидроксиламинхлорида).

По данным трех независимых экспериментов рассчитывали средние арифметические при числе степеней свободы (), равном 4; биологическая повторность опытов -- 3-кратная. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты. При низкой положительной температуре (8 оС) цитохром-с-редуктазная активность в корнях неинокулированных проростков через 1 и 2 сут была соответственно в 2,1 и 1,8 раза, а в эпикотилях -- на 21 % (Р 0,95) и в 2,4 раза выше, чем при оптимальной температуре (табл. 1). Через 1 сут после инокуляции при 8 оС активность фермента в обоих органах снижалась по отношению к неинокулированным проросткам, однако в корнях была на 71 % выше (Р > 0,95), а в эпикотилях на 12 % (Р 0,95) ниже, чем в контроле. Через 2 сут в обоих органах этот показатель резко повышался по сравнению с контролем: в 2,7 и 4,8 раза -- соответственно корень и эпикотиль; однако по сравнению с первыми сутками активность фермента в корнях изменялась незначительно.

Через 1 сут после инокуляции при 22 оС активность цитохром-с-редуктазы в корнях и эпикотилях возрастала соответственно на 21 и 36 % (Р 0,95); через 2 сут -- снижалась в корнях на 23 % (Р = 0,95) и повышалась в эпикотилях на 66 % (Р > 0,95) по сравнению с контролем (см. табл. 1).

Известно, что содержание О2.- во многом зависит от активности СОД, осуществляющей дисмутацию радикала до Н2О2 и О2. Активность СОД в проростках гороха мы определяли при тех же условиях, что и радикала О2.-. При низкой положительной температуре активность СОД через 1 сут как в корнях, так и в эпикотилях незначительно снижалась (Р 0,95), через 2 сут -- возрастала на 37 (корень) и 27 % (эпикотиль) (Р > 0,99) (см. табл. 1).

Активность СОД в корнях и эпикотилях через 1 сут после инокуляции при 8 оС увеличивалась соответственно на 56 % (Р > 0,95) и в 2,9 раза, а через 2 сут -- соответственно в 2,8 и 3,6 раза (по сравнению с первыми сутками и контролем). Активность СОД при 22 оС через 1 и 2 сут после инокуляции снижалась как в корнях -- соответственно на 52 и 40 % (Р > 0,99), так и эпикотилях -- на 23 и 8 % (Р 0,95).

1. Активность цитохром-с-редуктазы и супероксиддисмутазы в проростках гороха сорта Марат под влиянием низкой положительной температуры (8 оС) и инокуляции клубеньковыми бактериями

супероксиддисмутаз проросток горох инокуляция

2. Активность цитохром-с-редуктазы и супероксиддисмутазы в проростках гороха сорта Марат под влиянием низкой положительной температуры (8 оС) и инокуляции клубеньковыми бактериями

После выдерживания проростков при температуре 8 оС (контроль, без инокуляции) в течение 2 сут цитохром-с-редуктазная активность в корнях снижалась почти в 2 раза (по сравнению с первыми сутками), достигала минимума через 4 сут, после чего несколько возрастала (табл. 2). В эпикотилях максимальная и минимальная активность фермента наблюдалась соответственно через 3 и 5 сут, а к окончанию опыта была ниже, чем в первые сутки. Активность СОД в корнях проростков гороха через 2 сут была максимальной, затем постепенно снижалась и к концу опыта была ниже, чем в первые сутки; в эпикотилях -- увеличивалась в 2 раза (по сравнению с первыми сутками) и оставалась примерно на этом уровне в течение 5 сут, а затем снижалась до исходной величины. Через 1 сут после инокуляции цитохром-с-редуктазная активность в обоих органах снижалась по сравнению с соответствующим контролем (показатели недостоверны). Через 7 сут активность фермента снижалась в корнях и эпикотилях соответственно на 38 и 39 % (Р > 0,95). Во всех остальных случаях активность цитохром-с-редуктазы в обоих органах была выше, чем в контроле. Активность СОД в корне и эпикотиле проростков гороха при инокуляции и продолжительном воздействии низкой температуры значительно увеличивалась в первые 2 сут -- соответственно на 81 % и в 3,7 раза (в первые сутки) и в 2,1 и 2,9 раза (через 2 сут); в последующие сутки отмечено снижение активности фермента до таковой в контроле и ниже.

Накопление О2.- в проростках гороха под воздействием низкой положительной температуры подтверждает тот факт, что увеличение содержания АФК является одной из ранних и неспецифических реакций на различные стрессовые факторы. По-видимому, повышение содержания О2.- через 1 сут выдерживания проростков при температуре 8 оС объясняется усилением генерации радикала, а не снижением активности СОД (см. табл. 1). В связи с этим необходимо отметить, что одним из основных источников АФК при действии низкой температуры служат митохондрии. Поскольку скорость синтетических реакций при охлаждении снижается, может уменьшаться потребность клеток в АТФ. При этом в митохондриях накапливается избыток электронов, что приводит к восстановлению молекулярного кислорода с образованием О2.- (13). Повышение активности СОД через 2 сут выдерживания проростков при низкой температуре, по-видимому, объясняется возрастанием содержания О2.- в обоих органах.

Снижение количества О2.- в проростках гороха через 1 сут после инокуляции при 8 оС (по сравнению с неинокулированными при этих же условиях), вероятно, обусловлено тем, что клубеньковые бактерии способствовали повышению активности СОД растения-хозяина (см. табл. 1). При этом содержание О2.- в корнях хотя и снижалось по сравнению с неинокулированными проростками, однако было выше, чем в соответствующем контроле при оптимальной температуре. Возможно, это один из механизмов, ограничивающих проникновение ризобий в корни при низкой положительной температуре.

Резкое повышение содержания О2.- в обоих органах проростков через 2 сут, возможно, объясняется противодействием растения-хозяина проникновению ризобий с целью ограничить процессы инфицирования и клубенькообразования при неблагоприятных условиях. Показано, что элиситоры патогенов индуцируют образование радикала О2.- в плазмалемме клеток растения-хозяина (14). Для симбиотической системы этот вопрос остается открытым. Принимая во внимание тот факт, что начальные этапы фитопатогенеза и симбиоза имеют много общего, можно предположить, что Nod-фактор ризобий при неблагоприятных температурных условиях также вызывает активацию НАДФН-оксидазного ферментного комплекса плазмалеммы клеток растения-хозяина с образованием радикала О2.- (15). Однако для доказательства этого предположения необходимо проанализировать активность этого ферментного комплекса в симбиотической системе.

Небольшое увеличение содержания О2.- в корнях проростков гороха через 1 сут после инокуляции клубеньковыми бактериями при оптимальной температуре, вероятно, свидетельствует о реакции растения на проникновение ризобий. В литературе имеются сведения о локальном повышении АФК в матриксе инфекционной нити при совместимом бобово-ризобиальном симбиозе (16). Предполагается, что повышение содержания АФК индуцируется ризобиальным Nod-фактором и является необходимым условием для экспрессии генов нодуляции (17).

Возможно, что снижение количества О2.- (относительно контроля) в корнях через 2 сут после инокуляции при оптимальной температуре способствует проникновению ризобий. Cнижение активности СОД в корнях через 1 и 2 сут после инокуляции, вероятно, отражает уменьшение содержания радикала О2.-; повышение содержания последнего в эпикотилях можно объяснить усилением генерации, так как активность СОД при этом снижалась незначительно (см. табл. 1).

Реакция растения-хозяина на инокуляцию при продолжительном воздействии низкой температуры, возможно, обусловлена адапта-ционными процессами. Так, снижение цитохром-с-редуктазной активности в корне через 1 сут после инокуляции при 8 оС, вероятно, связано с тем, что вначале пониженная температура не мешает проникновению ризобий в растение-хозяин, но при длительном воздействии увеличение содержания О2.- ограничивает инфицирование корня и исключает инокуляцию эпикотиля.

Следует отметить, что на протяжении всего периода исследований содержание О2.- в эпикотилях было значительно выше, чем в корнях (активность СОД всегда ниже), что обусловлено, с одной стороны, более медленной дисмутацией, а с другой, вероятно, более высокой генерацией радикалов О2.- в этом органе.

Таким образом, содержание супероксидного радикала кислорода и активность супероксиддисмутазы в проростках гороха сорта Марат зависят от температуры, при которой проходит инокуляция клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae, органа проростка и продолжительности действия как абиотического (низкая положительная температура), так и биотического (клубеньковые бактерии) факторов. По-видимому, супероксидный анион-радикал и супероксиддисмутаза могут принимать участие в регуляции инфекционного и нодуляционного процессов как при оптимальной, так и при низкой положительной температуре, причем содержание О2.- определяется не только активностью супероксиддисмутазы, но, возможно, и механизмами его генерации.

Литература

1. Воробьев В.А. Симбиотическая азотфиксация и температура. Новосибирск, 1998.

2. Макарова Л.Е., Екимова Е.Г., Латышева С.Е. и др. Влияние инокуляции Rhizobium leguminosarum и температуры на содержание в корнях проростков Pisum sativum L. фенольных соединений с антиоксидантными свойствами. Растительные ресурсы, 2001, 37, 1: 88-95.

3. Фесенко А.Н., Орлова И.Ф., Проворов Н.А. и др. Изучение симбиотических свойств клубеньковых бактерий гороха в вегетационных опытах. Докл. РАСХН, 1995, 3: 24-26.

4. Macduff J.H., Dhanoa M.S. N2 fixation and nitrate uptake by white clover swards in response to root temperature in flowing solution culture. Ann. Bot., 1990, 65, 3: 325-335.

5. Lynch D.H., Smith D.L. Soybean (Glycine max (L.) Merr.) nodulation and N2 fixation as affected by period of exposure to a low root zone temperature. Physiol. Plantarum, 1993, 88: 212-220.

6. Zhang F., Smith D. Effects of low root zone temperatures on the early stages of symbiosis establishment between soybean (Glycine max (L.) Merr.) and Bradyrhizobium japonicum. J. Exp. Bot., 1994, 45, 279: 1467-1473.

7. Соколова М.Г. Физиологические особенности начальных этапов инфицирования корней гороха Rhizobium leguminosarum при разных температурах. Автореф. канд. дис. Иркутск, 2001.

8. Зыкова В.В., Колесниченко А.В., Войников В.К. Участие активных форм кислорода в реакции митохондрий растений на низкотемпературный стресс. Физиол. раст., 2002, 49, 2: 302-310.

9. Лукаткин А.С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. Физиол. раст., 2002, 49, 5: 697-702.

10. Doke N., Ohashi Y. Involvement of an O2- generating system in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with mosaic virus. Physiol. Mol. Plant Pathol., 1988, 32, 1: 163-175.

11. Elstner E.F., Heupe l A. Inhibition on nitrite formation from hydroxylammonium-chloride: simple assay for superoxide dismutase. Anal. Biochem., 1976, 706: 616-620.

12. Бузун Г.А., Джемухадзе К.М., Милешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного. Физиол. раст., 1982, 29, 1: 198-200.

13. Purvis A.C., Shewfelt R.L., Gegogeine J.W. Superoxide production by mitochondria isolated from green bell pepper fruit. Physiol. Plant, 1995, 94: 743-749.

14. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М., 2002.

15. Sprent J.I. Knobs, knots and nodules -- the renaissance in legume symbiosis research. New Phytologist, 2002, 153, 1: 2-9.

16. Herouart D., Baudouin E., Frendo P. e.a. Reactive oxygen species, nitric oxide and glutathione: a key role in the establishment of the legume-Rhizobium symbiosis? Plant Physiol. Biochem., 2002, 40: 619-624.

17. Ramu S.K., Peng H.M., Cook D.R. Nod factor induction of reactive oxygen species production is correlated with expression of the early noduline gene rip 1 in Medicago trancatula. Mol. Plant-Microbe Interact., 2002, 15, 6: 522-528.

Summary

Content of superoxide anion-radical and superoxide dismutase activity in the pea seedlings under the influence of temperature and inoculation by nodule bacteria

G.G. Vasil'eva, A.K. Glyan'ko, N.V. Mironova

The authors studied the influence of low positive temperature on content of superoxide anion-radical and activity of superoxide dismutase in pea seedlings during inoculation by nodule bacteria (Rhizobium leguminosarum bv. viceae). It was shown, that the content of superoxide radicals of oxygen and the activity of superoxide dismutase in pea seedlings of the Marat variety depend on temperature of inoculation by nodule bacteria Rhizobium leguminosarum, seedling organ and duration of action of abiotic (low positive temperature) or biotic (nodule bacteria) factors. It was suggested, that superoxide radicals of oxygen and superoxide dismutase take part in regulation of infectious and nodulation processes as at the optimal temperature as at the low positive temperature, at that the content of active oxygen form depends on not only activity of superoxide dismutase but, probably, on mechanism of radicals O2- generation.

Размещено на Allbest.ru