Морфофункціональний стан жіночої репродуктивної системи за умов застосування наночастинок срібла

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфофункціональний стан жіночої репродуктивної системи за умов застосування наночастинок срібла

Аліна Литвиненко, Марія Ступчук,

Орест Блашків, Тетяна Вознесенська

За умов одно-, п'яти- та десятикратного внутрішньовенного введення наночастинок срібла (2 мг/кг та 4 мг/кг) оцінювали мейотичне дозрівання ооцитів, а також за умов десятикратного внутрішньовенного введення наночастинок срібла (2 мг/кг та 4 мг/кг) - пре- й постімплантаційну смертність ембріонів у мишей.

Дослідження (дві серії) проведено на самках білих лабораторних мишей восьми тижнів (16-18 г). Використовувані наночастинки срібла (AgNPs, 30 нм, концентрація - 8 мг/мл за металом, форма - сферична).

Уперше отримано дані про те, що однократне й п'ятикратне введення AgNPs (2 мг/кг, 4 мг/кг) не викликає запалення, не впливає на ооцити, змінює функціональний стан фолікулярних клітин і скоротливість матки.

10-кратне введення AgNPs (2 мг/кг, 4 мг/кг) приводить до розвитку запальної реакції й пригнічує оваріальну функцію (формування полярного тільця ооцитів, збільшує кількість апоптотичних і некротичних клітин у фолікулярному оточенні ооцита), змінює функціональний стан матки (зростає скоротливість оваріального й цервікального відділів матки), проте не впливає на розвиток пре- й постімплантаційних ембріонів.

Ключові слова: ооцити, матка, ембріони, наночастинки срібла.

Литвиненко Алина, Ступчук Мария, Блашкив Орест, Вознесенська Татьяна. Морфофункциональное состояние женской репродуктивной системы в условиях применения наночастиц серебра

В условиях одно-, пяти- и десятикратного введения наночастиц серебра (2 мг/кг и 4 мг/кг) оценивали мейотическое созревание ооцитов, а также в условиях десятикратного введения (2 мг/кг и 4 мг/кг) - пре- и постимплантационную смертность эмбрионов у мышей.

Исследования (две серии) проведены на самках белых лабораторных мышей восьми недель (16-18 г). Используемые наночастицы серебра (AgNPs, 30 нм, концентрация - 8 мг/мл за металлом, форма - сферическая).

Установлено, что однократное и пятикратне введение AgNPs (2 мг/кг, 4 мг/кг) не вызывает воспаления, не влияет на ооциты, изменяет функциональное состояние фолликулярных клеток и сократительность матки.

10-ти кратное введение AgNPs (2 мг/кг, 4 мг/кг) вызывает развитие воспалительной реакции и угнетает формирование полярного тельца ооцитами, увеличивается количество апоптотических и некротических клеток в фолликулярном окружении ооцита, изменяется функциональное состояние матки (возрастает сократимость овариального и цервикального отделов матки), однако не влияет на развитие пре- и постимплантационных эмбрионов.

Для выяснения механизмов, лежащих в основе влияния AgNPs на герминативные и соматические клетки, необходимы дальнейшие исследования с использованием AgNPs разных размеров и с разными покрытиями.

Ключевые слова: ооциты, матка, эмбрионы, наночастицы серебра.

Lytvynenko Alina, Stupchuk Mariya, Blashkiv Orest, Voznesenskaja Tetyana. Functional Status of Reproductive System Under Treatment of Silver Nanoparticles in Female Mice

The effect of AgNPs on mammalian cells and tissues requires further study. The effect of AgNPs on the functional status of the female reproductive system of mammals has not been examined yet.

The aim is under condition of the intravenous treatment of silver nanoparticles (AgNPs) to estimate the functional status of the reproductive system in female mice, namely to assess meiotic maturation of oocytes, viability of follicular cells surrounding the oocyte, spontaneous contractile activity of the myometrium and pre-and postimplantation mortality of embryos.

Research (two series) has been done on white laboratory 8 weeks (16-18 g) mice female in compliance with all requirements for work with laboratory animals (International European Convention for the Protection of Vertebrate Animals, Strasbourg, 1986).

First series. AgNPs are spherical nanoparticles of 30 nm (8 mg/ml for metal) diluted in water for injection. Method of treatment: intravenous. It has been investigated two doses of 2 mg/kg and 4 mg/kg. Frequency of treatment: one time per day of each dose of 1, 5 and 10 times (n = 8 animals in each group). Control animals injected with saline. Material for the study (ovaries, uterus) were taken the day after the last AgNPs injection.

Oocytes cultivation. The oocytes have been isolated mechanically from the ovaries of mice in a non-enzymatic way (without cumulus cells and in cumulus-oocyte-cell complexes). The mice oocytes from one group were collected and distributed into separate chambers, 10-20 oocytes each. All control and experimental oocytes were cultured under the same conditions (a sterile box, cameras with 0.4 ml culture medium DME and 15 mM HEPES, Ca2+ concentration of 1,71 mM, temperature 37° C, duration 20 hours). Morphological study of oocytes was performed under a microscope MBS- 10 after 2 hours of cultivation (% of total): the oocytes which restored the meiotic maturation (BM) and were at metaphase I stage (germinal vesicle break-down), and after 20 hours were at metaphase II stage (completed by the first division of meiosis and formed the first polar body (PB)) and oocytes with atypical morphology (unevenly granulated cytoplasm and fragmentation characteristics of the latter) have been counted.

Method color fluorescent dyes. The estimation of apoptotic and necrotic death of follicular cells was performed by morphological characteristics using the method of in vivo dual-color fluorescent dye nucleic acids Hoechst 33 342 and propidium iodide. Morphological studies were performed using a fluorescent microscope with water-immersion at x85. There has been used a video system sending the image from the microscope to the computer. The percentage of the living, apoptotic and necrotic cells has been determined by counting at least 200 cells.

The method of phase-graphical analysis in the study of the contractile activity of the uterine myometrium. To investigate the contractile activity of the ovarian (OD) and cervical (CD) uterine myometrium departments the method of phase-graphic analysis has been used (Gullam J., Blanks A., Thornton S., Shmygol A. 2009). To characterize the spontaneous emission by quantity of the following parameters contractile activity were taken into consideration: amplitude of reduction (mN), frequency of reduction (number per second), duration of contraction and relaxation (sec), speed reduction and relaxation (mN/second); index of contractility («IC» index of contractility, was calculated as the product of Fmax on CVmax/RVmax, mN).

Strips of uterine myometrium have been separated from the connective tissue under the microscope MBS-10 and transferred to Krebs solution (4°C). To register isometric force of reduction agents and CD myometrium of the uterus, which was being cut off with the endometrium along the uterine horns (up to 10 mm and a width of less than 1 mm to 4 from one horn), transferred into the camera and fixed. The Krebs solution (37°C, pH 7,29) was used as perfusion solution in a camera. The force of isometric contractions was recorded using the high-speed recorder. Uniformity of preparation perfusion with washing solutions was provided by the peristaltic pump Hn-1M.

Second series. There has been investigated the effect of AgNPs on pre- and post-implantation embryo mortality. Groups of animals: 1 - control (n = 10), 2 - AgNPs (2 mg/kg, n = 10), 3 - AgNPs (4 mg/kg, n = 10).

Fetal mortality in mice. Female control and experimental groups crossed with intact males. Counted: A - number of live embryos; B - number of seats of resorption (number of dead embryos); B - number of corpora lutea of pregnancy. Indicators of pre-and post-implantation death was calculated using the formula: ((B-A + B) / B) * 100 % and (B / (A + B)) * 100 %.

Statistical analysis. For the statistical analysis of the results the software package Origin 8Pro (OriginLab Corp., North., MA, USA) and spreadsheets «Microsoft®Excel2003» have been used. The reliability of the difference of mean values determined by Student's t-test, considering to be reliable the values of p <0,05. The statistical analysis of the results of research conducted by using analysis of variance ANOVA followed by comparison of mean values between groups by Newman-Coles test using the statistic program-6.

Results. Established that single input and five-time AgNPs treatment (2 mg/kg, 4 mg/kg) does not cause inflammation and does not affect oocytes but changes follicular cells functional state and alters functional state of the uterus. Ten-time AgNPs treatment (2 mg/kg, 4 mg/kg) inhibits the formation of ocyte first polar body in vitro, increases the number of apoptotic and necrotic cells in follicular environment of oocyte), changes the functional state of the uterus (increasing contractility of ovarian and cervical uterus departments), but does not affect the development of pre- and postimplantatsiynyh embryos but does not affect the development of pre- and postimplantation embryos.

Key words: oocytes, uterus, embryos, AgNPs.

Постановка наукової проблеми та її значення

В останнє десятиліття значно збільшилося використання наночастинок срібла (AgNPs), а його загальне виробництво у світі оцінюється у 500 тонн на рік [6]. AgNPs мають металевий елементний склад, не містять кисень, проте поверхня металевих AgNPs окислюється за більшості умов навколишнього середовища й негативно заряджені гідроксо- та оксогрупи викликають негативний поверхневий заряд частинки. AgNPs певною мірою розчиняються у водному середовищі [3].

Є дані токсичності AgNPs на бактерії, водні організми й клітини еукаріот in vitro [2]. Саме значні відмінності токсичності AgNPs: 275-кратне для клітин ссавців і 500-кратне для бактерій у дослідах in vitro й збільшення обсягів виробництва НЧ ставлять завдання оцінки екологічних ризиків та загрози здоров'ю людини нанотехнологій.

Вплив AgNPs на клітини й тканини ссавців потребує детального з'ясування. Дані про вплив внутрішньовенного введення AgNPs на функціональний стан органів жіночої репродуктивної системи у ссавців на сьогодні відсутні.

Мета роботи - за умов одно-, п'яти- та десятикратного внутрішньовенного введення наночастинок срібла (2 мг/кг та 4 мг/кг) дослідити морфофункціональні особливості органів репродуктивної системи в самок мишей, а саме оцінити мейотичне дозрівання ооцитів, життєздатність клітин фолікулярного оточення ооцита, спонтанну скоротливу активність міометрію оваріального та цервікального відділів матки, а також за умов десятикратного внутрішньовенного введення наночастинок срібла (2 мг/кг та 4 мг/кг) - пре- й постімплантаційну смертність ембріонів у мишей.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження (дві серії) проведено на самках білих лабораторних мишей восьми тижнів (16-18 г) із дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (Міжнародна європейська конвенція про захист хребетних тварин, Страсбург, 1986). Після завершення експериментів тварин наркотизували нембуталом й умертвляли методом дислокації шийних хребців.

Характеристика наночастинки AgNPs - 30 нм (концентрація - 8 мг/мл за металом, форма - сферична, колір коричневий, реагенти використані для синтезу - нітрат срібла (AgNO₃), (BioXtra, >99 % (titration, Sigma-Aldrich); Карбонат калію (K₂CO₃) (99,995 % trace metals basis, Sigma-Aldrich); Танін (ACS reagent, Sigma-Aldrich) синтезовані в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України за оригінальним протоколом (методом хімічної конденсації).

Серія перша. AgNPs - розводили у воді для ін'єкцій. Досліджували дві дози 2 мг/кг і 4 мг/кг. Спосіб уведення - внутрішньовенний. Кратність уведення для кожної дози - 1, 5 та 10 разів (n=8 тварин у кожній групі). Інтервал уведення - один раз на добу. Контрольним тваринам уводили фізіологічний розчин. Матеріал для дослідження (яєчники, матку) забирали на наступний день після останнього введення AgNPs.

Культивування ооцитів. Із яєчників мишей неферментативно (механічно) виділяли ооцити (без кумулюсних клітин і в складі кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів). Ооцити від мишей однієї групи збирали та розподіляли в окремі камери по 10-20 ооцитів у кожній. Усі контрольні та експериментальні ооцити культивували в однакових умовах (стерильний бокс, камери по 0,4 мл культурального середовища БМЕ з 15 мМ HEPES, концентрація Са²+ - 1,71 мМ, температура - 37 °С, тривалість - 20 год). Морфологічні дослідження ооцитів проводили під мікроскопом МБС-10. Визначали стан зародкового пухирця, перивітелінового простору та цитоплазми, а саме щільність, ступінь гранульованості, ознаки фрагментації й дегенерації. Після 2 год культивування підраховували ооцити (% до загальної кількості), що відновлювали мейотичне дозрівання (ВМ) та перебували на стадії метафази І (розчинення зародкового пухирця), а після 20 год - на стадії метафази ІІ (завершували перший поділ мейозу й формували перше полярне тільце (ПТ)), а також ооцити з атиповою морфологією (нерівномірно гранульованою цитоплазмою та ознаками фрагментації останньої).

Метод прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками. Оцінку апопто- тичної й некротичної загибелі фолікулярних клітин здійснювали за морфологічними ознаками за допомогою методу прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками нуклеїнових кислот Хехст 33342 та пропідіум йодид. Морфологічні дослідження проводили за допомогою люмінесцентного мікроскопа Люмам И-1 з водно-імерсійним об'єктивом х85. Використовували відеосис- тему передачі зображення з мікроскопа на комп'ютер. Визначали відсоток живих, апоптотичних і некротичних клітин при підрахунку не менше ніж 200 клітин.

Метод фазографічного аналізу в дослідженні скоротливої активності міометрію матки.

Для дослідження скоротливої активності оваріального (ОВ) та цервікального (ЦВ) відділів міомет- рію матки застосовували метод фазно-графічного аналізу. Для кількісної характеристики спонтанних фазних скорочень узято такі параметри скоротливої активності: Fmax - пік амплітуди скорочення відносно базального тонусу, мН; Cvmax - позитивний пік першої похідної скорочення (макс. швидкість скорочення), мН/с; Rvmax - негативний пік першої похідної скорочення (макс. швидкість розслаблення), мН/с; Т - час, між максимальною активацією (CVmax) і дезактивацією (RVmax) скорочення (с); індекс скоротливості (ІС - індекс скоротливості, розраховували як добуток Fmax на CVmax/RVmax, мН).

Смужки міометрію матки відпрепаровували від сполучної тканини під мікроскопом МБС-10 і переносили в розчин Кребса (4^оС). Для реєстрації сили ізометричних скорочень ОВ і ЦВ міометрію матки, які вирізали з ендометрієм уздовж рогів матки під мікроскопом МБС-10 (довжиною до 10 мм і шириною не більше 1 мм, до 4 з одного рогу) переносили в камеру, фіксували й з' єднували з консолею механоелектричного перетворювача сили в електричний сигнал. Камеру перфузуватимуть розчином Кребса (37^оС, pH 7,29). Силу ізометричних скорочень реєстрували за допомогою швидкодіючого самописця Н3021-3. Рівномірність перфузії препарату, омиваючими розчинами забезпечували перистальтичним насосом НП-1М.

Серія друга. Досліджували вплив AgNPs на пре- та постімплантаційну смертність ембріонів. Групи тварин: 1 - контроль, уводили фіз. розчин (n=10), 2 - AgNPs (2 мг/кг, n=10), 3 - AgNPs (4 мг/кг, n=10). Уведення речовин здійснювали щоденно протягом 10 днів у кожній групі тварин.

Оцінка показників ембріональної смертності в мишей. Самиць контрольних і дослідних груп парували з інтактними самцями. Спарювання та подальші маніпуляції з ембріонами проводили згідно з методикою [1]. Стадії розвитку пре- й постімплантаційних ембріонів визначали за методикою [1]. Підраховували: А - кількість живих ембріонів, Б - число місць резорбції (число загиблих ембріонів), В - число жовтих тіл вагітності. Показники пре- й постімплантаційної загибелі обчислювали за формулами: ((В-А+Б)/В)*100% і (Б/(А+Б))*100 %.

Статистична обробка результатів. Результати експериментів статистично оброблялися за програмою GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, USA). Перевірку даних на нормальність розподілу виконували за тестом Колмогорова-Смирнова та порівнювали середні за t-критерієм Стьюдента. Р<0,05 уважалося статистично вірогідним. Дані представлено як M±m (середнє±стандартна похибка, 10>n>4).

Виклад основного матеріалу та обґрунтування отриманих результатів дослідження

морфофункціональний репродуктивний наночастинка срібло

Вплив AgNPs на апоптотичну й некротичну загибель фолікулярних клітин. Нами встановлено, що введення AgNPs (2 мг/кг та 4 мг/кг) викликає вірогідне зменшення кількості живих клітин фолікулярного оточення ооцитів. Отже, за умов одно-та п'ятикратного введення AgNPs (2 мг/кг і 4 мг/кг) збільшується кількість апоптотичних клітин, а при десятикратному - апоптотичних і некротичних клітин фолікулярного оточення ооцитів.

Таблиця 1 Кількість клітини фолікулярного оточення ооцитів (живих, із морфологічними ознаками апоптотичної й некротичної загибелі) за умов уведення AgNPs (2 та 4 мг/кг) (М±т)

Таблиця 2 Пре- й постімплантаційна ембріональна смертність у мишей за умов уведення AgNPs (2 та 4 мг/кг) (М±т)