Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на поведенческие и иммунологические параметры у животных с синдромом хронической зависимости от морфина

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток на поведенческие и иммунологические параметры у животных с синдромом хронической зависимости от морфина

Е.В. Маркова, В.В. Абрамов,

В.А. Козлов, Н.В. Михневич,

М.В. Старостина

Новосибирск

Резюме

Показано, что изменение параметров ориентировочно-исследовательского поведения мышей (CBAxC57BL/6)F1 при формировании хронической зависимости от морфина определяется исходным поведенческим статусом животных. Состояние абстиненции характеризуется значительной супрессией гуморального звена иммунного ответа и изменениями экспрессии гена интерлейкина - 1в в головном мозге и селезенке животных. Трансплантация иммунокомпетентных клеток от «здоровых» доноров с соответствующим поведенческим статусом сопровождается нормализацией иммунологических и поведенческих показателей.

Ключевые слова: хроническая зависимость от морфина, исследовательское поведение, иммунный ответ, цитокины, трансплантация иммунокомпетентных клеток.

Abstract

Changes in the parameters of exploratory behavior in (CBAxC57BL/6)F1 mice during the development of chronic morphine dependence are determined by initial behavior status of animals. Withdrawal syndrome is characterized by significant suppression of humoral immune response and changes of interleukin-1в expression in brain and spleen. Transplantation of immune cells from «healthy» donors with the same immune status results in normalization of immune and behavior parameters.

Key words: chronic morphine dependence, exploratory behavior, immune response, cytokine, transplantation of immune cells.

Одним из важнейших достижений современной биологии и медицины является установление функционального взаимодействия иммунной и нервной систем. В рамках проблемы нейроиммунных взаимоотношений нами изучается афферентная организация взаимодействия указанных регуляторных систем организма, механизмы ответа мозга на активацию иммунной системы, участие иммуногенных факторов в регуляции процессов высшей нервной деятельности, как в норме, так и при различных патологических состояниях. Одним из таких патологических состояний является хроническая опиатная зависимость. Морфин, взаимодействуя с опиатными рецепторами головного мозга, оказывает выраженное влияние на поведенческие реакции. Известны и его супрессивные эффекты (прямые и опосредованные через центральные механизмы) на иммунитет [4, 15]. Как показали наши предыдущие исследования, функциональная активность иммунной системы, в частности, ее клеточных элементов, связана с уровнем ориентировочно-исследовательского поведения (УИП) [1, 6, 7, 8]. Более того, животные с различным УИП имеют определенные особенности структурно-функциональной организации ЦНС [5, 8], что может обусловливать различия в поведенческих эффектах морфина. Ранее нами была продемонстрирована способность иммунокомпетентных клеток, выделенных у мышей, характеризующихся определенными параметрами поведения в тесте «открытое поле», после внутривенного введения направленно изменять такое поведение у сингенных реципиентов [1, 2].

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение поведенческих и иммунологических расстройств, возникающих при формировании хронической зависимости от морфина у животных с различным поведенческим статусом; оценка возможности коррекции указанных расстройств трансплантацией иммунокомпетентных клеток от здоровых доноров.

Методика исследования

Работа выполнена на 64 мышах-самцах (CBAxC57BL/6)F1 в возрасте трех месяцев, полученных из питомника лабораторных животных Института фармакологии СО РАМН (Томск). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой не менее 2 недель до начала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном световом режиме.

Ориентировочно-исследовательское поведение оценивали в тесте «открытое поле» [3], подсчитывая число пересеченных центральных и периферических квадратов, число вертикальных стоек (свободных и с опорой на стенку поля), суммарную двигательную активность. С целью определения степени эмоционального напряжения регистрировали количество фекальных болюсов. По результатам тестирования формировали группы животных с высоким и низким уровнями ориентировочно-исследо-вательского поведения (УИП).

Для развития хронической зависимости от морфина у животных с высоким и низким УИП использовали протокол поступления морфина с питьевой водой, содержащей 2% сахарозы для маскировки горького вкуса препарата. Концентрацию морфина в потребляемой жидкости изменяли по 0,1, 0,2 и 0,3 мг/мл в течение 48 часов каждая, 0,4 мг/ мл в течение всего последующего периода. Общее время потребления наркотика животными составляло 25 дней. Контрольная группа животных получала двухпроцентный раствор сахарозы.

Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), как это было описано ранее [8]. В качестве митогенов использовались ЛПС E. coli 0111:B4 (Sigma) и конканавалин А (Pharmacia), субоптимальные концентрации которых составляли соответственно 25 и 1 мкг/мл.

Определение антителообразующих клеток проводилось по методу A.J. Cunningham [11]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (5% 0,5 мл). Гуморальный иммунный ответ оценивали на пятые сутки после иммунизации по числу антителообразующих клеток в селезенке (АОК).

Уровень мРНК ИЛ-1 в головном мозге и селезенке мышей определяли методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суммарную РНК выделяли по методу, описанному P. Chomczynsky, N. Sacchi [10]; реакции ревертирования и амплификации проводили методом, описанным R.D. Allen et al. [9]. Праймеры к ИЛ-1 и -актину (последний использовался для стандартизации и выравнивания результатов анализа исследуемых образцов ДНК) для ПЦР были синтезированы согласно структуре, описанной вышеуказанными авторами [9]. Продукты ПЦР визуализировали в денситометре (Pharmacia-LKB); для полуколичественной оценки результатов использовали программу Image Master VDS Software (USA). Результаты выражали в условных (относительных) единицах оптической плотности.

Иммунокомпетентные клетки для трансплантации выделяли из суспензии спленоцитов здоровых мышей-доноров с высоким и низким УИП адгезией на пластике в течение двух часов при температуре 37?С, предварительно удаляя эритроциты методом гемолитического шока. Затем, после двукратного отмывания, оставшиеся клетки снимали с пластика специальным шпателем Сell Scraper (Becton Dickinson) в пробирку. Полученная суспензия на 86-92% состояла из клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Жизнеспособность клеток оценивалась по включению трипанового синего и составляла 93-95%.

Далее клетки (8Ч10⁶ в 0,2 мл среды RPMI-1640) доноров внутривенно вводили реципиентам с аналогичным исходным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения. Для трансплантации применяли также и неразделенную. суспензию спленоцитов в концентрации 20х10⁶ на одно животное. На пятые сутки после трансплантации у реципиентов тестировались параметры ориентировочно-исследовательского поведения, количество антителообразующих клеток селезенки, экспрессия генов цитокинов клетками головного мозга и селезенки.

Статистическую обработку результатов проводили с применением t-критерия Стьюдента и парного критерия Манна-Уитни (компьютерные программы «Jandel Sigma Plot», «Statistica»). Результаты представлены в виде М±SD. Различия считали достоверными при p<0,05.

поведенческий иммунный мышь абстиненция морфин

Результаты исследования

Выраженность эффектов морфина на поведенческие реакции у животных, как известно, обусловлена их генетическими особенностями [13]. В исследовании показано, что изменения параметров ориентировочно-исследовательского поведения при хроническом воздействии морфина у генетически однородных животных также могут быть неоднозначны; причем характер этих изменений зависит от исходного поведенческого статуса.

Хроническая зависимость от морфина была сформирована в двух группах мышей (CBAxC57Bl/6)F1 c высоким и низким исходными УИП. Установлено, что потребление морфина (мг) указанными группами животных, как среднесуточное (1,01±0,2 и 1,2±0,3; p>0,05), так и общее за курс (22,85±5,3 и 26,16±6,7; p>0,05) было примерно одинаковым. Тем не менее, наблюдались существенные различия в характере изменений параметров ориентировочно-исследовательского поведения. Так, синдром хронической опиатной зависимости у животных с исходно низким УИП проявлялся значительной стимуляцией показателей горизонтальной и вертикальной активности в тесте «открытое поле» при сниженном уровне дефекации. У животных с исходно высоким УИП достоверных изменений указанных показателей не выявлено (табл. 1).

Таблица 1

Параметры ориентировочно-исследовательского поведения мышей (CBAxC57Bl/6)F1 с различным исходным поведенческим статусом при синдроме хронической зависимости от морфина и после трансплантации иммунокомпетентных клеток (M ± SD; n = 12-19)

Примечание. 1 - контроль, 2 - хроническая зависимость от морфина, 3 - трансплантация неразделенной суспензии спленоцитов, 4 - трансплантация прилипающей к пластику фракции спленоцитов,* - P<0,05 по сравнению с контрольной группой животных

Модуляция локомоторной активности при синдроме хронической зависимости от морфина может быть следствием изменения активности дофамин- и серотонинергических систем мозга [13, 15]. Различный уровень функциональной активности этих систем у животных с высоким и низким УИП [5], по всей вероятности, может служить причиной выявленного нами неоднозначного действия морфина на поведение этих животных.

Вместе с тем установлено, что выраженность данной поведенческой реакции определяется также уровнем продукции клетками головного мозга одного из ведущих регуляторных цитокинов - ИЛ-1 [8, 12]. Действительно, наши исследования показали, что повышение параметров УИП в группе мышей с его исходно низким уровнем при синдроме хронической зависимости от морфина сопровождается снижением экспрессии гена ИЛ-1в клетками головного мозга (рис. А). Следовательно, повышение параметров УИП в группе мышей с его исходно низким уровнем может быть следствием как изменения активности нейрохимических систем головного мозга, так и изменением его цитокинового профиля, в частности, снижением экспрессии клетками гена ИЛ-1в.

Синдром отмены проявлялся в обеих группах характерными для состояния абстиненции у животных поведенческими параметрами: регистрировались корчи, «отряхивание мокрой собаки», птоз, диарея. При этом со стороны иммунной системы у всех мышей наблюдалось значительное (более чем на 40%) подавление гуморального иммунного ответа, выражающееся в уменьшении количества антителообразующих клеток селезенки (табл. 2); снижение спонтанной пролиферативной активности спленоцитов, наиболее выраженное у мышей с исходно низким УИП, и ЛПС - стимулированной пролиферативной активности у животных с исходно высоким УИП (табл. 3).

Таблица 2

Гуморальный иммунный ответ у мышей (CBAxC57Bl/6)F1 с синдромом хронической зависимости от морфина и после трансплантации прилипающей фракции спленоцитов (M ± SD; n = 12-15)

Примечание* - P<0,01 по сравнению с контрольной группой животных

Регистрировалось также снижение экспрессии клетками селезенки гена ИЛ-1в, одного из ключевых факторов формирования иммунного ответа (рис. 1-Б).

Иммунологические сдвиги при синдроме отмены морфина были показаны также другими авторами и согласуются с полученными нами результатами [14]; они позволяют предположить снижение активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Тот факт, что введение (как центральное, в область желудочков головного мозга, так и периферическое) антагониста D₂-дофаминовых рецепторов блокирует супрессивное влияние морфина на иммунологические параметры [15], позволяет сказать, что дофамин опосредует не только поведенческие, но и иммуномодулирующие эффекты этого наркотического вещества. По всей видимости, общий нейромедиаторный и цитокиновый фон организма, на котором развиваются эффекты морфина, и определяет выраженность поведенческих и иммуномодулирующих эффектов этого наркотического вещества.

Таблица 3

Исследование in vitro пролиферативной активности клеток селезенки мышей (CBAxC57Bl/6)F1 с различным исходным поведенческим статусом при синдроме хронической зависимости от морфина (M±SD)

Примечание

* - P<0,05;

** - P<0,01 по сравнению с контрольной группой животных

Ранее нами была показана направленная регуляция УИП у животных при трансплантации иммунокомпетентных клеток [2]. В связи с этим возникло предположение о возможности использования данного феномена с целью коррекции поведенческих изменений, возникающих при формировании хронической опиатной зависимости. Внутривенное введение суспензии спленоцитов от «здоровых» доноров сингенным реципиентам с синдромом хронической зависимости от морфина приводило к нормализации у последних не только поведенческих, но и иммунологических расстройств в случае, если доноры и реципиенты характеризовались одинаковым исходным УИП. Аналогичные результаты были получены нами и при трансплантации прилипающей фракции спленоцитов, которая представлена в основном клетками системы мононуклеарных фагоцитов. Так, у реципиентов с исходно низким УИП параметры ориентировочно-исследовательского поведения и уровень мРНК ИЛ-1в в клетках головного мозга после трансплантации достоверно не отличаются от таковых в контрольной группе животных (табл. 1; рис. А). Наблюдается также восстановление уровня гуморального иммунного ответа у всех животных, регистрируемое по количеству антителообразующих клеток селезенки (табл. 2) и экспрессии гена ИЛ-1в спленоцитами (рис. Б).

Рис. Уровень мРНК ИЛ-1в в клетках головного мозга и селезенки мышей (CBAxC57Bl/6)F1 с синдромом хронической зависимости от морфина и после трансплантации прилипающей фракции спленоцитов А - головной мозг; Б - селезенка

По оси ординат - единицы оптической плотности; по оси абсцисс - животные с исходно высоким УИП (1), животные с исходно с низким УИП (2)

Светлые столбики - контрольная группа; заштрихованные - животные с синдромом хронической зависимости от морфина; темные - животные после трансплантации иммунокомпетентных клеток. * - p< 0,05 по сравнению с контролем

В группе животных с синдромом хронической зависимости от морфина, которым трансплантация иммунокомпетентных клеток не была проведена, описанные ранее поведенческие и иммунологические расстройства сохранялись.

Таким образом, представленные выше экспериментальные данные позволяют сделать заключение о том, что характер изменений параметров ориентировочно-исследовательского поведения при синдроме хронической опиатной зависимости у животных зависит от их исходного поведенческого статуса. Наблюдаемая при этом супрессия гуморального иммунного ответа, снижение пролиферативной активности спленоцитов и экспрессии ими и клетками головного мозга гена ИЛ-1в, равно как и поведенческие расстройства, могут быть устранены трансплантацией иммунокомпетентных клеток от здоровых доноров с соответствующим поведенческим статусом. Тот факт, что трансплантация прилипающей к пластику фракции спленоцитов, состоящей преимущественно из клеток системы мононуклеарных фагоцитов, также нивелирует вызванные хроническим воздействием морфина поведенческие и иммунологические расстройства, позволяет сделать вывод о существенной роли этих клеток в патогенезе синдрома хронической опиатной зависимости.

Литература

1. Основы нейроиммунологии / В.В. Абрамов, Т.Я. Абрамова, И.А. Гонтова, В.А. Козлов, Е.В. Маркова, А.Ф. Повещенко, Н.М. Ребенко, И.А. Соловьева, О.В. Сорокин. - М.: Академия наук о Земле, 2004.

2. Модуляция ориентировочно-исследовательского поведения мышей (CBAxC57BL/6) F1 иммунокомпетентными клетками / В.В. Абрамов, Е.В. Маркова, Н.А. Короткова, В.А Козлов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, №9. - С. 319-321.

3. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М., 1991.

4. Ветлугина Т.П., Иванова С.А., Невидимова Т.И. Клиническая иммунология в психиатрии и наркологии. Томск, 2001.

5. Доведова Е.Л., Монаков М.Ю. Особенности метаболизма нейромедиаторов в корково-подкорковых структурах мозга крыс, различающихся по поведенческим характеристикам // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2000. - Т. 130, №9. - С. 289-291.

6. Модуляция исследовательского поведения у мышей при активации клеточного звена иммунного ответа / Е.В. Маркова, Н.А. Короткова, И.А. Гольдина, В.В. Абрамов, В.А. Козлов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. - Т. 132, №10. - С. 424-426.

7. Модуляция ориентировочно-исследовательского поведения у мышей в процессе развития гуморального иммунного ответа / Е.В. Маркова, А.Ф. Повещенко, Н.А. Короткова, Е.В. Якушенко, В.В. Абрамов, В.А. Козлов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 133, №5. - С. 534-536.

8. Иммуноморфологические особенности животных с разным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения / Е.В. Маркова, Т.Г. Чернова, П.Н. Филимонов, Н.А. Короткова, В.В. Абрамов, В.А. Козлов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2004. - Т. 138, №10. - С. 466-469.

9. Allen R.D., Staley T.A., Sidman C.L. Differential cytokine expression in acute and chronic murine graft-versus-host-diseases // Eur. J. Immunol. - 1993. - V. 23, №2. - P. 333-337.

10. Chomczynsky P., Sacchi N. Single-stop method of RNA isolation by acid guanidinum-phenol-chloroform extraction // Analyt. Biochem. - 1987. - V. 162. - P. 156-159.

11. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells // Nature. - 1965. - №207. - P. 1106-1107.

12. Dantzer R. // Eur. J. Pharmacol. - 2004. - V. 500, №1-3. - P. 399-411.

13. Murphy N.P., Lam H.A., Maidment N.T. A comparison of morphine-induced locomotor activity and mesolimbic dopamine release in C57BL6, 129Sv and DBA2 mice // J. Neurochem. - 2001. - V. 79, №3. - P. 626-635.

14. Withdrawal from morphine in mice suppresses splenic macrophage function, cytokine production, and costimulatory molecules / R.T. Rahim, J.J. Meissler, L. Zhang, M.W. Adler, T.J. Rogers, T.K. Eisenstein // J. Neuroimmunol. - 2003. - V. 144, №1-2. - P. 16-27.

15. Morphine-induced alteration of immune status are blocked by the dopamine D₂ - like receptor agonist 7-OH-DPAT / T.B. Saurer, K.A. Carrigan, S.G. Ijames, D.T. Lysle // J. Neuroimmunol. - 2003. - V. 148, №1-2. - P. 54-62.

Размещено на allbest.ru