Використання моделі раннього ембріонального розвитку перепела японського для оцінки біологічної активності мікрохвильового випромінювання

Размещено на http://www.allbest.ru/

Використання моделі раннього ембріонального розвитку перепела японського (coturnix coturnix japonica) для оцінки біологічної активності мікрохвильового випромінювання

Олександр Цибулін

Анотація

У роботі на моделі перепелиного ембріона продемонстровано високу чутливість моделі раннього ембріогенезу перепелів до низькоінтенсивного мікрохвильового випромінювання, що проявляється в стимуляції або пригніченні сомітогенезу та зміні рівня ушкодження ДНК у клітинах 38-годинних ембріонів.

Ключові слова: мікрохвильове випромінювання, ембріогенез, сомітогенез, пошкодження ДНК.

Цыбулин Александр. Использование модели раннего эмбрионального развития перепела японского (coturnix coturnix japonica) для оценки биологической активности микроволнового излучения. Установлено, что микроволновое излучение стандарта GSM 900 МГц при средней интенсивности 0,21 рВт/см2 проявляет регуляторное действие на раннее эмбриональное развитие перепелиного эмбриона. При облучении на протяжении 38 ч отмечен стимулирующий эффект на сомитогенез. Увеличение времени облучения до 158 ч (при дополнительном 5-суточном облучении до начала инкубации) вызывает угнетение развития перепелиных эмбрионов, о чём свидетельствует уменьшение числа дифференцированных пар сомитов, которые сформировались на 38 ч инкубации. Кроме этого, облучение перепелиных эмбрионов микроволновым излучением стандарта GSM 900 МГц на протяжении первых 38 ч инкубации приводит к статистически достоверному (p<0,001) снижению одно- и двухниточных разрывов ДНК в клетках 38-часовых эмбрионов, которое было выявлено методом «ДНК-комет». Облучение перепелиных эмбрионов inovo на протяжении 5 суток до начала и 38 ч после начала инкубации микроволновым излучением стандарта GSM 900 МГц приводит к достоверному (p<0,001) увеличению одно- и двухниточных разрывов ДНК в клетках 38-часовых эмбрионов.

Ключевые слова: микроволновое излучение, эмбриогенез, сомитогенез, повреждение ДНК.

Tsybulin dexandr. Use Models of Early Developing Embryo Japanese Quail (Coturnix Coturnix Japonica) For Assessment of Biological Activity of Microwave. During the last few decades, worldwide ^tensNe mplementation of GSM mobtie communkation systems has occurred. Recent epidemiological studks ramed concerns about potential hazards of long-term mkrowave exposure for human health. We amed at assessment of bklogkal effects of microwave emhted by commertial cell phone usmg developmg bird embryo as a model. Embryos of Japanese Quads were exposed in ovo to GSM 900 MHz cellular phone radmtion during тИЫ 38 h of broodmg or alternatively during 158 h (120 h before broodmg plus initial 38 h of broodmg) discontinuously whh 48 sec ON followed by 12 sec OFF mtervals. Max!mum mtenstiy of mddent radmtion on the egg's surface was 0,2 pW/cm2. A number of dtiferentiated somheswere assessed microscopically. Posskle DNA damage evoked by irradiation was assessed by an alkahne comet assay. Exposure to radmtion from GSM 900 MHz cellular phone led to a significantly altered number of dtiferentiated somties. In embryos madded during 38 h the number of differentiated somtiesmcreased (p<0,001), whtie іп embryos madded during 158 h thm number decreased (p<0.05). The lower duration of exposure led to significant (p<0.001) decrease іп a level of DNA stand breaks іп cells of 38-h embryos, whtie the kgher duration of exposure resulted іп a significant (p<0.001) mcrease іп DNA damage as compared to the control.

Key words: electromagnetic field, mkrowave radmtion, embryo, somtiogenesm, DNA damage.

Постановка наукової проблеми та її значення

Епідеміологічні дослідження останніх років підтвердили, що довготривале та інтенсивне використання мобільного зв'язку може спричиняти суттєві ризики для здоров'я людини внаслідок надмірного радіоопромінення. Так, виявлено достовірне зростання ризиків розвитку гліом, менінгіом, неврином слухового нерва, пухлин білявушних слинних залоз, головного болю, відчуття фізичного дискомфорту в користувачів мобільного зв'язку при багаторічному (5-10 років) інтенсивному користуванні мобільними телефонами.

Численні дослідження проведено на різноманітних біологічних об'єктах, таких як Drosophila, мурахи, курячі ембріони, сперматозоїди людини invitro, добровольці invivo, миші, щурі, свині, кролі invivo, клітини мишей лінії GC-2 invitro, бджоли, найпростіші та очищені протеїни invitro. У них указано на значний біологічний або клінічний ефект мікрохвильового випромінювання (МХВ), починаючи з порушення рухливості, орієнтації в просторі, погіршення самопочуття або зміни електроенцефалограми, закінчуючи пригніченням чоловічої та жіночої репродуктивної функцій, змінами активності ензимів, рівнів ушкодження ДНК та загибелі клітин, а також гістопатологічними змінами в тканинах головного мозку.

Ембріон птиці, у певному розумінні, є класичним модельним об'єктом, який можна використовувати для вивчення впливу різноманітних фізичних факторів на біологічні об'єкти. Це зумовлено тим, що ембріон птиці розвивається поза організмом матері, тому можливе вивчення безпосереднього впливу досліджуваного фактора на нього, виключаючи при цьому опосередкований вплив організму матері. Раніше [3] нами успішно використано перепелиний ембріон як експериментальну модель для вивчення біологічної ефективності електромагнітного випромінювання оптичного діапазону.

Мета роботи - з'ясувати можливість використання моделі перепелиного ембріона для оцінки біологічної активності МХВ.

Матеріали та методи дослідження

Під час дослідження сформовано групи свіжих інкубаційних яєць перепела японського (Coturnix coturnix japonica) (дослідні й контрольні, по 8-10 шт кожна), які інкубували inovo. Інкубацію здійснювали за оптимальних умов для розвитку перепелиного ембріона: 38,3 ±0,2 °С, відносна вологість - 60 %. Яйця розміщували в горизонтальних лотках і перевертали тричі на день. Перша група слугувала інтактним контролем, друга піддавалася дії мікрохвильового випромінювання (МХВ) стандарту GSM 900 МГц.

Ембріони першої дослідної групи піддавали 38-годинному опроміненню, починаючи від закладки в інкубатор. Для збільшення дози МХВ ембріони другої дослідної групи піддавали 158-годинному опроміненню. Цей час уключав 120 год (5 діб) опромінення ембріонів inovo за кімнатної температури перед закладкою на інкубацію та 38 год від закладки в інкубатор. Дослідні й контрольні групи впродовж усього експерименту були екрановані кількома шарами алюмінієвої фольги й розміщені на відстані 10 сантиметрів одна від одної. Фонове радіовипромінювання в лабораторії становило 0,001 мкВт/см2, у зоні знаходження контрольних ембріонів - 0,002 мкВт/см2.

Джерелом МХВ використовували комерційну модель мобільного телефона Nokia 3120, який розміщували на відстані 3 см над поверхнею яєць та активізували комп'ютерною програмою автодозвону в режимі 48 секунд - «увімкнуто», 12 секунд - «вимкнуто». У стані «увімкнуто» система випромінювала МХВ стандарту GSM 900 МГц із щільністю потужності 0,21±0,014 р Вт/см2 у зоні розміщення біологічного об'єкта (яєць). Інтенсивність МХВ оцінювали вимірювачем електромагнітного випромінювання радіочастотного діапазону (RFField Strength Meter, AlfalabInc., USA).

Для оцінки впливу опромінення на ранній ембріональний розвиток перепела використовували морфометричний метод підрахунку диференційованих пар сомітів, що сформувалися на 38-му год інкубації. Цей показник вважається об'єктивним для оцінки інтенсивності раннього ембріонального розвитку птиці [2].

Аналіз рівня пошкоджень ДНК в ембріональних клітинах виконували за допомогою лужного гель-електрофорезу поодиноких клітин (метод «ДНК-комет») відповідно до методики із деякими модифікаціями. Для приготування суспензії ембріональних клітин перепелиний ембріон після 38 год інкубації знімали з поверхні жовтка за допомогою паперового кільця. Після цього ембріон обережно відмивали в холодному PBS та знімали з паперового кільця. Суспензію ембріональних клітин отримували шляхом обережного піпетування цілого ембріона, що на той період розвитку сягав маси 7 мг, у відповідному об'ємі фосфатного буфера для досягнення кінцевої концентрації клітин близько 5х106/мл. Суспензію ембріональних клітин змішували з розплавленою 1-% легкоплавкою агарозою при 37 °С у співвідношені 1:1 та наносили на предметне скло в об'ємі 75 мкл (концентрація клітин 1-2 х105кл/мл). Після цього препарати охолоджували на льоду для затвердіння агарози. Надалі препарати промивали у фосфатному буфері та занурювали в лізуючий розчин (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mMTrisbase, 10 % DMSO, 1 % Triton X-100, pH 10) та залишали на 1 год при 4 °С. Після лізису препарати переносили в камеру для горизонтального електрофорезу, витримували в лужному розчині (300 mMNaOH й 1 mM EDTA, рН 13), 30 хв. Надалі проводили електрофорез у цьому ж розчині 20 хв при 0,8 В/см, 25 В, 300 мА. Препарати нейтралізували 0,4 М розчином TrisCl 10 хв, відмивали в дистиляті двічі по 5 хв, висушували при 37 °С та забарвлювали розчином SYBR Green І. Препарати аналізували за допомогою люмінісцентого мікроскопа (CarlZeissFluoval, Germany), що був обладнаний відеокамерою для мікроскопічного аналізу (DigitalCameraforMicroscope DCM 500, China).

Аналіз зображення проводили за допомогою пакету програм CometScore (TriTekCorp, USA). У кожному варіанті підраховували не менше 50 клітин. Рівень пошкодження ДНК визначали за відсотком ДНК у хвості комети або за параметром моменту хвоста, що є добутком довжини хвоста комети на відсотковий уміст ДНК у хвості.

Результати статистично опрацьовували за допомогою програмного забезпечення Statistika v. 6.0 (StatSoft, USA). Для визначення статистичної вірогідності використовували t-критерій Стьюдента. Отримані результати статистично вірогідні при р<0,05.

Виклад основного матеріалу й обґрунтування отриманих результатів досліджень

На момент закладки в інкубатор пташиний ембріон перебуває на стадії ранньої гаструли. У перші години інкубації відбувається додаткове утворення ентодермальних клітин та кінцеве диференціювання енто- дермального зародкового шару, тобто завершується стадія гаструляції. Приблизно в добовому віці мезодерма ембріона починає диференціюватися на соміти, нефротоми та спланхнотоми. Кількість диференційованих пар сомітів є найбільш точним критерієм для оцінки раннього ембріонального розвитку птиці (до 50-53 год), що пов'язано з тим, що час утворення сомітів є постійним [1]. ембріон мікрохвильовий випромінювання клітина

Використовуючи метод підрахунку диференційованих пар сомітів, що сформувалися на 38-му год інкубації, виявили (рис. 1, табл. 1), що опромінення перепелиних ембріонів inovo МХВGSM 900 МГц стандарту при середній інтенсивності 0,21 рВт/см2 протягом 38 год достовірно прискорювало темпи ембріонального розвитку, про що свідчить вірогідне (p<0,001) збільшення кількості диференційованих пар сомітів в опромінених ембріонів, порівняно з контролем, на 14,89 %.

158-годинне опромінення перепелиних ембріонів випромінюванням GSM 900 МГц стандарту призводило до вірогідного (p<0,05) пригнічення інтенсивності розвитку перепелиних ембріонів, про що свідчить суттєве зменшення на 20,97 % кількості диференційованих пар сомітів у 38-годинних ембріонів дослідних груп, порівняно з відповідним контролем. Дослідні групи були значно варіатив- ніші за контрольні за темпами розвитку.

Таблиця 1 Вплив мікрохвильового випромінювання GSM 900 МГц на стандарту на кількість диференційованих пар сомітів, що сформувалися на 38 год інкубації, та рівень ушкоджень ДНК у клітинах 38-годинних перепелиних ембріонів (n=8-10; M±m)

Примітка. * -р<0,05 порівняно з контролем; *** -р<0,001, порівняно з відповідним контролем.

Потрібно відзначити однакову кількість диференційованих пар сомітів у 38-годинних ембріонів обох контрольних груп, де першу сформовано зі свіжих інкубаційних яєць, а другу перед інкубацією зберігали за кімнатної температури протягом п'ять діб. Це вказує на те, що 5-денне зберігання перепелиних яєць перед інкубацією не вплинуло на життєдіяльність ембріонів, що відповідає стандартам інкубації. Отже, зменшення кількості диференційованих пар сомітів в опромінених ембріонів другої дослідної групи зумовлено дією МХВ.

Таким чином, отримані дані демонструють високу чутливість моделі раннього ембріогенезу (сомітогенезу) до низькоінтенсивного МХВ. При цьому напрям ефекту опромінення залежить від його дози, яку змінювали збільшенням часу опромінення.

Рис. 1. Мікрофото (збільшення х24) перепелиного ембріона на 38-му год інкубації: a - контроль; b - 38-годинне опромінення inovo мікрохвильовим випромінюванням GSM 900 МГц стандарту; c - 158-годинне опромінення inovo мікрохвильовим випромінюванням GSM 900 МГц стандарту

Нами також проведено оцінку можливих мутагенних ефектів при різній тривалості опромінення ембріональних клітин МХВ. Опромінення перепелиних ембріонів МХВ GSM 900 МГц стандарту протягом перших 38 год інкубації середньою інтенсивністю 0,21 ц Вт/см2 приводило до статистично вірогідного (p<0,001) зниження одно- та двониткових розривів ДНК у клітинах 38-годинних ембріонів, що виявлено методом «ДНК-комет». Довжина хвоста та момент хвоста були удвічі меншими в дослідній групі, порівняно з контрольною (рис. 2, табл. 1).

Рис. 2. Мікрофото (х 40) ДНК комет 38-годинних перепелиних ембріонів: a -- контроль; b -- 38-годинне опромінення inovo мікрохвильовим випромінюванням GSM 900 МГц стандарту; c -- 158-годинне опромінення inovo мікрохвильовим випромінюванням GSM 900 МГц стандарту

Натомість, опромінення перепелиних ембріонів inovo протягом п'яти діб до початку та протягом перших 38 год інкубації, усього впродовж 158 год мікрохвильовим випромінюванням GSM 900 МГц стандарту, призводило до вірогідного (p<0,001) зростання одно- та двониткових розривів ДНК у клітинах 38-годинних ембріонів.

Показники довжини та моменту хвоста комет у клітинах дослідної групи ембріонів були майже вдвічі вищі за відповідні показники контрольної групи. Відсоток ДНК у хвості комет ембріональних клітин дослідної групи був на 31,2 % вищим, порівняно з контрольною групою ембріонів.

Отже, виявлено різноспрямований дозозалежний ефект опромінення перепелиних ембріонів inovo мікрохвильовим випромінюванням GSM 900 МГц стандарту на рівень ушкодження ДНК ембріональних клітин.

Пошкодження ДНК неіонізуючим випромінюванням тривалий час піддавалося сумніву. У низці робіт указується на відсутність генотоксичних ефектів МХВ. Проте існують більш ніж переконливі дані щодо генотоксичних ефектів МХВ, серед яких - зростання рівня одно- та двониткових розривів ДНК, формування мікроядер, хромосомні аберації тощо. Прояв біологічної активності МХВ залежить від багатьох факторів, починаючи від режиму та дози опромінення, закінчуючи вибором застосованої біологічної моделі. Проаналізувавши близько 100 робіт щодо генотоксичних ефектів МХВ, відзначено більш високий рівень позитивних ефектів при проведенні експериментів invivo (58 %) проти 38 % invitro. Також важливе значення має й використаний метод для оцінки генотоксичних ефектів МХВ, наприклад хромосомний аналіз, метод «ДНК-комет» та вивчення сестринських хроматидних обмінів частіше давали негативний результат, а підрахунок мікроядер частіше виявляв позитивний результат. Використання клітин кришталика людини, буккального епітелію, головного мозку гризунів та клітин крові щурів у більшості дослідів засвідчило позитивний ефект, а 100 % негативні генотоксичні ефекти виявлені за використання в експериментах у якості біологічної моделі постійних клітинних ліній мишей або лімфобластних клітин різного походження. Аналогічна залежність прояву біологічного ефекту виявлена під час вивчення дії МХВ на активність орнитин декарбоксилази, коли зміну активності ензиму спостерігали в первинній, але не у вторинній культурі нервових клітин.

Стимуляційні ефекти низькоінтенсивного МХВ, виявлені в нашому дослідженні, можна пояснити явищем гормезису. Дійсно, якщо рівень потенційно небезпечних метаболічних змін у живих клітинах контролюється захисними системами (в тому числі антиоксидантною та детоксикуючою), то дія МХВ може привести до їх активації, у результаті чого й виникає певний стимуляційний ефект опромінення. Наприклад, ця концепція може бути залучена до пояснення зменшення ДНК-ушкоджень, виявлених у нашому дослідженні при меншій дозі мікрохвильового опромінення перепелиних ембріонів. Потрібно підкреслити, що раніше подібний ефект виявлено на ДНК лімфобластів, однак доза опромінення в дослідженні варіювалась інтенсивністю випромінювання.

Щодо експериментальної моделі, використаної нами, то ембріони птахів, у певному розумінні, є класичним модельним об'єктом багатьох досліджень, що мають на меті провести оцінку дії того або іншого фактора на розвиток тваринного організму. Інтенсивна проліферація та активний метаболізм ембріональних клітин на ранніх етапах ембріогенезу робить їх надзвичайно чутливими до зовнішніх факторів різної природи, уключаючи й мікрохвильове випромінювання. Активна проліферація ембріональних клітин, очевидно, також була причиною високого рівня ДНК-пошкоджень контрольних неопромінених ембріонів.

Висновки й перспективи подальших досліджень

Отримані дані демонструють високу чутливість моделі раннього ембріогенезу перепелів до низькоінтенсивного мікрохвильового випромінювання, що проявляється в стимуляції або пригніченні сомітогенезу та зміні рівня ушкодження ДНК у клітинах 38-годинних ембріонів.

Джерела та література

1. Рольник В. В. Биология эмбрионального развития птиц / В. В. Рольник. - Ленинград : Наука, 1968. - 425 с.

2. Якименко И. Л. Влияние электромагнитного излучения мобильного телефона на сомитогенез птицы / И. Л. Якименко, Д. Хеншель, Е. П. Сидорик, А. С. Цыбулин, В. Т. Розумнюк // Доповіді НАН України. - 2011. - № 1. - С. 146-52.

3. Якименко І. Л. Регуляторна дія низькоінтенсивного видимого світла на сомітогенез птиці / І. Л. Якименко, О. С. Цибулін // Доповіді НАН України. - 2007. - № 2. - С. 163-168.

Размещено на Allbest.ru