Проблемы генетической трансформации растений. Методические подходы (обзор)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Проблемы генетической трансформации растений. Методические подходы (обзор)

Ю.В. Чесноков

The problems of genetic transformation of plants: methodic approaches (review)

Yu.V. Chesnokov

S u m m a r y

The natural transformation of plant by means of Ti- and Ri-plasmids of Agrobacterium and construction of the vectors -- the carriers of necessary determinants -- on the basis of this plasmids were discussed. The author describes the methodic approaches and different ways of genetic transformation by the vectors constructed in vitro: the genes transfer to protoplasts, direct transfer of Ti-plasmid DNA, cocultivation with Agrobacterium and spheroplasts, microinjections, electroporation and packing of DNA in liposomes. They presented the methods of microbombing of plant tissues by the particles of gold or tungsten with DNA molecules and also non-traditional methods of plants transformation. The transfer of genes by germinating pollen have received the special attention. The character of inheritance and the structure of transferred foreign genes were considered, that in itself is of great importance.

Освещены вопросы естественной трансформации растений посредством Ti- и Ri-плазмид Agrobacterium и построения на основе этих плазмид генетических векторов -- носителей желаемых признаков. Описаны методические подходы и различные способы генетической трансформации растений с помощью сконструированных in vitro векторов: перенос генов в протопласты, прямой перенос ДНК Ti-плазмид, кокультивация с Agrobacterium и сферопластами, микроинъекции, электропорация и упаковка ДНК в липосомы. Представлены методы микробомбардировки растительных тканей частицами золота или вольфрама с нанесенными на них молекулами ДНК, а также нетрадиционные методы трансформации растений. Особое внимание уделено переносу генов посредством прорастающей пыльцы. Рассматриваются характер наследования и структура перенесенных чужеродных генов в трансгенных растениях.

На сегодня одним из наиболее важных аспектов изучения действия чужеродной ДНК на растения является генетическая трансформация. Благодаря успехам генной инженерии, позволяющей in vitro получать новые рекомбинантные молекулы ДНК, эта проблема у высших организмов приобрела особую актуальность, так как без использования методов генетической трансформации невозможно конструировать новые формы эукариотов с желательными признаками и свойствами (1, 2).

Е с т е с т в е н н а я т р а н с ф о р м а ц и я р а с т е н и й п о с р е д с т в о м Ti- и Ri-п л а з м и д A g r o b a c t e r i u m. Способность Agrobacterium к трансформации растительных клеток коррелирует с присутствием в них опухолеобразующих Ti- (tumor-inducing) или Ri- (root-inducing) плазмид, у которых имеются два фрагмента, ответственные за трансформацию и вирулентность -- соответственно Т-ДНК (transfer DNA), встраивающийся в растительный геном, и vir-область. Сегмент Т-ДНК фланкирован почти полными прямыми последовательностями длиной 25 пар нуклеотидов (п.н.), благодаря которым осуществляется cis-перенос Т-ДНК и узнавание последней сайт-специфической эндонуклеазой, кодируемой virD-опероном (3, 4). Предполагают, что именно эти последовательности ответственны за встраивание Т-ДНК в растительный геном, так как в интегрированной форме этот сегмент ограничен участками, которые в составе плазмиды соседствуют с концевыми повторами. Удаление правого концевого участка Т-ДНК посредством делеционного мутагенеза Ti-плазмиды «выключает» перенос Т-ДНК в геном реципиента. В том же случае, когда в делетированный участок вводят синтетический олигонуклеотид, идентичный по последовательности концевому 25-нуклеотидному повтору Т-ДНК, в той же ориентации, что и последовательность дикого типа, вирулентность ДНК и способность интегрироваться в геном восстанавливается (3). В Т-ДНК нет других последовательностей, обусловливающих перенос, и все существенные функции последнего осуществляются in trans, причем любая последовательность ДНК, встроенная между концевыми повторами, может быть интегрирована в реципиентные растения.

Сегмент Т-ДНК способен индуцировать опухолевые образования в трансформированных растениях. Генетический анализ с использованием транспозониндуцирующих мутаций и делеций позволил выявить в составе Т-ДНК четыре локуса, обусловливающие опухолеобразование: OCS, ipt (tmr), iaaM (tms 1) и iaaH (tms 2), которые кодируют синтез ферментов -- соответственно октопинсинтетазы, изопентенилтрансферазы (участвует в биосинтезе цитокинина), триптофанмонооксигеназы и индолацетамидгидролазы (последние два участвуют в биосинтезе ауксина) (5-8). Мутации по любому из этих локусов вызывают образование побегов (shooty-мутанты), а мутации по локусу ipt -- интенсивное разрастание корней (rooty-мутанты). Эффекты, обусловленные этими мутациями при образовании опухолей, индуцированных Т-ДНК, аналогичны таковым в нетрансформированных тканях, культивируемых in vitro в среде, содержащей ауксины и цитокинины в различных концентрациях, и характерные для недифференцированной пролиферации клеток каллусной ткани растений.

Перенос Т-ДНК в геном растительной клетки связан с функционированием и некоторых других генетических локусов. Так, гены, необходимые для переноса и интеграции Т-ДНК, а также других преобразований на ранних этапах развития опухоли, видимо, локализованы в vir-области Ti-плазмид, представленной сегментом длиной около 35 тыс. п.н., расположенным влево от Т-ДНК (по общепринятой ориентации); физически сегмент Т-ДНК не прилегает к vir-области (9). Из полученных данных следует, что в пределах области, обусловливающей вирулентность, существует шесть различных оперонов: A, B, C, D, E, G. Мутации в этих локусах полностью подавляют способность вызывать опухоли. Показано, что в случае мутаций в локусах virC и virE образуется слабовирулентный фенотип (10). В нормальных условиях vir-гены экспрессируются в Agrobacterium на очень низком уровне, однако при взаимодействии бактерии с растением последний повышается, достигая максимума через 8-16 ч (11). В индукционном процессе участвуют два vir-оперона (virA и virG), что свидетельствует о взаимодействии Agrobacterium и растения (12). Лишь в присутствии растительных клеток у бактерий «включается» экспрессия собственных генов, необходимых для эксцизии Т-ДНК и ее переноса. Возможно, что индукция vir-генов может служить лимитирующим фактором эффективной трансформации некоторых видов растений (например однодольных) из-за того, что последние не могут в должной степени провоцировать собственную трансформацию бактериальной плазмидной ДНК.

Растительный фитопатоген Agrobacterium имеет довольно широкий круг хозяев (более 1 тыс. разных видов растений), вызывая опухоли у большого числа представителей голосеменных и двудольных покрытосеменных растений; однако ни одно низшее растение не является хозяином для этого фитопатогена (13). Естественной резистентностью обладают также и однодольные растения, хотя у них был обнаружен фактор, индуцирующий экспрессию vir-генов A. tumefaciens (14). Устойчивость однодольных к заражению Agrobacterium может быть обусловлена либо неспособностью к образованию перидермы и раневого каллуса, либо особой структурой клеточных стенок, затрудняющей контактирование с бактериальными клетками, необходимое для переноса Ti-плазмиды. У однодольных растений могут также существовать и дополнительные барьеры против индукции галлов, так как известно, что некоторые представители этого класса частично габитуированы в смысле гормононезависимого роста. Предполагается, что гормональный статус растения уже может служить барьером для образования корончатого галла (10).

Следовательно, из-за устойчивости однодольных растений к Agrobacterium естественная система переноса генов Ti- и Ri-плазмидами оказывается неэффективной. Поэтому возможности генно-инженерного манипулирования с однодольными растениями заключаются, с одной стороны, в разработке методов приспособления Ti-плазмидных векторных систем, а с другой, -- в поисках альтернативных методов введения чужеродной генетической информации в растительные клетки.

Генетические векторы на основе Ti-плазмид. Существующие сегодня агробактериальные векторы для трансформации растений могут быть условно разделены на две категории: интегрирующие в резистентную Ti-плазмиду (или коинтегративные) и реплицирующиеся в бактериальных клетках автономно (или бинарные). Как отмечено выше, Т-ДНК ограничена прямыми 25-нуклеотидными повторами, и других элементов, требующихся in cis для эксцизии и переноса Т-ДНК, нет. Поэтому трансформационный вектор должен содержать «граничные» последовательности или быть способным коинтегрировать таким образом, чтобы оказаться фланкированным этими последовательностями. По соседству с «граничными» последовательностями обнаружена еще одна последовательность, названная «overdrive», которая не существенна для эксцизии и переноса, но стимулирует эти процессы (15). Многие векторы содержат сегмент Ti-плазмиды, который включает и «граничную», и «overdrive» последовательности. В некоторых векторах, однако, используется только 25-нуклеотидная «граничная» последовательность, и это все же позволяет осуществлять эффективную трансформацию растений. Во всех векторах имеется бактериальный селективный маркер, а между границами сегмента Т-ДНК -- селективный маркер для идентификации и отбора трансформированных растительных клеток, тканей и/или генотипов.

Коинтегративные векторы содержат район гомологии между векторной и Ti-плазмидами, что позволяет посредством гомологичных обменов интегрировать вектор в ограниченное число Ti-плазмид. На сегодняшний день используются две коинтегративные системы. Одна представлена акцепторным вектором pGV3850, сконструированным на базе Ti-плазмиды нопалинового типа pTiC58, в которой внутренние гены Т-ДНК, определяющие онкогенность и препятствующие нормальной дифференцировке трансформированных растительных клеток, заменены последовательностью ДНК вектора pBR322 (16). Любой ген, клонированный в плазмиде pBR322 или ее производных, может быть легко встроен между граничными последовательностями Т-ДНК в результате гомологичной рекомбинации с образованием плазмидного химерного коинтеграта (рекомбинанта). Другой коинтегративный вектор был предложен Fraley с соавт. (17). В этой системе правая граница и все гены фитогормонов удалены из Ti-плазмиды, а левая граница и маленькая часть Т-ДНК, названные LIH (limited internal homology), оставлены нетронутыми, то есть вектор, вводимый в Agrobacterium, содержит реконструированную функциональную Т-ДНК с правой и левой границами. Эта система и сейчас используется для введения многих генов в растения.

Преимуществом коинтегративных систем является их стабильность в Agrobacterium: один раз созданный коинтеграт практически невозможно потерять. Бинарные векторы, напротив, не столь стабильны в Agrobacterium и легко теряются при отсутствии селекции. Это может служить объяснением тому, что в ряде опытов коинтегративный вектор обеспечивает более высокую частоту трансформации (например растений томата), чем бинарный вектор (18).

Система бинарных векторов является альтернативой коинтегративной, так как в ней используется trans-конфигурация Т-ДНК и vir-области вместо нормальной cis-конфигурации этих областей в Ti-плазмиде (19). В основе системы бинарных векторов лежит принцип физического разобщения Т-ДНК и vir-области, ответственной за перенос вектора на разные репликоны, и комплементация этих двух областей в положении trans. Поскольку бинарные векторы не нуждаются в образовании коинтегратов, их можно сравнительно легко ввести в штамм Agrobacterium, но они должны содержать «граничные» последовательности Т-ДНК. Многие векторы содержат две границы, фланкирующие Т-ДНК, хотя для переноса достаточно и одной (20). В последнем случае перенос инициируется единичной «граничной» последовательностью, и целая плазмида становится как бы Т-ДНК. Основное преимущество бинарных векторов состоит в том, что они не требуют специальной Ti-плазмиды, и могут быть введены практически в любой штамм Agrobacterium, содержащий Ti- или Ri-плазмиду с vir-областью. Это представляется важным, так как различные виды растений в разной степени инфицируются различными штаммами Agrobacterium.

М е т о д и ч е с к и е п о д х о д ы г е н е т и ч е с к о й т р а н с ф о р м а ц и и р а с т е н и й. Генетическую трансформацию посредством Agrobacterium довольно широко применяют на многих видах растений. Однако проблемы, возникающие из-за ограниченности круга хозяев Agrobacterium, заставляют искать и разрабатывать альтернативные методы переноса генов в растения.

Перенос генов в протопласты. Считается, что наиболее удобным обьектом для введения чужеродной генетической информации являются изолированные протопласты. С одной стороны, протопласты свободны от ригидной клеточной оболочки, что облегчает проникновение в них макромолекул, в том числе и экзогенной ДНК. С другой стороны, изолированные протопласты способны регенерировать в целое растение, которое можно использовать в генетических исследованиях. В ранних работах было показано, что меченая экзогенная ДНК поглощается различными растительными протопластами (21, 22). Однако по результатам этих экспериментов нельзя сделать сколько-нибудь надежное заключение относительно физического состояния поглощенной ДНК. Кроме того, следует отметить, что отсутствие соответствующих мутантов, неадекватность самой системы переноса и селективности маркеров, неэффективность методов внутриклеточного введения нуклеиновых кислот, трудности ручной работы с большим числом растительных клеток, отсутствие эффективной селекции различающихся фенотипов мешают быстрому развитию эффективных систем трансформации растительных протопластов. Тем не менее, в решении всех этих вопросов в последнее время наметились существенные сдвиги, чему в значительной степени способствовало развитие систем переноса экзогенной ДНК in vitro методами прямой трансформации, микроинъекций, электропорации, переноса, опосредованного упаковкой ДНК в липосомы, а также посредством кокультивации растительных протопластов с Agrobac-terium и их слияния со сферопластами бактерий.

Прямой перенос генов, кокультивация с Agrobacterium и сферопластами. Возможность использования в качестве клеток-мишеней отдельных растительных протопластов приближает их к таким системам, как бактериальные и дрожжевые клетки, а также клетки млекопитающих, так как в аналогичных экспериментах по трансформации протопластов миллионы отдельных клеток растений подвергаются действию ДНК экзогенного происхождения. В настоящее время исследователи предпочитают вводить в протопласты не экзогенную хромосомную ДНК, как это делалось раньше, а химерные (рекомбинантные) плазмиды, сконструированные in vitro, в том числе и на основе Ti-плазмид, так как последние являются более универсальным материалом для молекулярно-генетических манипуляций (23-25).

Частота включения в клетки экзогенной ДНК может быть повышена посредством обработки культуры клеток поликатионами, например такими, как ДЕАЕ-декстран, поли-L-лизин, поли-L-орнитин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и др. В первых экспериментах по прямому переносу ДНК Ti-плазмид в растительные протопласты частота трансформации составляла всего один трансформант на 1 млн клеток (26). В дальнейшем повышение эффективности трансформации было достигнуто благодаря использованию ПЭГ, кальций-фосфатного буфера и увеличению рН (24, 27). Эффективность прямой трансформации растительных протопластов составляла около 2,310^-4 (28). Синхронизация протопластов афидиколином позволила повысить этот показатель до 3 % от числа выживших клеток (29).

Mетод кокультивации можно рассматривать как индукцию опухолей в искусственных условиях: вирулентные штаммы Agrobacterium временно совместно культивируют с протопластами, у которых регенерируют новые клеточные стенки (30). Используя метод кокультивации, в одном опыте можно получить сотни и тысячи клонов независимого происхождения при частоте трансформации от 10^-4 до 10^-2 от числа сохранившихся протопластов. Протопласты, свежевыделенные из клеточной суспензии, при обработке сферопластами A. tumеfaciens и слиянии с ними также дают трансформированные клетки, у которых проявляется типичный опухолеобразующий фенотип -- фитогормональная независимость и синтез опинов (31). Были получены трансформированные клоны клеток табака посредством слияния протопластов со сферопластами Escherichia coli, содержащими промежуточный вектор с фрагментом Т-ДНК A. rhizogenes (32). При использовании этого способа для трансформации не требуется специального посредника типа Agrobacterium.

Микроинъекция, электропорация и упаковка ДНК в липосомы. Микроинъекцию ДНК в растительные клетки также можно отнести к методам прямого переноса. Разработка и модификация способов получения и подготовки протопластов и другие технические усовершенствования позволили осуществить перенос ДНК в растительные клетки посредством микроинъекций (33, 34). Для микроинъекций растительных клеток обычно применяют иглы из электродных трубок, внешний и внутренний диаметр которых составляет соответственно 2 и 1-1,25 мкм, примерный объем препарата -- 10^-8-10^-9 мл. Трансформация протопластов при использовании различных типов векторной ДНК происходит с достаточно высокой эффективностью и достигает 20-40 % от числа инъецированных клеток. Весьма вероятно, что усовершенствование методики инъекций позволит довести частоту трансформации до 100 %.

Электрические импульсы высокого напряжения обратимо усиливают проницаемость биомембран и поэтому применяются для индукции слияния клеток (electrofusion) и введения макромолекул (electroporation) (35, 36). Процедура электропорации оказалась высокоэффективной для растительных протопластов. Молекулы ДНК, добавляемые в среду электропорации, проникают преимущественно через поры в клеточных мембранах в процессе или сразу после электрического шока и интегрируются в клеточный геном. Затем через небольшой промежуток времени (обычно через 1 ч) наблюдается экспрессия чужеродных генов в функциональные продукты трансляции (37). Существует ряд модификаций этого метода, обусловленных необходимостью эмпирически подбирать условия трансформации для каждого конкретного объекта. Оптимизация концентрации и условий добавления ПЭГ при электропорации позволила повысить эффективность прямого переноса генов. Так, частота трансформации для протопластов Petunia hybrida составляет около 1 %, а растений табака -- 2 % (38). И хотя этот способ введения экзогенной ДНК в растительные клетки не является универсальным и широко распространенным, он, на наш взгляд, имеет достаточные потенциальные возможности для применения с целью генетической трансформации растений.

Для защиты экзогенной ДНК, вводимой в протопласты растений, используют липосомы (39). Эта система прямого переноса генетического материала имеет следующие преимущества: низкая токсичность и широкая применимость для различных видов растений; защита от нуклеаз, присутствующих в культуральной среде; высокоэффективная доставка нуклеиновых кислот в растительные протопласты. В зависимости от типа фосфолипидов липосомы могут быть положительно или отрицательно заряженными либо нейтральными, что обусловливает их взаимодействие с клетками. Существенное значение для эффективного введения генетического материала в растительные клетки с помощью липосом имеют такие факторы, как концентрация ПЭГ и ионов металлов в инкубационном буфере, рН, время инкубации липосом с протопластами, липидный состав везикул (40). С помощью липосомного метода введения нуклеиновых кислот в растительные протопласты были получены трансформированные клоны клеток табака и барвинка, из которых регенерировались растения (41, 42). Средняя частота выделения трансформированных клонов клеток составляла 410^-5. Принимая во внимание перечисленные преимущества липосомного метода трансформации, его можно рассматривать как перспективный для прямого введения чужеродных генов в геном высших растений с целью их генетического видоизменения.

Микробомбардировка и нетрадиционные методы трансформации. Проблема, связанная с регенерацией растений из клеточной культуры, может быть решена как в результате трансформации мужского и/или женского гаметофита, так и применения нетрадиционных методов трансформации, одним из которых служит способ доставки нуклеиновых кислот в живые клетки растений с помощью микропушки (43). На основе использования высокоскоростных микроядер ванадия или золота с адсорбированной на них экзогенной ДНК удалось трансформировать клетки эпидермиса лука, интактные клетки табака и кукурузы; частота трансформации составляла 2-5 % от числа выживших клеток (44, 45). Авторы предполагают, что при модификации этого метода удастся получить трансгенные растения, минуя регенерацию из протопластов. Однако достичь этого до сих пор не удалось.

Другой подход для трансформации растений злаковых, не требующий техники культуры тканей, был применен на ячмене в начале 70-х годов прошлого столетия. Авторы получили эффект трансформации под воздействием экзогенной высокомолекулярной ДНК, инъецированной в зерновки ячменя на стадии молочной спелости, и проследили наследование вновь приобретенных признаков на протяжении ряда поколений (46-49). В последующем подобные эксперименты были продолжены (50-52). Аналогичный подход применили на растениях ржи, где химерную плазмидную ДНК инъецировали в цветущие побеги (53). В этой работе постулировано, что ДНК после инъекции транспортируется растительной васкулярной системой к зародышевым клеткам, которые могут поглощать экзогенную ДНК, если они находятся в компетентной стадии. Однако частота трансформации оказалась очень низкой (около 0,07 %), и, кроме того, авторы не выяснили, есть ли адекватная стадия компетентности у других однодольных. agrobacterium фитопатоген липосома растительный

На ряде растительных объектов изучали возможность проникновения экзогенной ДНК в прорастающие семена. Так, продемонстрирована генетическая трансформация прорастающих семян ячменя плазмидной ДНК с геном -глюкуронидазы посредством электрофоретической трансфекции (54) и экспрессия гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII) в проростках 12 видов растений после инкубации и проращивания их зародышей в растворе с плазмидной ДНК, также содержащей ген NPTII (55). Повторив на более современном методическом уровне ранние работы советских исследователей (56), Schell с соавт. наметили общее направление развития методологии трансформации растений, использовав в качестве экзогенной ДНК химерный плазмидный вектор (53, 55).

Трансформация посредством пыльцы. Помимо приведенных работ, основанных на поглощении экзогенной ДНК прорастающими семенами, в последнее время особое внимание уделяется пыльце как средству и объекту генетической трансформации. Это обусловлено тем, что пыльцу легко выделить в больших количествах в виде свободных пыльцевых зерен и с ее участием можно получить целое растение в ходе обычного репродуктивного процесса. Использование пыльцы позволяет надеяться на возможность разработки простой, широко применимой методики трансформации, которая будет обходиться без этапа регенерации растений из соматических клеток in vitro (57, 58). Для одного вида растений -- Arabidopsis thaliana -- такая методика уже создана (59-61). Теперь необходимо возможности этой методики распространить и на другие виды.

Пока же для достижения эффекта трансформации пыльцу, как правило, подвергают определенной обработке в присутствии экзогенной ДНК и затем наносят на рыльца пестиков цветков. Так, была продемонстрирована возможность трансформации растений смесью пыльцы и высокомолекулярной экзогенной ДНК в гомологичной и гетерологичной системах (62-70). Для ввода экзогенной ДНК в пыльцу применяли обработку последней A. tumefaciens (67-70). В работах других авторов экзогенную плазмидную ДНК вводили в прорастающую пыльцу посредством электропорации или микроинъекций (71-74). Рассматривалась возможность частичного проращивания пыльцы в растворе экзогенной ДНК перед нанесением на рыльца (67), а также использования липосом для доставки ДНК в пыльцевые трубки (75-77). Представляют интерес и два других подхода, появившихся в конце 80-х годов XX века: микробомбардирование пыльцы частицами золота с нанесенными на них молекулами чужеродной ДНК (78); использование каналов проросших пыльцевых трубок в качестве проводников экзогенной ДНК в зародышевый мешок (79-81).

Первое сообщение о расщеплении (согласно законам Менделя) вновь приобретенных при трансформации посредством пыльцы признаков было сделано в работе, где исследовали генетические изменения у растений ржи и ячменя под воздействием препаратов тотальной ДНК, которые вводили в цветки на стадии зрелой пыльцы при замачивании целых колосьев в растворе, содержащем ДНК (82). У всех полученных растений-ревертантов по waxy-признаку вместо зазубренной ости, характерной для мутанта waxy, появлялась гладкая ость. Как известно, ген, обусловливающий зазубренность ости колосьев ячменя, локализован в седьмой хромосоме, в то время как ген waxy находится в первой. При анализе наследования вновь приобретенных признаков было выявлено, что waxy-признак и зазубренность ости наследуются независимо по классической схеме расщепления при дигибридном скрещивании -- 9:3:3:1. Эти данные достаточно убедительно свидетельствуют о возможности получения наследственных изменений у растений с помощью тотальных препаратов экзогенной ДНК, однако не дают четкого представления о механизмах генетического действия донорной ДНК.

Группе американских исследователей удалось осуществить успешный перенос плазмидной ДНК, сопровождавшийся временной экспрессией маркерных генов хлорамфениколацетилтрансферазы и -глюкуронида-зы, при электропорировании пыльцы табака (73). При этом из семян, завязавшихся на опыленных трансформированной пыльцой образцах табака, удалось получить трансгенные растения, которые экспрессировали чужеродный ген -глюкуронидазы и содержали интегрировавшую в геном последовательность экзогенной ДНК, что подтверждалось блот-гибридиза-цией по Саузерну и амплификацией с помощью ПЦР с последующим блот-гибридизационным анализом интегрированной в геном чужеродной ДНК.

Во всех вышеприведенных исследованиях акцент ставился на обработке пыльцы, которая рассматривалась в качестве супервектора для доставки необходимого генетического материала. Видимо, все же необходимо уделить большее внимание анализу экзогенной ДНК как одному из основных компонентов, используемых в этой системе трансформации, так как большинство предпринимаемых попыток трансформации растений посредством прорастающей пыльцы оканчивается неудачей. Эти неудачи можно отнести на счет как чисто механических повреждений пыльцевых зерен, прорастающих пыльцевых трубок и экзогенной ДНК, так и ДНКазной активности в инкубационной смеси, а также количественного и, возможно, качественного состава экзогенной ДНК. Пыльца (особенно прорастающая) по своим свойствам, по-видимому, приближается к таким системам, как бактериальные клетки и растительные протопласты. Поэтому не исключено, что для трансформации посредством пыльцы, так же, как и для животных клеток (83), бактерий (84) или протопластов растений (25), важны не только количество экзогенной ДНК, но и ее молекулярная масса и конформация, особенно в случае использования плазмидных векторов (1, 56, 65, 67).

Х а р а к т е р н а с л е д о в а н и я и с т р у к т у р а п е р е-н е с е н н ы х в т р а н с г е н н ы е р а с т е н и я г е н о в. Чужеродная ДНК, перенесенная в растительные клетки, обычно интегрирует в ядерный геном растений и наследуется по законам Менделя (85-90). Сайты интеграции распределяются по геному случайным образом (87, 90, 91). В большинстве случаев чужеродная ДНК интегрирует в единичный локус либо как одна копия, либо как кластер тандемных копий (89, 92). В частности, по некоторым наблюдениям, механизм интеграции Т-ДНК напоминает таковой аденовирусной ДНК в хромосомы клеток млекопитающих. Так, в одном случае между правой и левой границами нопалиновой Т-ДНК отмечено включение 22 п.н. неизвестного происхождения, а в другом, -- дуплицированные копии Т-ДНК были разделены сегментом длиной 136 п.н., состоящим из повторов как плазмидного, так и растительного происхождения (93, 94). Выявление тандемных дупликаций Т-ДНК, так же, как и множественных (до 20) единичных копий, свидетельствует о том, что перед интеграцией, вероятно, происходит амплификация Т-ДНК. Однако тандемизация может быть и следствием сайт-специфической амплификации. Присутствие множественных копий Т-ДНК не является необходимым для образования опухоли и не оказывает влияния на активность кодируемых ими ферментов, так как опухолевые линии могут содержать только одну копию интегрированной Т-ДНК (94, 95). Возможно, возникновение тандемной организации зависит от физиологического состояния растительной клетки или от области хромосомной ДНК, в которую встроилась чужеродная ДНК. Однако, как правило, такие локусы проявляются как единичный доминантный менделевский признак (96, 97). Рядом исследователей были обнаружены множественные инсерции в два или более различных сайта разных хромосом (86, 88-90, 98, 99). У гибрида Lycopersicon esculentum L. pennellii исследовали участки встраивания химерных генов, сцепление которых с тестерными маркерами было выявлено у девяти из десяти изученных трансформантов (91). При этом семь инсерций картировали по специфическим хромосомным сайтам; по одной инсерции обнаружили в первой, пятой, восьмой и двенадцатой хромосомах, три -- во второй хромосоме; две вставки -- в хромосомах L. pennellii, остальные -- в хромосомах L. esculentum; сайты интеграции еще двух вставок точно установить не удалось. Следовательно, места встраивания чужеродной ДНК не специфичны, что открывает возможность использования генетической трансформации с целью инсерционного мутагенеза (100).

Следует отметить, что доказательство факта трансформации при использовании Agrobacterium или ряда методов прямого переноса чужеродной ДНК проводили на фенотипическом, общегенетическом, биохимическом и молекулярно-генетическом уровнях. В большинстве же экспериментов по трансформации с помощью пыльцы ограничивались фенотипическим и гибридологическим анализами. Впервые эффект трансформации посредством прорастающей пыльцы был продемонстрирован на всех четырех уровнях на растениях Petunia hybrida с использованием в качестве донорной ДНК трансдуцирующего фага с геном трансферазы E. coli (101). Авторы методом блот-гибридизации по Саузерну выявили наличие чужеродного гена в ДНК растений F₄. Кроме того, на основе реципрокных скрещиваний удалось локализовать ген в хромосомной ДНК. Проведенный ранее отбор на селективной питательной среде и оценка активности ферментов позволили сделать вывод о функционировании привнесенного чужеродного гена в клетках трансгенных растений. На сегодняшний день в работах по генетической трансформации растений с помощью прорастающей пыльцы доказательство интеграции чужеродной ДНК проводят, как правило, на всех четырех уровнях вне зависимости от объекта исследований (69, 73).

Анализ характера наследования встроенных генов у различных объектов показал, что при заражении Agrobacterium Т-область в исходных трансформированных клетках находится в гетерозиготном состоянии. Наследование при самоопылении происходит, как правило, по схеме 3:1, причем число копий Т-ДНК на геном существенно различается -- от 2-3 до 10-20. При использовании методов прямого переноса ДНК однолокусное наследование у трансформантов наблюдалось только в 70-80 % случаев; в остальных вариантах химерные гены наследовались как два (6 %), три (3 %) или множественные (17 %) хромосомные локусы (90, 96, 98, 99, 102, 103).

Интегрированные чужеродные гены обычно характеризуются высокой степенью мейотической стабильности (89, 104). Авторы предполагают, что этот факт может объясняться как содержанием единичной копии Т-ДНК, так и тем, что Т-ДНК совершенно неродственна растительному геному. В то же время трансформанты могут содержать либо гомологичный ген, либо множественные копии трансформирующей ДНК. По-видимому, гомология между интегрированным функциональным геном и сопредельной донорной или реципиентной ДНК является существенным фактором, который определяет уровень мейотической нестабильности интегративных трансформантов. В результате гомологичной интеграции получаются трансформанты, которые могут содержать тандемные дупликации, включающие в себя интегрированный ген дикого типа и собственный мутантный аллель. Рекомбинация между дуплицированными сегментами ДНК, которая происходит с низкой частотой в митозе и высокой в мейозе, производит элиминацию и инактивацию гена дикого типа, причем эксцизия является результатом неравного кроссинговера или внутрихромосомной реципрокной рекомбинации, а инактивация -- генной конверсии (105). Эта модель предполагает, что негомологичная интеграция может быть более стабильной, чем гомологичная. Коинтеграция видоизмененных, нефункциональных генных копий, как правило, сопровождается мейотической нестабильностью функциональных генов (99, 106). Однако, как было показано для высших растений, экзогенная ДНК после введения в клетку часто подвергается конкатемеризации, делетированию или инактивации (например метилированию), в результате чего и образуется большое количество мейотически нестабильных трансформантов (28, 107). Низкая степень нестабильности наблюдается не только для единичной копии, но и для тандемных повторов Т-ДНК, содержащих немодифицированные, функциональные копии родственных генов. Наиболее оптимальными в этом отношении, по-видимому, являются бинарные векторы, так как они позволяют избежать интеграции в геном нетранслируемых баластных последовательностей (89, 104).

Помимо исследования интеграции чужеродного гена в хромосомы ядра, была проанализирована трансформация экзогенной ДНК в цитоплазму хлоропластов и выявлен неменделевский тип цитоплазматического наследования (86).

Саузерн-блот-гибридизационный анализ трансформантов и их потомства показал, что копии чужеродных генов часто делетируются, тандемеризуются или реорганизуются, то есть подвергаются перестройкам, которые приводят к образованию нефункциональных копий и изменению числа интегрированных генов (107, 108). Возможным фактором, определяющим число копий, интегрирующих в растительный геном, может служить тип растительных клеток или условия, в которых проходит трансформация или осуществляют селекцию и регенерацию трансформантов (99, 109). Образование инвертированных повторов тоже приводит к различного рода перестройкам, которые относят на счет репликации и/или процесса лигирования, происходящего перед интеграцией чужеродной ДНК в геном (110, 111). Растительная реципиентная ДНК также может перестраиваться во время интеграции экзогенной ДНК (89, 90, 112).

Следовательно, в процессе интеграции как донорная, так и реципиентная ДНК могут претерпевать различные модификации. Однако интегрированная чужеродная ДНК, как правило, проходит через мейоз и может стабильно наследоваться, что само по себе уже имеет важное научно-практическое значение (113).

Таким образом, существующий естественный процесс опухолеобразования у растений с помощью генно-инженерных преобразований может быть (и был) превращен в способ доставки в растения чужеродных генов, имеющих народно-хозяйственное значение. Всего на сегодняшний день разработано около трех десятков методов трансформации растений; арсенал методов, используемых при создании исходного селекционного материала, постоянно пополняется (114). Все разработанные методы основываны на стабильной интеграции одной или нескольких копий чужеродного гена в геном растения-реципиента. Такая интеграция чужеродной ДНК приводит к изменению исходного генотипа растений, что является предметом спора о целесообразности применения генно-инженерных манипуляций и возможности биологической угрозы со стороны генетически модифицированных организмов (ГМО). Безусловно, можно спорить о целесообразности или нецелесообразности применения генно-инженерной модификации растений и ГМО в целом, но нет сомнений в том, что использование генетической трансформации растений в практических целях приведет к получению генотипов с новыми или улучшенными агрономическими характеристиками.

Л И Т Е Р А ТУ Р А

К а р т е л ь Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. Минск, 1989.

P o t r y k u s I. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1991, 42: 205-225.

W a n g K., H e r r e r a - E s t r e l l a L., V a n M o n t a g u M. e.a. Right 25-bp terminus of the nopaline T-DNA is essential for and determinus direction of DNA from Agrobacterium to the plant genome. Cell, 1984, 38, 2: 455-462.

Y a n o f s k y M.F., P o r t e r S.G., Y o u n g C. e.a. The virD operon of Agrobacterium tumefaciens encodes a site-specific endonuclease. Cell, 1986, 47, 3: 471-477.

B a r r y G.F., R o g e r s S.G., F r a l e y R.T. e.a. Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 15: 4776-4780.

T h o m a s h o w M.F., H u g l y S., B u c h h o l z W. e.a. Molecular basis for the auxin independent phenotype of crown gall tumor tissue. Science, 1986, 231, 4738: 616-618.

S c h r o d e r G., W a f f e n s c h m i d t S., W e i l e r E.W. e.a. The T-region of Ti plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid. Eur. J. Biochem., 1983, 138, 2: 387-391.

T h o m a s h o w L.S., R e e v e s S., T h o m a s h o w M.F. Crown gall oncogenesis: evidence that a T-DNA gene from the Agrobacterium Ti plasmid pTiA6 encodes an enzyme that catalyzes synthesis of indoleacetic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 16: 5071-5075.

S t a c h e l S.E., N e s t e r E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., 1985, 5, 7: 1445-1454.

П и р у з я н Э.С., А н д р и а н о в В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. М., 1985.

S t a c h e l S.E., M e s s e n s E., V a n M o n t a g u M. e.a. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature, 1985, 318, 6047: 624-629.

S t a c h e l S.E., Z a m b r y s k i P. VirA and virG control the plant induced activation of the T-DNA transfer process of Agrobacterium tumefaciens. Cell, 1986, 46, 3: 325-333.

К н а у ф В., Я н о ф с к и М., Г о р д о н М. и др. Генетический анализ специфичности круга хозяев у Agrobacterium. В сб.: Молекулярная генетика взаимодействия бактерий с растениями. М., 1988: 264-271.

U s a m i S., O k a m o t o S., T a k e b e I. e.a. Factor inducing Agrobacterium tumefaciens vir gene expression is present in monocotyledonous plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 11: 3748-3752.

P e r a l t a E.G., H e l l m i s s R., R e a m W. Overdrive a T-DNA transmission enhanser in the A. tumefaciens tumer-inducing plasmid. EMBO J., 1986, 5: 1137-1142.

Z a m b r y s k i P., J o o s H., G e n e t e l l o C. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J., 1983, 2, 12: 2143-2150.

F r a l e y R.T., R o g e r s S.G., H o r s c h R.B. The SEV system: a new disarmed Ti plasmid vector for plant transformation. Bio/Technology, 1985, 3: 629-635.

M c C o r m i c k S., N i e d e r m e y e r J., F r y J. Leaf disk transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Repts., 1986, 5, 2: 81-84.

H o e k e m a A., H i r s c h P.R., H o o y k a a s P.J. e.a. A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium. Nature, 1983, 303, 5913: 179-181.

H o r s c h R.B., K l e e H.J. Rapid assay of foreign gene expression in leaf discs transformed by Agrobacterium tumefaciens: role of T-DNA borders in the transfer process. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 12: 4428-4432.

O h y a m a K., G a m b o r g O.L., M i l l e r R.A. Uptake of exogenous DNA by plant protoplasts. Can. J. Botany, 1972, 50, 10: 2071-2080.

Г л е б а Ю.Ю., Х а с а н о в М.М., С л ю с а р е н к о А.Г. Проникновение ³Н-ДНК Bacillus subtilis в изолированные протопласты клеток табака Nicotiana tabacum. Докл. АН СССР, 1974, 219, 4-6: 1478-1481.

M a r t o n L., W u l l e m s G.J., L u r q u i n P.F. Crown gall transformation of tobacco protoplasts by Ti plasmid DNA of Agrobacterium tumefaciens. 5th Intrl. Prot. Symp. Szeget, 1979(a): 136.

K r e n s F.A., M o l e n d i j k L., W u l l e m s G.J. e.a. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti plasmid DNA. Nature, 1982, 296, 5892: 72-74.

P a s z k o w s k i J., S h i l l i t o R.D., S a u r s M. Direct gene transfer to plants. EMBO J., 1984, 3, 12: 2717-2722.

П и р у з я н Э.С. Основы генетической инженерии растений. М., 1988.

В у л л е м с Г., К р е н с Ф., С х и л ь п е р о р т Р. Трансформация растительных протопластов клетками Agrobacterium tumefaciens и ДНК ее Ti-плазмиды. В сб.: Молекулярная генетика взаимодействия бактерий с растениями. М., 1988: 300-311.

H a i n R., S t a b e l P., C z e r n i l o f s k y A.P. Uptake, integration, expression and genetic transformation by plant protoplasts. Mol. Gen. Genet., 1985, 199, 2: 161-168.

M e y e r P., W a l g e n b a c h E., B u s s m a n n K. Synchronized tobacco protoplasts are efficiently transformed by DNA. Mol. Gen. Genet., 1985, 201, 3: 513-518.

M a r t o n L., W u l l e m s G., M o l e n d i j k K.J. In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature, 1979(b), 277, 5692: 129-131.

H a s e z a w a S., N a g a t a T., S y o n o K. Transformation of vinca protoplasts mediated by Agrobacterium spheroplasts. Mol. Gen. Genet., 1981, 182, 2: 206-210.

H a i n R., S t e n b i s s H.-H., S c h e l l J. Fusion of Agrobacterium protoplasts -- direct gene transfer from microorganism to higher plant. Plant Cell Reports., 1984, 3, 1: 60-64.

П а с т е р н а к Т.П., М е л ь н и к о в П.В., Г л е б а Ю.Ю. Генетическая трансформация клеток высших растений с помощью микроинъекций ДНК. Изв. АН СССР, 1986, 2: 314-316.

C r o s s w a y A., D a k e s J., I r v i n e J. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet., 1986, 202, 2: 179-185.

Z i m m e r m a n n U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochem. et Biophys. Acta, 1982, 694, 2: 227-277.

T i a n Y o w T s o n g. Voltage modulation of membrane permeability and energy utilization in cells. Biosci. Repts., 1983, 3, 6: 487-505.

F r o m m M., T a y l o r L., W a l b o t V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 17: 5824-5828.

S h i l l i t o R.D., S a u l M.W., P a s z k o w s k i J. High efficiency direct gene transfer to plants. Biotechnology, 1985, 3: 1099-1103.

L u r q u i n P.F. Binding of plasmid loaded liposomes to plant protoplasts: validity of biochemical methods to evaluate the transfer of exogenous DNA. Plant Sci. Letteres, 1981, 21, 1: 31-40.

F r a l e y R.T., H o r s c h R.B. In vitro plant transformation systems using liposomes and bacterial co-cultivation. In: Genetic Engineering of Plants: an Agricultural Perspective /Eds. T. Kosuge, C. Meredith, A. Hollander. N.Y., 1983: 177-194.

D e s h a y e s A., H e r r e r a - E s t r e l l a L., C a b o c h e M. Liposome-mediated transformation of tobacco mesophyll protoplasts by an Escherichia coli plasmid. EMBO J., 1985, 4, 11: 2731-2737.

Н а г а т а Т. Липосомы в качестве переносчиков Ti-плазмид в протопласты. В сб.: Молекулярная генетика взаимодействия бактерий с растениями. М., 1988: 293-299.

K l e i n T.M., W o l f E.D., W u R. e.a. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 1987, 327, 6117: 70-73.

K l e i n T.M., F r o m m M.E., W e i s s e n g e r A. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988(a), 85, 12: 4305-4309.

K l e i n T.M., H a r p e r E.C., S v a b Z. Stable genetic transformation of intact Nicotiana cells by the particle bombardment process. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988(b), 85, 22: 8502-8505.

Т у р б и н Н.В., С о й ф е р В.Н., К а р т е л ь Н.А. Генетическое изменение признака waxy у ячменя под влиянием экзогенной ДНК дикого типа. С.-х. биол., 1974, 9, 6: 204-215.

Т у р б и н Н.В., С о й ф е р В.Н., К а р т е л ь Н.А. Проверка возможности осуществления генетической трансформации у растений при использовании ДНК той же линии. Докл. ВАСХНИЛ, 1975, 12: 4-5.

T u r b i n N.V., S o y f e r V.N., K a r t e l N.A. Genetic modification of the waxy character in barley under the action of exogenous DNA of the wild variety. Mutat. Res., 1975, 27, 1: 59-68.

S o y f e r V.N., K a r t e l N.A., C h e k a l i n N.M. Genetic modification of the waxy character in barley after an injection of wild type exogenous DNA. Analysis of the second seed generation. Mutat. Res., 1976, 36, 4: 303-310.

S o y f e r V.N. Hereditary variability of plants under the action of exogenous DNA. Theor. Appl. Genet., 1980, 58, 5: 225-235.

Z h o u G.-Y. Genetic manipulation of the ovule after pollination. In: The Experimental Manipulation of Ovule Tissues /Eds. G.P. Chapman, S.H. Mantell, R.W. Daniels. N.Y., London, 1985: 240-250.

Z h o u G.-Y., W a n g J., Z e n g Y. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Methods in Enzymology, 1983, 101: 433-481.

D e l a P e n a A., L o r z H., S c h e l l J. Transgenic rye plants obtained by injecting DNA into young floral tillers. Nature, 1987, 325, 6101: 274-276.

A h o k a s H. Transfection of germinating barley seed electroforetically with exogenous DNA. Theor. Appl. Genet., 1989, 77, 4: 469-472.

T o p f e r R., G r o n e n b o r n B., S c h e l l J. e.a. Uptake and transient expression of chimeric genes in seed-derived embryos. Plant Cell., 1989, 1, 1: 133-139.

К а р т е л ь Н.А. Эффекты экзогенной ДНК у высших растений. Минск, 1981.

Ч е с н о к о в Ю.В. Перенос чужеродных генов в зародышевый мешок высших растений посредством прорастающей пыльцы. Биополимеры и клетка, 1992, 8, 2: 53-58.

Ч е с н о к о в Ю.В. Наследственные изменения, вызванные переносом экзогенной ДНК в высшие растения посредством прорастающей пыльцы. Докт. дис. СПб, 2000.

C l o u g h S.J., B e n t A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 1998, 16(6): 735-743.

Y e G.N., S t o n e D., P a n g S.Z. e.a. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. Plant J., 1999, 19(3): 249-257.

C h u n g M.H., C h e n M.K., P a n S.M. Floral spray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenic plants. Transgenic Res., 2000, 9(6): 471-476.

H e s s D. Investigation on the intra- and interspecific transfer of anthocyanin genes using pollen as vectors. Z. Pflanzenphysiology, 1980, 98, 4: 321-337.

O h t a Y. High-efficiency genetic transformation of maize by a mixture of pollen and exogenous DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 3: 715-720.

H e s s D. Genetic effects in Petunia hybrida induced by pollination with pollen treated with Lac tranducing phages. Z. Pflanzenphysiol., 1978, 90, 2: 119-132.

D e W e t J.M.J., D e W e t A.E., B r i n k D.E. Gametophyte transformation in maize (Zea mays, Gramineae). In: Biotechnology and Ecology of Pollen /Eds. D.L. Mulcahy, G.B. Mulcahy, E. Ottaviano. N.Y., 1986: 59-64.

И л ч о в с к а М.М., Х р и с т о в К.Н., М а р и н о в а Е.И. Наследственная изменчивость кукурузы, индуцированная экзогенной ДНК теосинте. Физиол. и биохим. культ. раст., 1992, 24, 3: 241-248.

S a n f o r d J.C., S k u b i k K.A. Attemped pollen-mediated transformation using Ti-plasmids. In: Biotechnology and Ecology of Pollen /Eds. D.L. Mulcahy, G.B. Mulcahy, E. Ottaviano. N.Y., 1986: 71-76.

H e s s D., D r e s s l e r K. Tumor transformation of Petunia hybrida via pollen co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. Bot. Acta., 1989, 102, 3: 202-207.

H e s s D., D r e s s l e r K., N i m m r i c h t e r R. Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Sci., 1990, 72, 2: 233-244.

П у х а л ь с к и й В.А., С м и р н о в С.П., К о р о с т ы л е в а Т.В. и др. Генетическая трансформация пшеницы (Triticum aestivum L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens. Генетика, 1996, 32, 11: 1596-1600.

N e g r u t i u I., H e b e r l e - B o r s E., P o t r y k u s I. Attempts to transform for kanamycin-resistance in mature pollen of tobacco. In: Biotechnology and Ecology of Pollen /Eds. D.L. Mulcahy, G.B. Mulcahy, E. Ottaviano. N.Y., 1986: 65-70.

M a t t h e w s B.F., A b d u l - B a k i A.A., S a u n d e r s J.A. Expression of foreigh gene in electroporated pollen species. Sexual Plant Reproduction, 1990, 3, 3: 147-151.

S m i t h C.R., S a u n d e r s J.A., V a n W e r t S. Expression of GUS and CAT activities using electrotransformed pollen. Plant Science, 1995, 104, 1: 49-58.

H e p h e r A., S h e r m a n A., G a t e s P. e.a. Microinjection of the gene vectors into pollen and ovaries as a potential means of transforming whole plants. In: The Experimental Manipulation of Ovule Tissues /Eds. G. Chapman, S. Mantell, R. Daniels. N.Y. London, 1985: 52-63.