Жовчнокислотний спектр жовчі самців щурів при дії L-цистеїну

Размещено на http://www.allbest.ru/

Жовчнокислотний спектр жовчі самців щурів при дії L-цистеїну

Юлія Левадянська, Євдокія Решетнік, Станіслав Весельський, Петро Янчук

У гострих дослідах на щурах-самцях показано, що введення Ь-цистеїну (20 мг/кг, внутрішньопортально) зменшує вміст глікокон'югатів та вільних жовчних кислот і збільшує концентрацію таурокон'югатів у жовчі.

Припускається, що екзогенне надходження амінокислоти створило умови для більш ефективного синтезу таурину із залученням його до реакцій кон'югації, однак зумовило Н^-опосередкований пригнічувальний ефект на кисеньзалежні процеси при синтезі та транслокації окремих фракцій жовчних кислот через мембрани гепатоцитів.

Ключові слова: L-цистеїн, таурокон'юговані жовчні кислоти, жовч, печінка, сірководень.

Желчекислотный спектр желчи самцов крыс при воздействии L-цистеина.

Левадянская Юлия, Решетник Евдокия, Весельский Станислав, Янчук Петр.

В острых опытах на лабораторных крысах-самцах показано, что при внутрипортальном введении L-цистеина в дозе 20 мг/кг уменьшалось содержание глико- коньюгатов и свободных желчных кислот в желчи. При этом концентрация тауроконьюгатов в желчи крыс увеличивалась. На основании полученных результатов предполагается, что экзогенное поступление аминокислоты в организм животных создало условия для более эффективного синтеза таурина и, соответственно, его вовлечение в процесс коньюгации с желчными кислотами. Однако понижение концентраций остальных фракций холатов может свидетельствовать о Н^-опосредованном угнетающем эффекте L-цистеина на кислородзависимые процессы при синтезе и транслокации отдельных фракций желчных кислот через мембраны гепатоцитов.

Ключевые слова: L-цистеин, тауроконьюгированные желчные кислоты, желчь, печень, сероводород.

Spectrum of Bile Acids in the Bile of Male rats After the Administration of L-cysteine.

Levadianska Yliya, Reshetnik Evdokiya, Veselsky Stanislav, Yanchuk Petro

In acute experiments on laboratory male rats it was shown that after intraportal administration of L-cysteine in a dose of 20 mg per kg, the content of glycoconjugated bile acids and free bile acids in bile decreased. But the concentration of tauroconjugated bile acids in rat's bile increased. Based on the obtained results, it is assumed that the exogenous intake of the amino acid has created the conditions for more efficient synthesis of taurine and, accordingly, its involvement in the process of conjugation with bile acids. However, a drop in the concentrations of other fractions of the cholates may indicate an H₂S-mediated inhibitory effect of L-cysteine on oxygen-dependent processes such as the synthesis of bile acids and their conjugation with glycine.

Key words: L-cysteine, tauroconjugated bile acids, bile, liver, hydrogen sulphide.

сірководень цистеїн холат жовчнокислотний

Постановка наукової проблеми та її значення

L-цистеїн - сірковмісна амінокислота, що характеризується високою регуляторною активністю своїх метаболітів, серед яких газовий трансмітер сірководень (H₂S) вирізняється особливо широким спектром біологічних ефектів. Ендогенний синтез H₂S відбувається з L-цистеїну за допомогою трьох ферментів, цистатіон-Р-синтази (CBS), цистатіон-у-ліази (CSE) та 3-меркаптопіруватсульфуртрансферази (3MST) [1; 2]. Як вторинний посередник та нейротрансмітер H₂S [3] залучений до регуляції ангіогенезу й судинного тонусу [4; 5], проліферації та апоптозу гладеньком'язових клітин судин [2; 6], виявляє антиоксидантні [3], про- та протизапальні властивості, а також впливає на секреторні процеси [7]. H₂S відіграє важливу регуляторну роль у гепатобіліарній системі, а експресія основних ферментів його синтезу (CBS і CSE) виявлена як у гепатоцитах [8], так і в тканині жовчного міхура [7]. H₂S здатний модулювати екскресію бікарбонатів у жовч, тим самим упливаючи на незалежний від жовчних кислот процес утворення жовчі [9].

При цьому слід відзначити, що вторинні жовчні кислоти (дезоксихолева та літохолева), активуючи G-протеїн зв'язані рецептори жовчних кислот типу 1 (GPBAR1), підвищують експресію та активацію CSE, а також продукцію сірководню, викликаючи вазодилатацію [10; 11]. Крім того, у літературі є дані про те, що жовчні кислоти регулюють експресію CSE в печінці за механізмом, опосередкованим через фарнезоїд X рецептори (FXR) [8]. Однак відкритим залишається питання наявності регуляторного впливу сірководню на процеси синтезу, секреції та біотрансформації жовчних кислот.

Мета й завдання статті. Мета нашої роботи - з'ясувати особливості впливу попередника сірководню L-цистеїну на жовчнокислотний спектр жовчі щурів, а завдання - за допомогою методу тонкошарової хроматографії в гострих дослідах дослідити динаміку змін концентрації різних холатів у жовчі самців-щурів при внутрішньопортальному введенні L-цистеїну.

Методика

Досліди проведені на білих щурах-самцях (250-280 г, n=14), наркотизованих тіопенталом натрію (в/о, 70 мг/кг), у яких здійснювали лапаротомію й канюлювання жовчної протоки для збору проб жовчі. Після відбору проби № 1 (вихідний рівень) тваринам уводили L-цистеїн (20 мг/кг, внутрішньопортально) і збирали ще 5 півгодинних проб печінкового секрету. Контролем слугувала група з внутрішньопортальним уведенням фізіологічного розчину (1 мл/кг). Методом тонкошарової хроматографії в зібраній жовчі визначали концентрації окремих фракцій холатів: таурохолевої (ТХК), таурохенодезоксихолевої (ТХДХК) та тауродезоксихолевої (ТДХК), глікохолевої (ГХК), глікохенодезоксихолевої (ГХДХК) і глікодезоксихолевої (ГДХК), холевої (ХК), хенодезоксихолевої (ХДХК) та дезоксихолевої (ДХК) кислот [12]. Після фарбування зразків кількісне визначення вмісту компонентів жовчі здійснювали за допомогою вітчизняного денситометра ДО-1М (7=620 нм) за калібрувальними кривими. Концентрацію жовчних кислот у пробах жовчі розраховували у мг%. Статистичну обробку даних проводили з використанням пакету STATISTICA 7.0 (Stat-Soft, USA). Перевірку на нормальність здійснювали за критерієм Шапіро-Вілка, розподіл був відмінний від нормального. Тому результати досліджень подані у вигляді медіани та верхнього й нижнього квартилів (Ме [25 %; 75 %]). Вірогідними вважалися відмінності при р < 0,05.

Виклад основного матеріалу й обґрунтування отриманих результатів дослідження

Виявлено, що внутрішньопортальне введення L-цистеїну викликає різноспрямовані зміни концентрацій різних фракцій жовчних кислот у жовчі щурів. L-цистеїн у дозі 20 мг/кг зумовлює вірогідне підвищення концентрації три- й дигідроксихоланових таурокон'югатів, у той час як уміст три- та дигідроксихо- ланових глікокон'югатів статистично достовірно зменшується відносно вихідного рівня відповідних жовчних кислот. Так, максимальне зростання концентрації ТХК - на 7,3 % (р<0,05) вище за вихідний рівень концентрації відповідної жовчної кислоти, відмічено в четвертій півгодинній пробі. Концентрація ТДХК і ТХДХК найістотніше збільшується в третій півгодинній пробі, а саме на 17,9 % (р<0,05) відносно вихідного рівня. Уміст глікохолатів вірогідно знижувався, починаючи з четвертої півгодинної проби й досягав максимуму змін в останній - шостій - півгодинній пробі. Так, для фракції глікохолевої кислоти це зниження складало 38,5 % (р<0,05), а для дигідроксихоланових глікокон'югатів - 53,1 % (р<0,05) відносно вихідного рівня (табл. 1).

Таблиця 1 Концентрація кон'югованих жовчних кислот у жовчі щурів-самців (мг %) у контролі (п=7)та після внутрішньопортального введення Ь-цистеїну (20 мг/кг) (п=7), Ме [25 %; 75 %]

Примітка. *-- р < 0,05; ** - р < 0,01 - відносно контролю; # - р < 0,05 - відносно вихідного рівня (концентрація жовчної кислоти в півгодинній пробі жовчі, отриманій до введення досліджуваної сполуки).

Крім того, спостерігалося статистично значуще зростання на 90,3 % (р<0,05) коефіцієнта, що відображає співвідношення тауро- до глікокон'югатів, у п'ятій півгодинній пробі - печінкового секрету відносно вихідного рівня, а також на 54,2 % (р<0,05) - відносно контролю. Такі значні зміни зумовлені не лише зростанням вмісту таурокон'югатів, а й значним зменшенням концентрації глікокон'югатів у жовчі щурів. Зважаючи на те, що саме таурохолати знижують ризик виникнення жовчно- кам'яної хвороби [13; 14], отримані результати свідчать про здатність Ь-цистеїну в дозі 20 мг/кг зменшувати літогенність жовчі (рис. 1).

Рис. 1. Коефіцієнт співвідношення тауро- до глікокон'югатів у жовчі щурів-самців за дії Ь-цистеїну в дозі 20 мг/кг) (п=7) та в контролі (п=7), Ме [25 %; 75 %]

Примітка. *- р < 0,05 - відносно контролю; # - р < 0,05 - відносно вихідного рівня (концентрація жовчної кислоти в півгодинній пробі жовчі, отриманій до введення досліджуваної сполуки).

Зміни вмісту вільних жовчних кислот у жовчі щурів після внутрішньопортального введення Ь-цистеїну в дозі 20 мг/кг так само, як і кон'югованих холатів, були різноспрямовані. Так, концентрація холевої кислоти достовірно зростала в другій півгодинній пробі на 9,9 % (р<0,05) відносно її вихідного рівня. У той час уміст дигідроксихоланових жовчних кислот зменшувався, починаючи з третьої півгодинної проби, і досягав мінімуму в шостій півгодинній пробі, знижуючись на 39,4 % (р<0,05) відносно вихідного рівня (табл. 2).

Таблиця 2 Концентрація вільних жовчних кислот у жовчі щурів-самців (мг %) у контролі (п=7)та після внутрішньопортального введення Ь-цистеїну (20 мг/кг) (п=7), Ме [25 %; 75 %]

Примітка. *-- р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 - відносно контролю; # - р < 0,05 - відносно вихідного рівня (концентрація жовчної кислоти в півгодинній пробі жовчі, отриманій до введення досліджуваної сполуки).

Поряд із цим у контрольній групі тварин із внутрішньопортальним уведенням фізіологічного розчину (1 мл/кг) спостерігалося зменшення концентрацій усіх фракцій холатів. Для фракцій гліко- й таурокон'югатів максимум реакції виникав в останній півгодинній пробі, а саме вміст ТХК знизився на 9,8 %, ТДХК+ТХДХК - на 16,1 %, ГХК - на 11,1 % і ГДХК+ГХДХК - на 15,6 % (р<0,05) відносно вихідного рівня (табл. 1). Концентрація вільних жовчних кислот у жовчі щурів максимально зменшувалася в другій півгодинній пробі: ХК - на 6,8 % та ДХК+ХДХК - на 6,6 % (р<0,05) відносно вихідного рівня (табл. 2).

Отже, отримані нами результати свідчать про те, що Ь-цистеїн у дозі 20 мг/кг викликає зменшення вмісту в печінковому секреті всіх фракцій жовчних кислот, окрім таурокон'югатів. Такий ефект цієї амінокислоти, імовірно, пов'язаний із тим, що основним шляхом ендогенної продукції таурину в ссавців є декарбоксилювання продукту окиснення Ь-цистеїну - цистеїнсульфінової кислоти [15]. Додаткове надходження до організму Ь-цистеїну при його внутрішньопортальному введенні в експерименті створює умови для більш ефективного синтезу таурину, а отже, і його використання в реакції кон'югації в гепатоцитах.

Цікаво те, що зменшення концентрації глікокон'югатів було більш вираженим, ніж збільшення вмісту таурокон'югатів. Зазначимо, що кон'югація - завершальний етап біосинтезу жовчних кислот, який відбувається за участі мікросомальних і цитозольних ферментів із використанням енергії АТФ та в присутності НАД, АМФ, Мц²⁺, КоА [16; 17]. Процес утворення первинних жовчних кислот так само, як і їх кон'югація з таурином чи гліцином, є кисеньзалежними процесами [18]. Зважаючи на те, що Ь-цистеїн є попередником Н₂8, газового трансмітера, який впливає на здатність тканин споживати кисень [19; 20], можна припустити, що при екзогенному введенні Ь-цистеїну в дозі 20 мг/кг уміст сірководню в тканині печінки досягав концентрації, що справляє Н₂8-опосередкований пригні- чувальний ефект на тканинне дихання, а отже, і на кисеньзалежні процеси в гепатоцитах.

Згідно з літературними даними, таурохолева кислота стимулює бактеріальне 7-а-дегідроксилювання холевої кислоти в кишечнику з утворенням вторинної дезоксихолевої жовчної кислоти, що пов'язано з перетворенням таурину до И₂8, який є необхідним фактором росту для 7-а-дегідроксилючих бактерій [21]. Однак, за результатами проведеного нами дослідження, Ь-цистеїніндуковане зростання вмісту таурокон'югатів супроводжувалося зменшенням концентрації фракції хенодезоксихолевої й дезоксихолевої кислот у жовчі самців-щурів. При цьому концентрація таурохолевої кислоти зросла менш суттєво, ніж концентрація дигідроксихоланових таурокон'югатів.

Отже, при внутрішньопортальному введенні Ь-цистеїну (20 мг/кг) спостерігали зменшення вмісту вільних жовчних кислот і жовчних кислот, кон'югованих із гліцином, з одночасним підвищенням концентрації таурокон'югатів у печінковому секреті. Ці результати дають підставу припустити, що екзогенне надходження амінокислоти створило умови для більш ефективного синтезу таурину із залученням його до реакцій кон'югації, однак зумовило Н₂8-опосередкований пригнічувальний ефект на кисеньзалежні процеси при синтезі та транслокації окремих фракцій жовчних кислот через мембрани гепатоцитів.

Поряд із цим відкритим залишається питання наявності дозозалежних ефектів Ь-цистеїну та більш детальне дослідження біохімічних механізмів дії амінокислоти на процеси синтезу, транспорту, біотрансформації жовчних кислот й фізико-хімічні властивості жовчі, а також з'ясування наявності взаємного зворотного зв'язку між рівнем сірководню в портальному руслі та концентрацією холатів у печінковому секреті.

Джерела та література

1. Taabazuing C.Y. Oxygen sensing strategies in mammals and bacteria / C.Y. Taabazuing, J.A. Hangasky, M.J. Knapp // J. InorgBiohem. - 2014. - Vol. 133. - P. 63-72.

2. Osmond J.M. Modulation of hydrogen sulfide by vascular hypoxia / J.M. Osmond, N.L. Kanagy // Hypoxia (Auckl). - 2014. - Vol. 2. - Р. 117-126.

3. Modis K. Hydrogen sulfide in cell signaling, signal transduction, cellular bioenergetics and physiology in C. elegans / K. Modis, K. Wolanska, R. Vozdek // Gen. Physiol. Biophys. - 2013. - Vol. 32(1). - P. 1-22.

4. Coletta C. Regulation of Vascular Tone, Angiogenesis and Cellular Bioenergetics by the 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase/H2S Pathway: Functional Impairment by Hyperglycemia and Restoration by DL-a-Lipoic Acid. / C. Coletta, K. Mйdis, B. Szczesny [et all.] // Mol. Med. - 2015. - Vol. 18. - P. 1-14.

5. Beltowski J. Hydrogen sulfide and endothelium-dependent vasorelaxation / J. Beltowski, A. Jamroz- Wisniewska // Molecules. - 2014. - Vol. 19(12) - Р. 21183-99.

6. Yang G. H2S and Blood Vessels: An Overview / G. Yang, R. Wang // Handb. Exp. Pharmacol. - 2015. - Vol. 230. - P. 85-110.

7. Zhang L. Enhanced expression of cystathionine p-synthase and cystathionine y-lyase during acute cholecystitis- induced gallbladder inflammation / L. Zhang, C. Pan, B. Yang [et all.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(12). - Р. 10-25.

8. Renga B. Bile-acid-activated farnesoid X receptor regulates hydrogen sulfide production and hepatic microcirculation / B. Renga, A. Mencarelli, M. Migliorati [et all.] // World J Gastroenterol. - 2009. - Vol. 15(17). - Р. 2097-108.

9. Fujii K. Hydrogen sulfide as an endogenous modulator of biliary bicarbonate excretion in the rat liver. / K. Fujii, T. Sakuragawa, M. Kashiba [et all.] // Antioxid. Redox. Signal. - 2005. - Vol. 7(5-6). - P. 788-794.

10. Renga B. Cystathionine y-lyase, a H2S-generating enzyme, is a GPBAR1-regulated gene and contributes to vasodilation caused by secondary bile acids / B. Renga, M. Bucci, S. Cipriani [et all.] // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2015. - Vol. 309(1) - Р. 114-26.

11. Fiorucci S. Decoding the vasoregulatory activities of bile acid-activated receptors in systemic and portal circulation: role of gaseous mediators. / S. Fiorucci. - London, 2000.

12. А.с. 4411066/14 СССР, МБИ G 01 N33/50. Способ определения желчных кислот в биологических гидкостях / С.П. Весельский, П.С. Лященко, И.А. Лукьяненко (СССР). - № 1624322; заявл. 25.01.1988; опубл.30.01.1991, Бюл. № 4.

13. Tripodi A.S. Pharmacological studies on taurohyodeoxycholic acid. / A.S. Tripodi, S. Contos, R. Germogli // Arzneimittelforschung. - 1993. - Vol. 43(8). - P. 877-8780.

14. Pasternak A. Biliary Polyunsaturated Fatty Acids and Telocytes in Gallstone Disease / A. Pasternak, J. Bugajska, M. Szura [et al.] // Cell Transplant. - 2017. - Vol. 26(1). - P. 125-133.

15. Jurkowska H. Propargylglycine inhibits hypotaurine/taurine synthesis and elevates cystathionine and homocysteine concentrations in primary mouse hepatocytes / H. Jurkowska, M. H. Stipanuk, L. L. Hirschberger [et all.] // Amino. Acids. - 2015. - Vol. 47(6). - P. 1215-1223.

16. Marschall H. U. Conjugation of bile acids. / H. U. Marschall, H. Matern, J. Sjovall [et al.] // Bile acids - Cholestasis - Gallstones. Advances in Basic and Clinical Bile Acid Research / Edited by H. From. - Dordrecht; Boston; London, 1995. - P. 13-22.

17. Pellicoro A. Human and rat bile acid-CoA:amino acid N-acyltransferase are liver-specific peroxisomal enzymes: implications for intracellular bile salt transport / A. Pellicoro, F. A. van den Heuvel, M. Geuken [et al.] // Hepatology. - 2007. - Vol. 45(2). - P. 340-348.

18. Hofmann A.F. Bile acids: chemistry, pathochemistry, biology, pathobiology, and therapeutics / A.F. Hofmann, L.R. Hagey // Cell Mol Life Sci. - 2008. - Vol. 65 (16). - P. 2461-2483.

19. Haouzi P. Cardiogenic shock induced reduction in cellular O₂ delivery as a hallmark of acute H₂S intoxication / Р. Haouzi, Т. Sonobe // Clinical toxicology (Philadelphia, Pa). - 2015. - Vol. 53(4). - P. 416-417.

20. Abou-Hamdan A. Oxidation of H2S in mammalian cells and mitochondria / A. Abou-Hamdan, H. Guedouari- Bounihi, V. Lenoir [et all.] // Methods Enzymol. - 2015. - Vol. 554. - Р. 201-208.

21. Van Eldere J. Tauroconjugation of cholic acid stimulates 7 alpha-dehydroxylation by fecal bacteria / J. Van Eldere, P. Celis, G. De Pauw [et all.] // Appl Environ Microbiol. - 1996. - Vol. 62(2). - P. 656-661.

Размещено на Allbest.ru