Использование показателей агрегатного состояния гомогената лейкоцитов для оценки адаптационных возможностей организма у больных с невротическими расстройствами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН

Использование показателей агрегатного состояния гомогената лейкоцитов для оценки адаптационных возможностей организма у больных с невротическими расстройствами

М.В. Кусков

В.Я. Семке

С.А. Иванова

С.С. Теровский

г. Томск

Аннотация

лейкоцит невротический лактатдегидрогеназа

Изучались агрегатные свойства взвеси разрушенных лейкоцитов у больных с невротическими расстройствами при поступлении в стационар и в процессе лечения. При поступлении в стационар больные с невротическими расстройствами имеют низкие по отношению к группе контроля величины скрытой активности изоферментов ЛДГ. В процессе лечения эти параметры восстанавливаются до контрольных значений. Величина скрытой активности зависит от антиоксидантного статуса организма. Исследование динамики скрытой активности изоферментов ЛДГ не выявило столь однозначного восстановления наблюдаемых параметров в процессе лечения. Обсуждается возможность использования данного метода с целью анализа динамики течения психопатологического процесса и прогнозирования его исхода.

Abstract

In present investigation experience of use of aggregate properties of damaged leukocytes suspension in patients with neurotic disorders at admission and in the process of conducted treatment has been presented. At admission patients with adjustment disorder have low in relation to control group magnitudes of latent activity of isoenzymes LDH. In the process of the conducted treatment these parameters are restored up to control values. The received data confirm a hypothesis that magnitudes of latent activity of isoenzymes LDH are associated with antioxidant status of the organism. Study of dynamic of latent activity isoenzymes LDH in the process of treatment has not revealed such a synonymous restoration of observed parameters. Possibility of use of this methodological approach to psychiatric practice with the aim of an analysis of dynamic of course of the psychopathological process and prognosis of its outcome is discussed.

Основная часть

Введение. Свободнорадикальное окисление (СРО) протекает в норме во всех тканях живых организмов. Показано, что активация СРО является неспецифической реакцией организма в ответ на все виды стресса, в том числе и психоэмоциональный (6). Уровень СРО зависит от глубины стрессорной реакции организма, а следовательно, может адекватно отражать его адаптационные возможности. Для поддержания оптимального баланса окислительно-восстановительных процессов в организме существует многокомпонентная, интегрируемая и регулируемая антиоксидантная система (АОС). Интегральная оценка состояния АОС возможна путем измерения ее «буферной емкости», т.е. антиоксидантной активности (АОА) (7).

Все ныне существующие методы определения АОА основаны на использовании модельных систем, включающих в себя два компонента: механизм генерации свободных радикалов и систему их детектирования. Такой методический подход имеет ряд недостатков: во-первых, в качестве инициаторов СРО используются факторы, не соответствующие физиологическим, которые вызывают нежелательные повреждения в биологическом объекте и соответственно в АОС; во-вторых, изменение состояния АОС и входящих в нее компонентов зависит от способа инициации пероксидации, т.е. от вида используемого инициатора СРО. Недостатки существующих методов не позволяют адекватно оценивать состояние АОА организма, что делает очевидным необходимость продолжения поиска в этом направлении.

Уровень перекисных процессов плазмы крови и гомогената ткани адекватно отражает антиоксидантный статус организма в целом (9). Показано, что активация СРО на клеточном уровне сопровождается изменением функционального состояния клеточной мембраны в результате окислительной модификации мембранных фосфолипидов и белков, что ведет к изменению ее физико-химических свойств (1, 8). Исходя из вышесказанного, можно предположить, что метод интегральной оценки уровня свободнорадикальных процессов в организме может быть основан на анализе физико-химических свойств мембран и содержимого иммунокомпетентных клеток.

Материалы и методы исследования. Проведено обследование группы лиц, состоящей из 15 человек (7 мужчин и 8 женщин) с невротическими расстройствами (F43.2). Возраст обследованных 35,0±11,0 года. Забор крови производился дважды при поступлении в стационар - 1-я группа и во время лечения - 2-я группа (через 14 дней). Группа контроля (ГК) состояла из 10 человек, идентичных обследуемой группе по полу и возрасту.

Для исследования использовалось 8 мл гепаринизированной крови, взятой из локтевой вены. Выделение лейкоцитов и приготовление лейкоцитарной массы производилось описанным ранее методом (4). Полученную лейкоцитарную массу разделяли на 8 аликвот по 50 мкл. Во все аликвоты добавляли по 50 мкл инкубационного раствора (ИР) разного состава. Каждый ИР состоял из «общих» и «индивидуальных» компонентов. Общие компоненты - буфер (0,25М трис-HCl, рН 6,8) и глицерин (20%), присутствовали во всех ИР, а «индивидуальные» добавлялись в зависимости от номера ИР. В ИР1 «индивидуальные» компоненты отсутствовали, ИР2 - мочевина (2 Моль), ИР3 - мочевина (4 Моль), ИР4 - мочевина (6 Моль), ИР5 - тритон N101 (2%), ИР6 - тритон N101 (2%) и мочевина (2 Моль), ИР7 - тритон N101 (2%) и мочевина (4 Моль) и ИР8 - тритон N101 (2%) и мочевина (6 Моль). К каждой из восьми аликвот добавлялся один из вышеперечисленных растворов и полученные пробы (100 мкл каждая) инкубировали в течение 15 минут при 37С. Данные концентрации биологическиактивных веществ были подобраны экспериментальным путем как наиболее информативные для изучения скрытой активности. Разделение изоферментов ЛДГ и визуализация их в геле производились описанными в предыдущей статье методами (4).

Определяемые показатели. Скрытую активность (СА) определяли по разнице интенсивности соответствующих изоформ (после инкубации разрушенных клеток в одном случае с детергентом, в другом - без него) в процентах (растворы 5 и 1). Интактная активность соответствующего изофермента (раствор 1) принималась за 100%. Динамика СА (ДСА) соответствовала изменению разницы выявляемых активностей соответствующих изоферментов между зависимостями Стаб и ИСтаб по мере изменения (увеличения) концентрации мочевины (измеряется в процентах). ИСтаб-интегральная стабильность фермента. Величины активностей изоферментов после инкубации клеточного лизата с мочевиной в концентрациях 1, 2 или 3 Моль (растворы 2, 3, 4), выраженные в процентах. За 100% принималась интактная активность (раствор 1) соответствующего изофермента. Стаб-стабильность фермента. Величины активностей изоферментов после инкубации клеточного лизата с мочевиной в концентрациях 1, 2 или 3 Моль с предварительным устранением СА (растворы 6, 7, 8), выражены в процентах. За 100% принималась выявляемая активность соответствующего изофермента после его инкубации с детергентом (раствор 5). Определение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) производилось методом выявления различий стойкости эритроцитарных мембран по отношению к смеси с разным объемным содержанием изотонических растворов хлористого натрия и мочевины (3). Полученные данные представлены в таблицах в виде средних значений изучаемых показателей со стандартными ошибками этих средних. Данные анализировались на предмет достоверности их различий с использованием t-критерия Стьюдента. Различия достоверны при р<0,05.

Результаты и обсуждение. После проявки геля на нем уверенно выявлялись три изофермента ЛДГ (ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3). ЛДГ-4 встречалась только в 5% случаев, а ЛДГ-5 не удалось выявить ни разу. Активность соответствующих изоферментов была больше в пробах, предварительно инкубированных с детергентом, чем без него. Для оценки агрегатного состояния гомогената лейкоцитов изучались величины СА изоферментов ЛДГ. Метод основан на использовании модельной системы гомогената клеток. Изучение ее свойств производилось путем анализа функционального состояния изоферментов ЛДГ до и после изменения ее агрегатного состояния.

Показано, что больные с НР при поступлении в стационар имеют низкие по отношению к ГК величины СА изоферментов ЛДГ, которые восстанавливаются до контрольных значений в процессе лечения.

Скрытая активность представляет собой разницу выявляемых после электрофоретического разделения активностей соответствующих изоферментов, находящихся в средах с разным агрегатным состоянием. В одном случае взвесь разрушенных клеток представляет собой везикулы, белково-липидные и белок-белковые агрегаты. В таком растворе часть изучаемого фермента находится в замкнутом и связанном с мембраной и другими белками состоянии (2). В этом случае активность изоферментов занижена, поскольку часть белка не может проникнуть в гель в условиях нативного электрофореза.

Скрытая активность изоферментов ЛДГ лейкоцитов у лиц с НР. * - отличие от соответствующей величины в ГК с уровнем значимости р<0,0

В процессе инкубации разрушенных клеток с детергентом иммобилизованная часть фермента высвобождается, активность в этом случае становится соответствующей уже всему пулу изофермента. Показанное в процессе лечения изменение величин СА изоферментов ЛДГ лейкоцитов, по всей видимости, связано с физико-химическими свойствами мембран и содержимого лейкоцитов. Общеизвестно, что любое значимое стрессорное воздействие на организм вызывает активацию перекисных процессов. Происходящая при этом окислительная модификация мембранных фосфолипидов и белков ведет к изменению их физико-химических свойств (1). Вероятно, наблюдаемое изменение величин СА у лиц с НР связано с изменением антиоксидантного статуса организма.

Для проверки данного утверждения было проведено изучение ОРЭ у лиц с НР. Данный показатель традиционно используется исследователями для интегральной оценки состояния антиоксидантной системы организма (3). ОРЭ у лиц из 1-й группы обследуемых достоверно выше, чем в ГК в случае инкубации этих клеток с растворами 2, 3 и 4.

У лиц из 2-й группы ОРЭ восстановилась до контрольных значений. Наблюдается синхронное изменение ОРЭ и величин СА у лиц с РА в процессе лечения. Эти данные в сочетании с наличием доказанной зависимости ОРЭ от уровня СРО в организме (10) позволяют говорить, что величина СА связана с антиоксидантным статусом организма. Обсуждаемые методы обладают сходной чувствительностью и информативностью.

Для более детального тестирования агрегатного состояния взвеси разрушенных клеток разработана экспериментальная схема исследования величины деструктурирующего влияния мочевины (1, 2 и 3 Моль) на фермент, находящийся в гетерогенных системах с разным агрегатным состоянием.

Изменение ОРЭ у лиц с НР в процессе лечения

Примечание. Представлены величины гемолиза эритроцитов в процентах. За 100% принимался гемолиз эритроцитов после их инкубации с раствором 7. Данные представлены в виде средних значений со стандартными ошибками этих средних. * - отличие от соответствующей величины в ГК с уровнем значимости р<0,05. Концентрация (в Молях) мочевины (Моч) и NaCl в водных растворах: N1. 0,12М Моч/0,09М NaCl; N2. 0,136М Моч/0,0825М NaCl; N3. 0,15М Моч/0,075М NaCl; N4. 0,165М Моч/0,0675М NaCl; N5. 0,18М Моч/0,06М NaCl; N6. 0,195М Моч/0,0256М NaCl; N7. 0,3М Моч

В первом случае мочевину инкубируют с взвесью разрушенных лейкоцитов, а во втором - мочевину добавляют к лизату разрушенных клеток, содержащему детергент. Очевидно, что в отсутствие детергента деструктурирующее влияние мочевины на фермент затруднено, поскольку мочевине приходится оказывать на него не только деструктурирующее, но и солюбилизирующее действие. К тому же связанный с мембраной фермент обратимо меняет свою конформацию, становясь более стабильным (5). Добавление детергента устраняет барьерные свойства клеточного лизата. Получаемая в этих условиях зависимость активности изоферментов от концентрации мочевины определяется их стабильностью.

Проведено исследование ДСА изоферментов ЛДГ лейкоцитов от лиц с НР. Анализируя ДСА для ЛДГ-1, можно сказать, что при поступлении в стационар (1-я группа) зависимость имеет отличную от ГК форму.

Динамика СА ЛДГ-1 лейкоцитов от лиц с НР. Здесь и далее * - отличие от соответствующей величины в ГК с уровнем значимости р<0,05; ** - отличие от соответствующей величины в 1-й группе с уровнем значимости р<0,05

В процессе терапии (2-я группа) форма зависимости ДСА ЛДГ-1 становится похожей на соответствующую зависимость в ГК. Величины выявляемых активностей ЛДГ-1 (для всех концентраций мочевины) достоверно выше, чем в ГК. В данном случае можно говорить о частичном восстановлении параметров ДСА (формы кривой, но не значений) в процессе проводимого лечения.

О ДСА ЛДГ-2 можно сказать, что при поступлении в стационар (1-я группа) зависимость имеет отличную от ГК форму. Величина разницы активностей ЛДГ-2 достоверно ниже (при 1 Моль Моч.) и достоверно выше (при 3 Моль Моч.) соответствующих величин в ГК. В процессе лечения (2-я группа) величина разницы активностей ЛДГ-2 (при 1 Моль Моч.) становится равной соответствующей величине в ГК. Величина разницы активностей ЛДГ-2 (при 3 Моль Моч.) занимает промежуточное, но достоверно отличное от нормы положение между значениями соответствующих величин для 1-й группы и ГК. Величины разницы активности ЛДГ-2 (при 2 Моль Моч.) и до, и в процессе лечения достоверно не отличались от соответствующей величины в ГК. Для ЛДГ-2 характерно частичное восстановление формы и абсолютных значений зависимости.

Динамика СА ЛДГ-2 лейкоцитов от лиц с НР

Для ЛДГ-3 форма ДСА между группами принципиально не различается. В 1-й группе больных величина разницы активности ЛДГ-3 (при 1 Моль Моч.) достоверно ниже, а в процессе терапии (2-я группа) становится даже несколько выше, чем соответствующая величина в ГК. Величины разницы активностей изофермента при концентрации мочевины 2 и 3 Моль и до, и в процессе лечения не отличались от соответствующих величин в ГК. В данном случае можно говорить о практически полном восстановлении формы и абсолютных значений зависимости ДСА ЛДГ-3.

В случае тестирования ДСА изоферментов ЛДГ мы не видим в процессе лечения полного восстановления параметров ДСА изоферментов ЛДГ. Наблюдаемые в процессе лечения изменения, по-видимому, обусловлены частичным восстановлением агрегатного состояния гомогената разрушенных клеток и / или принятием этой системой нового положения, обусловленного сочетанием действия на изучаемые параметры патофизиологических механизмов и применяемых фармакологических препаратов.

Динамика СА ЛДГ-3 лейкоцитов от лиц с НР

Изменения СА и ДСА изоферментов ЛДГ лейкоцитов связаны с антиоксидантным статусом организма. Использование метода в психиатрической практике позволит анализировать динамику течения психопатологического процесса и прогнозировать его исход.

Литература

1. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран. - Биофизика. - 1987. - Т. 32, №5. - С. 830-844.

2. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ. - М.: Мир, 1997. - С. 624.

3. Лущак В.И. Биохимия. - М., 1992. - Т.57. - Вып.8. - С. 1142-1154.

4. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2-х т. - Минск: Изд-во «Беларусь», 2000.

5. Кусков М.В., Семке В.Я. Динамика функционального состояния лактатдегидрогеназы лейкоцитов от больных с расстройством адаптации в процессе лечения // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2003. - №4. - С. 14-17.

6. Петер Фридрих. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. - М.: Мир, 1984.

7. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З. Увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты при адаптации крыс с коротким стрессовым воздействием // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1987. - Т. CIV, №10. - С. 411 - 413.

8. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифических реакций организма на экстремальное воздействие // Вопр. мед. химии. - 1988. - Т. 34, №6. - С. 2.

9. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация: - М.: Мир, 1988.

10. Lewin G., Popov I. The antioxidant system of the organism. Theoretical basis and practical consequenses // Med. Hypotheses. - 1994. - V. 42, №4.

11. Watanabe H., Kobayashi A., Yamamoto T. et al. Alterations of human erythrocytes membrane fluidity by oxygen-derived free radicals and calcium // Free Radic. Biol. - 1990. - V. 8, №6. - P. 507-514.

Размещено на Allbest.ru