Состав и содержание флавоноидов видов растений из секций Eudmus Bunge и Melilotopsis Gontsch. рода Astragalus L. Сибири

Размещено на http://www.allbest.ru/

Состав и содержание флавоноидов видов растений из секций Eudmus Bunge и Melilotopsis Gontsch. рода Astragalus L. Сибири

Ольга Викторовна Коцупий,

кандидат биологических наук, Центральный сибирский ботанический сад СО РАН (630090, Россия, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101)

Галина Ивановна Высочина, доктор биологических наук, профессор, Центральный сибирский ботанический сад СО РАН

(630090, Россия, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101),

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) изучены состав и содержание агликонов и гликозидов флавоноидов в листьях видов растений из секции Eudmus Bunge (Astragalus uliginosus L., A. schelichovii Turcz.) и секции Melilotopsis Gontsch. (A. melilotoides Pall., A. tenuis Turcz.) рода Аstragalus L. из разных мест произрастания.

В гидролизатах экстрактов листьев А. uliginosus и A. schelichovii обнаружены по 5 агликонов флавоноидов, из них идентифицированы кверцетин, кемпферол и изорамнетин. Морфолого-географическая дифференциация этих видов подтверждается таксоноспецифичным составом гликозидов флавоноидов. Среднее значение суммы главных гликозидов флавоноидов составило: в листьях растений А. uliginosus 2,46 % (от массы абсолютно-сухого сырья), A. schelichovii 3,08 %.

ВA. melilotoides обнаружены кверцетин, кемпферол, изорамнетин, рутин и изокверцитрин, в A. tenuis кверцетин, кемпферол, изорамнетин, лютеолин, изокверцитрин, 3-О-р-глюкобиозид кверцетина. Многокомпонентный состав фенольных соединений A. melilotoides (до 33 веществ) отличает его от состава A. tenuis (до 12 веществ). Содержание фенольных соединений в A. melilotoides до 6,0 %, в A. tenuis до 7,0 %, в том числе 3-О-р-глюкобиозида кверцетина до 4,30 %.

Состав и содержание флавоноидов видов секций Eudmus и Melilotopsis могут служить хемотаксономическими маркёрами при исследовании систематической принадлежности растений. Высокое содержание веществ позволяет рекомендовать изучаемые виды в качестве источников флавоноидов.

Ключевые слова: флавоноиды, ВЭЖХ, Аstragalus uliginosus L., Astragalus schelichovii Turcz., Astragalus melilotoides Pall., Astragalus tenuis Turcz., Сибирь.

Composition and Content of the Flavonoids of Plant Species from Sections Eudmus Bunge and Melilotopsis Gontsch. of the Genus Astragalus L. from Siberia

Olga Viktorovna Kotsupiy ,

Candidate of Biology,

Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences (ul. Zolotodolinskaya 101, Novosibirsk, 630090 Russia),

Galina Ivanovna Vysochina,

Doctor of Biology, Professor, Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences (ul. Zolotodolinskaya 101, Novosibirsk, 630090 Russia),

Using HPLC method, composition and content of the flavonoid aglycons and glycosides were studied in the leaves of species from section Eudmus (Astragalus uliginosus L., A. schelichovii Turcz.) and section Melilotopsis Gontsch. (A. melilotoides Pall., A. tenuis Turcz.) of the genus Аstragalus L. from different habitats.

In extracts' hydrolysates of A. uliginosus and A. schelichovii leaves, five flavonoid aglycones have been found. Quercetin, kaempferol and isorhamnetin have been identified in them. Morphological and geographical differentiation of these species is confirmed by the taxon specific composition of the flavonoid glycosides. The average value of the sum of major flavonoids glycosides has been as follows: in leaves of A. uliginosus plants 2.46 % (by weight of the absolutely dry raw material), in A. schelichovii 3.08 %.

In A. melilotoides, quercetin, kaempferol, isorhamnetin, rutin and isoquercitrin have been found, and in A. tenuis, there have been quercetin, kaempferol, isorhamnetin, luteolin, isoquercitrin, quercetin-3-O-p-glucobioside. Multicomponent composition of phenolic compounds of the A. melilotoides (33 substances) distinguishes it from composition of the A. tenuis (12 substances). The content of phenolic compounds in A. melilotoides amounted to 6.0 %, A. tenuis to 7.0 %, including quercetin-3-O-p-glucobioside to 4.30 %.

Flavonoid composition and content of the species of Eudmus and Melilotopsis sections can serve as chemotaxonomic markers in the study of systematic classification of plants. The high content of substances allows us to recommend the species investigated as sources of flavonoids.

Keywords: flavonoids, HPLC, Astragalus uliginosus L., Astragalus schelichovii Turcz., Astragalus melilotoides Pall., Astragalus tenuis Turcz., Siberia.

Представители одного из крупнейших родов семейства Fabaceae Astragalus L. вызывают неуклонно растущий практический интерес, обусловленный тем, что многие виды рода являются ценными лекарственными растениями с высоким содержанием различных биологически активных веществ, в том числе флавоноидов. Изучение распространения флавоноидов в растениях рода имеет особое значение и для решения задач хемотаксономии. Необходимым условием и этапом хемотаксономического исследования является изучение таксоноспецифичности и изменчивости химических признаков.

Целью данной работы является исследование состава и удержания флавоноидов некоторых сибирских видов рода Astragalus с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения перспективности этих видов в качестве источника БАВ и для изучения таксоноспецифичности компонентов фенольного комплекса.

Объектами исследования служили листья растений 4 видов астрагалов: Astragalus uliginosus L. и A. schelichovii Turcz. (подрод Cercidothrix Bunge, секция Euodmus Bunge), A. melilotoides Pall. и A. tenuis Turcz. (подрод Phaca (L.) Bunge, секция Melilotopsis Gontsch.).

A. uliginosus L. имеет северо-азиатский ареал распространён в Сибири, Казахстане, Монголии, Северном Китае, на Корейском полуострове. A. schelichovii Turcz., с более узким, северо-восточно-азиатским ареалом, произрастает на севере Красноярского края, Забайкальского края, в Якутии и на севере Дальнего Востока. Виды имеют достаточно чёткие анатомо-морфологические признаки. A. uliginosus отличается от A. schelichovii наличием тонкого ползучего корневища, почти голыми стеблями, сросшимися при основании прилистниками, голыми бобами и завязью [1, c. 53-54].

С точки зрения ресурсоведения, A. uliginosus и A. schelichovii слабо изучены. В надземной части A. uliginosus обнаружены кумарины, в листьях азотсодержащие соединения и флавоноиды. Надземную часть A. uliginosus используют в тибетской медицине и в народной медицине Забайкалья при асците, отёках, гастроэнтеритах, болезнях селезёнки, как родостимулирующее и ускоряющее отделение плаценты средство [5, c. 123]. Нами не найдено литературных данных по исследованию химического состава и использованию в народной медицине растений A. schelichovii.

Химический состав официнального южно-европейского A. falcatus L. изучен достаточно хорошо, в отличие от родственных азиатских A. uliginosus и A. schelichovii. Флавоноиды найдены во всех частях растения. Главный компонент робинин (кемпферол-З-О-робинозид-7-О-рамнозид), в надземной части его количество (в %) составило 2,20, в листьях до 2,33. Кроме робинина, в листьях А. falcatus идентифицированы кемпферол-3-О^-рутинозид [5, c. 114], кверцетин-3-О-^^-глюкопиранозил (7^-З-а^-рамнопиранозил (7^-6^^-галактопиранозида 7-0^^-глюкопиранозид; изорамнетин 3-O-[Я-D-^лопиранозил (7^-3)-а^-рамнопиранозил Г/^-б^-р^-галактопиранозида 7-О-а^-рамнопиранозид [7, c. 377-381]. Аптечный препарат, полученный Институтом фармакохимии им. И. Кутателадзе (г. Тбилиси) из листьев и цветков астрагала серпоплодного, «фларонин» гипоазотемическое средство.

В целях расширения поиска новых лекарственных видов растений необходимо проводить исследование химического состава аналогов официнальных растений из числа близкородственных таксонов.

Южно-сибирский A. melilotoides растение с продолговато-обратноклиновидными листочками, в отличие от маньчжуро-даурского A. tenuis с линейными или нитевиднолинейными листочками. На территории России A. tenuis произрастает в Даурии, пересекаясь с ареалом A. melilotoides. Морфологически существуют переходные формы, растения A. tenuis «в северной части лесостепи Даурии несколько уклоняются к A. melilotoides» [1, c. 47]. флавоноид растение хроматография

Водные извлечения из надземной части A. melilotoides в эксперименте обнаружили протистоцидную и антибактериальную активность, водный настой из корней антибактериальную активность. Надземная часть A. melilotoides в тибетской медицине используется при отёках, асците, гастроэнтеритах, болезнях селезёнки, желудка, суставном ревматизме, нарушениях обмена веществ. В монгольской медицине надземную часть A. melilotoides употребляют при инфицированных ранах, в Сибири как диуретическое и при нервных болезнях [5, c. 118]. Густой экстракт A. tenuis в эксперименте проявляет гипотензивные свойства [6, c. 294-295].

В надземной части A. melilotoides в составе флавоноидов обнаружены кемпферол, кверцетин, лютеолин, рутин, 3-О-Р^-рамнопиранозид кверцетина, 3-рутинозид кемпферола [2, с. 60-61; 3, c. 9-11], изокверцитрин, лютеолин-рутинозид [2, с. 60-61], 3-О-Р^-диглюкопиранозид кемпферола, биокверцетин, сколимозид [3, с. 9-11]. В надземной части A. tenuis обнаружены изокверцитрин, 3-О-р-глюкобиозид кверцетина [5, с. 122].

Материалы и методы исследования

Количество изученных ценопопуляций для A. uliginosus 10; A. schelichovii 6; А. melilotoides 4 и A. tenuis 4. Использовали как собственные сборы, так и материалы гербария ЦСБС СО РАН г. Новосибирска (NS, NSK). Анализировали листья растений в фазах цветения и конца цветения.

Для извлечения суммы флавоноидов проводили исчерпывающую экстракцию 70 % этанолом при нагревании на водяной бане. Для проведения кислотного гидролиза к 0,5 мл водно-этанольного извлечения прибавляли 0,5 мл HCl (2 н) и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 часов.

Анализ флавоноидов проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» с диодноматричным детектором и системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation. Разделение проводили на колонке Zorbax SB-C18, размером 4,6*150 мм, с диаметром частиц 5 мкм, применив градиентный режим элюирования. В подвижной фазе содержание метанола в водном растворе ортофосфорной кислоты (0,1 %) изменялось для экстрактов от 32 до 33 % за 27 мин, далее до 46 % к 38 мин, до 56 % к 50 мин, для гидролизатов от 50 до 52 % за 15 мин. Скорость потока элюента 1 мл/мин. Температура колонки 26 °С. Объём вводимой пробы 5 мкл. Детектирование осуществляли при Л = 255, 270, 290, 340, 350, 360, 370 нм. Для приготовления подвижных фаз использовали метиловый спирт (ос. ч.), ортофосфорную кислоту (ос. ч.), бидистиллированную воду. В качестве метчиков использовали стандартные образцы производства фирмы Fluka и Sigma. Стандартные растворы готовили в концентрации 10 мкг/мл в этиловом спирте. Анализ каждого образца проводили в двукратной повторности.

Содержание индивидуальных компонентов (Сх) в процентах в пересчёте на абсолютно-сухое сырьё вычисляли по формуле

где Сст концентрация соответствующего стандартного раствора флавоноида, мкг/мл; S1 площадь пика флавоноида в анализируемой пробе, е.о.п.; S2 площадь пика стандартного флавоноида, е.о.п.; V1 объём элюата после вымывания флавоноидов с концентрирующего патрона, мл; V2 общий объём экстракта, мл; М масса навески, мг; В влажность сырья, %.

Расчёт содержания агликонов флавоноидов производили по стандартным площадям пиков кверцетина, кемпферола и лютеолина; расчёт суммы фенольных соединений по стандартной площади пика кверцетина; расчёт содержания гликозидов флавоноидов, рутина, 3-О-глюкобиозида кверцетина производили по стандартной площади пика рутина; изокверцитрина по стандартной площади пика изокверцитрина.

Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета программ «MS Excel». Уровень изменчивости определён по эмпирической шкале С. А. Мамаева [4, с. 15].

Результаты и их обсуждение. В гидролизатах листьев растений A. uliginosus и A. schelichovii обнаружены по пять веществ, которые в соответствии со спектральными и хроматографическими характеристиками были отнесены к агликонам флавоноидов. Идентифицированы кверцетин, кемпферол и изорамнетин, не идентифицированы компоненты со временем удерживания t = 5,4 (Л max = 256, 372 нм) и t=9 (Л max = 249, 266, 322 пл., 367 нм).

Главными агликонами для A. uliginosus являются кемпферол и кверцетин, для A. schelichovii кемпферол и агликон II. Содержание кемпферола больше, чем содержание кверцетина (у A. uliginosus в среднем в 2,3 раза, у A. schelichovii в 5,1 раза).

Сумма агликонов в ценопопуляциях A. uliginosus варьирует в пределах от 0,66 до 1,32 % от массы абсолютно-сухого сырья, у A. schelichovii в пределах 0,62-1,05 % (см. табл. 1). Среднее значение суммы агликонов у A. uliginosus несколько выше, чем у A. schelichovii (1,02±0,09 и 0,77±0,06 % соответственно, данные недостоверно различаются при t = 2,00 < tst = 2,14 при p = 0,05 и t =2,00 < tst = 2,98 при p = 0,01). Содержание агликонов имеет повышенную вариабельность у обоих видов (коэффициент вариации 26 и 21% у A. uliginosus и A. schelichovii).

Таблица 1

Содержание агликонов и гликозидов флавоноидов в листьях A. uliginosus и A. schelichovii, в % от массы абсолютно-сухого сырья

В гидролизатах экстрактов листьев A. melilotoides обнаружены кверцетин, кемпферол, изорамнетин, в гидролизатах A. tenuis лютеолин и минорный кверцетин; в одном образце A. tenuis присутствуют все компоненты, характерные для обоих видов (см. табл. 2).

Содержание суммы агликонов у A. melilotoides и A. tenuis не более 0,5 % от массы абсолютно-сухого сырья.

Таблица 2

Содержание индивидуальных агликонов и главных гликозидов флавоноидов в листьях A. melilotoides и A. tenuis, в % от массы абсолютно-сухого сырья

Достаточно чёткие различия компонентного состава изучаемых видов обнаружены при исследовании этанольных экстрактов листьев.

В растениях А. иІідіпоБиБ обнаружено 21-38, а в А. бсЬєіісЬоуіі9-13 компонентов (фенольных кислот, гликозидов и агликонов флавоноидов) (см. рис. 1).

Рис. 1. Хроматограмма экстрактов листьев А. иІідіпозиБ (Забайкальский край, окр. с. Урульга, берег р. Урульга) и А. schelichovii (Якутия, Жиганский р-н, устье р. Катары, песчано-галечниковый берег)

По оси абсцисс время удерживания, мин. По оси ординат оптическая плотность, е.о.п.

Главные компоненты, судя по максимумам спектров поглощения, соответствуют гликозидам флавоноидов, кроме компонента 5u (t = 28 мин) А. uliginosus (см. табл. 3). При сравнении хроматограмм этанольных экстрактов А. uliginosus и A. schelichovii были обнаружены два одинаковых компонента G1 и G2. Более гидрофобные компоненты в правой стороне хроматограммы, встречающиеся в растениях нескольких ценопопуляций А. uliginosus и отсутствующие у A. schelichovii, по спектральным характеристикам соответствуют фенольным соединениям (t = 33,5, А 255, 330 нм; t = 34,7, А 255, 350 нм; t = 36,4, А 265, 360 нм).

Таблица 3

Спектральная характеристика гликозидов флавоноидов A. uliginosus и A. schelichovii

Примечание: пл. плечо.

Межпопуляционная изменчивость состава гликозидов в изученных образцах растений двух видов небольшая обнаружено отсутствие одного гликозида у двух образцов A. uliginosus и трех компонентов у одного образца A. schelichovii.

Содержание семи главных гликозидов флавоноидов A. uliginosus варьирует в пределах 1,15-3,68 %, A. schelichovii в пределах 1,10-4,45 % (см. табл. 1). Среднее значение суммы гликозидов составило у А. uliginosus 2,46 %, у A. schelichovii 3,08 %, с очень высоким коэффициентом вариации 40 и 44 %.

В экстрактах A. melilotoides обнаружено от 25 до 33 компонентов (флавонгликозидов и фенолкарбоновых кислот), в экстрактах A. tenuis 10-12 веществ. Флавоноиды A. melilotoides поглощают УФ-излучение преимущественно в области 350 и 360 нм, флавоноиды A. tenuis в пределах 340-350 нм. Идентифицированы два гликозида кверцетина изокверцитрин (t = 18,8 мин, А = 255, 360 нм) и рутин (t = 20 мин, А = 260, 360 нм). В растениях A. melilotoides содержатся оба компонента, в растениях A. tenuis отсутствует рутин. Главным компонентом A. tenuis является, предположительно, 3-О-глюкобиозид кверцетина со временем удерживания t = 16,7 мин и максимумом поглощения на А = 255, 350 нм. Кроме этого, хроматограммы A. melilotoides, как и хроматограммы некоторых образцов A. uliginosus, имеют в правой части гидрофобные компоненты (см. рис. 2).

Рис. 2. Хроматограмма экстрактов листьев A. melilotoides (Хакасия, Бейский р-н, окр. д. Дмитриевка, залежь) и A. tenuis (Забайкальский край, Агинский р-н, урочище «Цырик-Нарасун», степь): 1 3-О-глюкобиозид кверцетина; 2 изокверцитрин; 3 рутин.

По оси абсцисс время удерживания, мин. По оси ординат оптическая плотность, е.о.п.

В растениях A. melilotoides содержание рутина не превышает 0,26 %, изокверцитрин найден в малом количестве (0,01 %). В изученных образцах растений A. tenuis из Забайкальского края содержание изокверцитрина не более 0,04 %, содержание 3-О-глюкобиозида кверцетина (в пересчёте на рутин) находится в пределах 0,14-4,30 % (см. табл. 2). Общее количество фенольных соединений в пересчёте на кверцетин составило для A. melilotoides до 6,0 %, для A. tenuis до 7,0 %.

Таким образом, в видах A. uliginosus и A. schelichovii секции Euodmus, с достаточно чёткой морфологической и географической дифференциацией, обнаружен стабильный агликоновый состав и таксоноспецифичный состав гликозидов. В A. melilotoides и A. tenuis, имеющих пересекающийся ареал и переходные морфологические формы, обнаружен нестабильный состав агликонов при разном составе гликозидов. Более широкоареальные виды имеют более богатый состав фенольных соединений.

Выводы

В гидролизатах экстрактов листьев А. uliginosus и A. schelichovii, из пяти веществ, отнесённых по максимумам УФ-спектров к агликонам флавоноидов, идентифицированы кверцетин, кемпферол и изорамнетин. Виды отличаются по количественным соотношениям агликонов флавоноидов. Этанольный экстракт листьев А. uliginosus отличается от экстракта A. schelichovii более богатым составом фенольных соединений. Образцы растений из разных мест произрастания отличаются незначительно по гликозидному составу флавоноидов и более значимо по их содержанию.

В А. uliginosus и A. schelichovii среднее значение суммы гликозидов флавоноидов составило 2,46±0,41 и 3,08±0,56 % от массы абсолютно-сухого сырья, соответственно; среднее значение суммы агликонов флавоноидов составило 1,02±0,09 и 0,77±0,06 %.

Изучение с помощью ВЭЖХ состава и содержания флавоноидов сибирских видов A. uliginosus и A. schelichovii, родственных официнальному A. falcatus из секции Euodmus, позволило обнаружить богатый состав и высокое содержание агликонов и гликозидов флавоноидов в растениях этих таксонов, ранее детально не исследованных с точки зрения фитохимии.

Биохимические признаки, выступающие в качестве хемотаксономических маркёров, в данном случае подтвердили чёткую морфолого-географическую дифференциацию таксонов.

В A. melilotoides и A. tenuis секции Melilotopsis обнаружен богатый состав фенольных соединений. Агликоны флавонолов изученных четырёх образцов листьев растений A. melilotoides из разных мест произрастания представлены флавонолами кверцетином, кемпферолом, изорамнетином. Агликоновый состав A. tenuis отличается присутствием кверцетина и флавона лютеолина, однако у одного образца отмечено наличие флавонолов, идентифицированных у A. melilotoides. Состав гликозидов флавоноидов A. melilotoides имеет существенные отличия от состава гликозидов A. tenuis. В образцах листьев растений A. melilotoides обнаружен рутин (до 0,26 %), у A. tenuis главным компонентом, предположительно, является 3-О-глюкобиозид кверцетина (до 4,30 %). В обоих видах идентифицирован изокверцитрин, содержание его составило не более 0,04 %. Содержание фенольных соединений в A. melilotoides до 6,0 %, в A. tenuis до 7,0 %.

Высокое содержание флавоноидов и комплекса фенольных соединений позволяет ре-комендовать изученные виды в качестве источников флавоноидов, обладающих высокой Р-витаминной и антиоксидантной активностью.

Список литературы

1. Выдрина С. Н. Astragalus L. Астрагал // Флора Сибири. Новосибирск: Наука, 1994. Т 9.

2. Киселёва А. В., Волхонская Т А., Киселёв В. Е. Биологически активные вещества лекарственных растений Южной Сибири. Новосибирск: Наука, 1991. 136 с.

3. Макбуль М. А. Фармакогностическое изучение некоторых видов астрагал, произрастающих в Забайкалье: автореф. дис. ... канд. фарм. наук: 15.00.02. Л., 1980. 20 с.

4. Мамаев С. А. Закономерности внутривидовой изменчивости сем. Pinaceae на Урале: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.16. Свердловск, 1970. 53 с.

5. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование: семейства Hydrangeaceae Haloragaceae. Л.: Наука, 1987. Т 3. 326 с.

6. Шатохина Р К., Зозуля Р Н. Изучение флавоноидов астрагалов тонкого и холодного // Материалы III Всерос. съезда фармацевтов (Свердловск, 16-19 сент. 1975 г.). Свердловск, 1975.

7. Alaniya M. D., Kavtaradze N. Sh., Skhirtladze A. V., Sutiashvili M. G. Flavonoid oligosides from Georgian Astragalus falcatus // Chemistry of Natural Compounds. 2011. Vol. 47. N. 3.

References

1. Vydrina S. N. Astragalus L. Astragal // Flora Sibiri. Novosibirsk: Nauka, 1994. T 9.

2. Kiseleva A. V., Volkhonskaya T A., Kiselev V. E. Biologicheski aktivnye veshchestva lekarstvennykh rastenii Yuzhnoi Sibiri. Novosibirsk: Nauka, 1991.136 s.

3. Makbul' M. A. Farmakognosticheskoe izuchenie nekotorykh vidov astragal, proizrastayushchikh v Zabaikal'e: avtoref. dis. ... kand. farm. nauk: 15.00.02. L., 1980. 20 s.

4. Mamaev S. A. Zakonomernosti vnutrividovoi izmenchivosti sem. Pinaceae na Urale: avtoref. dis. ... d-ra biol. nauk: 03.00.16. Sverdlovsk, 1970. 53 s.

5. Rastitel'nye resursy SSSR: tsvetkovye rasteniya, ikh khimicheskii sostav, ispol'zovanie: cemeistva Hydrangeaceae Haloragaceae. L.: Nauka, 1987. T 3. 326 s.

6. Shatokhina R. K., Zozulya R. N. Izuchenie flavonoidov astragalov tonkogo i kholodnogo // Materialy III Vseros. s»ezda farmatsevtov (Sverdlovsk, 16-19 sent. 1975 g.). Sverdlovsk, 1975.

7. Alaniya M. D., Kavtaradze N. Sh., Skhirtladze A. V., Sutiashvili M. G. Flavonoid oligosides from Georgian Astragalus falcatus // Chemistry of Natural Compounds. 2011. Vol. 47. N. 3.

Размещено на Allbest.ru