Вивчення морфометричних характеристик колагенових волокон на пізніх термінах субкутанної імплантації пористого волокнистого матриксу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вивчення морфометричних характеристик колагенових волокон на пізніх термінах субкутанної імплантації пористого волокнистого матриксу

Пантус А.В.

ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет»

м. Івано-Франківськ

НДР «Комплексна оцінка та оптимізація методів прогнозування, діагностики та лікування стоматологічних захворювань у населення різних вікових груп»

Резюме

колагеновий волокнистий біополімерний матрикс

Проблема, що стоїть перед тканинною інженерією полягає в тому, щоб оптимізувати виділення, розмноження і диференціювання клітин, сконструювати матрикси або системи доставки, сприяючи підтримці, координації регенерації тканин у трьох вимірах. Одним із важливих критеріїв, який повинен враховуватись при конструюванні матриксу - його здатність утворювати оптимальну підложку для підсадки клітинних субстратів. Мета дослідження - експериментально оцінити характер розвитку колагенової підложки на піздніх термінах субкутанної імплантації біополімерного волокнистого матриксу.

Дослідження проводилось на 20 лабораторних тваринах (кролі), які були поділені на 2 групи. Першій групі порівняння: 10-ом тваринам проводилось оперативне втручання, яке включало формування «кишені» в підшкірній клітковині та накладання швів. Другій групі: 10-ом тваринам проводилась підшкірна імплантація біополімерного матриксу в ділянку спини між лопатками. Для дослідження брали 9 сегментів: один центрально розташований і по 4 сегменти з парацентральної та з периферичної зон.

Статистичний аналіз результатів здійснено за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Exel та Statistica 5.5 (Multiple Regression) із використанням методів варіаційної статистики, кореляції.

Отримані результати свідчать про відсутність як гострої, так і хронічної реактивної запальної інфільтрації, а також як гострої, так і хронічної реакції відторгнення імплантата як чужорідної субстанції у імплантованій ділянці тварини. Створений нами волокнистий матрикс завдяки своїй гігроскопічності та пористості створює своєрідний місток для проростання ткнин та формування колагенового матриксу в трьох вимірному просторі.

Ключові слова: біополімер, біоімплантат, колагенові волокна.

Постановка проблеми і аналіз останніх досліджень

На даний час у медицині та біоінженерії з кожним роком зростає інтерес до біополімерів. Матеріали в тканинній інженерії для створення біо- імплантатів, повинні володіти спектром спеціальних властивостей і надавати інженерним або мікро- інженерним конструкціям характеристик, властивих живим тканинам, а саме: здатність до самовід- новлення, здатність змінювати будову і властивості в відповідь на фактори навколишнього середо- вища[1]. Проблема, що стоїть перед тканинною інженерією, полягає в тому, щоб оптимізувати виділення, розмноження і диференціювання клітин, сконструювати каркаси або системи доставки, сприяючи підтримці, координації регенерації тканин у трьох вимірах [2, 3]. Одним із важливих критеріїв, який повинен враховуватись при конструюванні матриксу - його здатність утворювати оптимальну підложку для підсадки клітинних субстратів, у поєднанні з оптимальною гемодинамікою всередині скафолда [4, 5].

Мета дослідження. Експериментально оцінити характер розвитку колагенових волокон на пізніх термінах субкутанної імплантації біополімерного волокнистого матриксу.

Матеріали та методи дослідження. Для проведення досліджень було використано розроблений нами волокнистий матрикс із гранул 100% чистого полілактиду. Матрикс розробляли методом фазового розділення полімеру. Товщина волокнистого матриксу в середньому становила 30 мм. Діаметр волокон становив від 0,7 мкм до 10 мкм.

Вище вказані матрикси піддавались гамма стерилізації. Герметично запаковані в подвійну упаковку для стерилізації скафолди рівномірно вкладались під електронний пучок з енергією частинок 4 мега електрон вольт (МеВ) і протяжністю імпульсів 4,5 мікросекунд (мкс). Кожен пакет «Мегїісот» стандартизований EN 868-5, 180 11140-1, 180 11607-1, в який був запакований полімер товщиною 0,6 мм. При опроміненні кількість імпульсів змінювалась від 4-70. Стерилізація відбувалась за наступними параметрами: частота роботи прискорювача складала 250 Гц, максимальна енергія електронів становила 5 МеВ, максимальна потужність пучка становила 5 кВт, тривалість імпульсів 4,5 мкс, імпульсний струм до 1,5 А, потужність гальмуючого випромінювання на відстані 1 м від мішені становила - 104 Р/сек. Доза опромінення об'єкта становила до 50 кГр з розрахунку об'єму та щільності матеріалу. Згідно норм максимально допустима доза 50 кГр, при максимальній енергії електронів 5 МеВ. Обробка електронами з енергією менше 10 МеВ не викликала ядерних трансмутацій, тобто не призводила до виникнення радіоактивних ізотопів і не створювала залишкового радіаційного фону об'єкту. Після стерилізації біополімерні матрикси хірургічним шляхом імплантувались під шкіру лабораторної тварини. Дослідження проводилось на 20 лабораторних тваринах (кролі), які були поділені на 2 групи. Першій групі порівняння: 10-ом тваринам проводилось оперативне втручання, яке включало формування «кишені» в підшкірній клітковині та накладання швів. Другій групі: 10-ом тваринам проводилась підшкірна імплантація біополімер- ного матриксу в ділянку спини між лопатками. Через 3 місяці хірургічним шляхом матрикс разом із прилеглими тканинами видалявся з тіла тварини.

Всі маніпуляції з експереентальними тваринами проводили з дотриманням правил відповідно до «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» [6].

Сполучна тканина представлена здебільшого сполучнотканинними волокнами, які в одних зонах розташовані більш пухко, в інших - більш компактно. В зонах їх пухкого розташування простежується звивистий хід волокон. При щільному розташуванні контури волокон простежуються з утрудненням, внаслідок злиття їхніх меж одні з одними. При пухкому розташуванні волокон відзначаються в невеликій кількості також фібробласти, макрофаги, місцями гемосидерофаги, поодиноко лімфоцити (на одну клітину припадає 534,90+1,879 мкм2 площі тканини) з невеликою кількістю еритроцитів у товщі. Жирова тканина представлена зрілими адипоцитами у вигляді клітин округло-полігональної форми, з невеликими поодинокими ядрами, що розташовуються під плазмолемою в одному з країв. У товщі жирової тканини візуалізуються аналогічного калібру судини.

Для здійснення загального гістологічного дослідження матрикс з оточуючими тканинами розсікали взаємно перпендикулярними розрізами на 25 однакових сегментів. Для дослідження брали 9 сегментів: один центрально розташований і по 4 сегменти з парацентральної та з периферичної зон. Отримані ділянки імпланту фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну (Ph-7,0). Час фіксації складав 24 години. В подальшому шматочки досліджуваних органів поміщали в висхідну батарею спиртів для дегідратації, далі у хлороформ, суміш хлороформ-парафін (1:1), парафін (при температурі 37°С). Після парафінової препідготовки, шматочки заливали в парафін. Виготовлення серійних парафінових зрізів товщиною 4-6 мкм проводилося на санному мікротомі. Забарвлення препаратів здійснювалося гематоксиліном і еозином [7].

Гістологічні препарати досліджувались світло- оптично на мікроскопі Leica DME під різними збільшеннями об'єктива й окуляра. Морфометричні показники визначали за допомогою системи для отримання мікроскопічних зображень гістологічних мікропрепаратів (мікроскоп Leica DME та цифрова фотокамера "Nikon P5100") та програми аналізу зображень Image Tool 2.0 for Windows на кафедрі патоморфології та судової медицини Івано-Франківського національного медичного університету. Статистичний аналіз результатів здійснено за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Exel та Statistica 5.5 (Multiple Regression) із використанням методів варіаційної статистики, кореляції.

Результати дослідження

Патоморфологічне дослідження периферичних зон імплантів 3-місяч- ного терміну свідчить про розвиток сполучної та жирової тканини у міжволокнистих просторах ім- планта. Дані тканини взаємопов'язані та співіснують одна з одною (Рис.1.).

Рис.1. Cполучна та жирова тканина периферичної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10.

Сегментарно відзначається гіперплазія фібробластів, ядра яких округлої форми, з гомогенним хроматином, чіткою нуклеолемою. Проліферація фібробластів носить подушкоподібний характер - сегментарного типу. Лише навколо окремих груп полімерних волокон відзначається проліферація тканин циркулярного характеру, з невеликою кількістю сполучнотканинних волокон між ними, з поодинокими фіброцитами, ядра яких, на противагу сполучнотканинними волокнами з різною кількістю фіброцитів у товщі (Рис.2.).

Рис.2. Сполучна тканина з циркулярними волокнами та фібробластами периферичної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10.

Групи волокон імпланта оточені капсулами середньою товщиною 156,28+1,654 мкм, які здебільшого представлені циркулярно розташованими фібробластами, витягнутої форми. Здебільшого у зонах фібробластів поміж ними відзначаються в невеликій кількості нейтрофільні гранулоцити. Також, переважно з внутрішнього боку фібробластів, в бік волокнистого полімерного каркасу, виявляються гігантські клітини різного розміру та форми, які містять здебільшого більше 10 ядер, які розміщуються дифузно у клітині (Рис.3.).

Рис.3. Сполучна тканина з гігантськими клітинами сторонніх тіл периферичної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10

Гістоморфологічне дослідження парацентральних зон імплантів 3-місячного терміну відображає, як і в периферичних ділянках, заміщення міжволокнистих просторів імпланта сполучною та жировою тканинами (Рис.4.).

Рис. 4. Cполучна та жирова тканина парацентральної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10.

Жирова тканина представлена зрілими адипо- цитами, містить судини різного калібру з тонкими стінками, заповнені еритроцитами.

Сполучна тканина міжволокнистих просторів полімерного матриксу за типом щільної волокнистої неоформленої. В одних ділянках колагенові волокна проявляють пучкову будову, витягнуті, місцями хвилястого характеру, звивисті. Поміж сполучнотканинними волокнами розташовуються фіброцити з витягнутими по довжині овальними ядрами, невелика кількість фібробластів, макрофагів (Рис.5.).

Рис.5. Сполучна тканина з пучкоподібними волокнами, фібробластами та фіброцитами парацентральної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10

В інших ділянках сполучнотканинні волокна звивисті, дещо пухкіше розташовані, пучковість залягання волокон не простежується (Рис.6.).

Рис. 6. Сполучна тканина з пухкоросташованими волокнами, парацентральної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 20

Групи волокон імпланта безпосередньо оточені сполучнотканинною капсулою середньою товщиною 106,72+1,067 мкм (Рис.7.).

Рис. 7. Сполучна тканина з волокнами середньої товщини, парацентральної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10

Рис.8. Сполучна тканина з клітинною інфільтрацією лімфоцитів та макрофагів, центральної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10.

Волокна імплантів, як і в інших досліджуваних зонах, безпосередньо оточені сполучнотканинними капсулами середньою товщиною 80,24+1,174 мкм (Рис.9.).

Рис. 9. Cполучна тканина з волокнами середньої товщини, центральної зони волокнистого матриксу. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10

Капсула містить сполучнотканинні волокна, орієнтовані циркулярно навколо груп полімерних волокон, колагенові волокна розташовані компактно. Поміж колагеновими волокнами локалізуються фіброцити, а також відзначаються фібробласти, ядра яких більш округлі, порівняно з фіброцитами. подекуди з внутрішнього боку простежуються поодинокі гігантські багатоядерні клітини без оточуючої реактивної лімфоцитарної, макрофа- гальної, епітеліоїдної клітинної реакції.

При патоморфологічному дослідженні центральних зон імплантів 3-місячного терміну встановлено заміщення міжволокнистих прошарків ім- планта сполучною та в меншій мірі жировою тканинами. Сполучна тканина представлена сполучнотканинними волокнами, які розташовуються дещо на віддалі одні від одних, розділюючись основною речовиною сполучної тканини. У основній речовині виявляється невелика кількість клітин (фіброцити, фібробласти, макрофаги), осередково - незначні та невеликі за розмірами скупчення макрофагів і лімфоцитів (446,31+1,968 мкм2 площі сполучної тканини припадає на одну клітину). У окремих поодиноких ділянках у сполучній та жировій тканинах міжволокнистих просторів імпланта виявляється вогнищева клітинна інфільтрація, яка представлена переважно лімфоцитами, в меншій мірі макрофагами (Рис.8.). Місцями дана інфільтрація має периваскулярний характер. В одному випадку зонально виявлено осередкове скупчення лімфоцитів, в центральній частині якого визначаються дещо збільшені в розмірах макрофаги з помірною кількістю світлої цитоплазми за типом епітеліоїдних клітин.

У капсулах наявні циркулярно розташовані сполучнотканинні волокна, між якими відзначаються фіброцити, невелика кількість фібробластів. У капсулі деяких груп волокон імпланта присутня вогнищева лімфоцитарно-макрофагальна з поодинокими нейтрофільними лейкоцитами інфільтрація, яка незначно поширюється за межі капсули. Слід відзначити наявність судин, які на певних ділянках близько розташовані до капсули. При дослідженні внутрішнього боку капсули, яка безпосередньо контактує з полімерними волокнами імпланта, місцями виявляються в невеликій кількості гігантські багатоядерні клітини химерної форми, різних розмірів, зі значною кількістю еозинофільної цитоплазми, з великою кількістю дифузно розташованих ядер.

У тварин контрольної групи ознак циркулярного розташування волокон із чіткою системною геометричною орієнтацією не було виявлено. Що стосується товщини колагенових волокон то тут суттєвої різниці в порівнянні із основною групою виявлено не було. Різниця була у лейкоцитарній інфільтрації яка була відсутня у тварин контрольної групи. Не відмічалась також макрофагальна реакція тканин та відсутні гігантськи клітини сторонніх тіл.

Аналіз та обговорення результатів

Дослідження 3-ох місячного терміну імплантації волокнистого матриксу показало, що ріст та формування колагенового волокна відбувався крізь усю товщину волокнистого полімерного матриксу у трьох взаємоперпендикулярних напрямках. Даний факт підтверджує каркасну функцію синтезованої нами полімерної сітки. Тобто група полімерних волокон створює своєрідну підложку для побудови на ній тканини. Аналіз двохмісячного терміну також показав крім розвитку сполучної розвиток жирової тканини. Відмічаються також ознаки гідролізу полімерного матриксу, що підтверджується наявністю поодиноких гігантських клітин сторонніх тіл та лейкоцитарно макрофагальної реакції, чого не спостерігалось у тварин контрольної групи. Циркулярна структура колагенових волокон спостерігалась і на 3-ох місячному терміну імплантації, що свідчило про їхній щільний контакт із полімером.

Поряд із щільним розташуванням волокон зустрічались волокна з пухким розташуванням, що свідчило про протікаючий процес синтезу колагену. Підтвердженням цього наявність фібробластів з ознаками гіперплазії в даній ділянці як форми клітини з активними синтетичними процесами.

Висновки

1. Відсутність значної кількості нейтрофільних лейкоцитів, збільшеної кількості макрофагів і лімфоцитів свідчить про відсутність як гострої, так і хронічної реактивної запальної інфільтрації, а також як гострої, так і хронічної реакції відторгнення імплантат як чужорідної субстанції в імплантованій ділянці тварини.

2. Створений нами волокнистий матрикс завдяки своїй гігроскопічності та пористості створює своєрідний місток для проростання тканин та формування колагенового матриксу в трьох вимірному просторі.

3. Встановлена біологічна рівновага між гідролізом полімерного матеріалу та синтезом нової тканини.

Література

колагеновий волокнистий біополімерний матрикс

1. Preimuschestva vremennyih nesyemnyih frezerovannyih i polimerizovannyih plastmassovyih protezov na implantatah (2013) Olesova VN, Dovbnev VA, Evstratov OV, Zveryaev AG, Zuev MD, Lesnyak AV [i dr.]. Klinichiskie issledovaniya 1: 25-26 [in Russian]

2. Andryushechkina TN, Berchenko GN, Gioeva YUA, Zoryan EV, Atrushkevich VG Vliyanie kompleksnyih antigomotoksicheskih preparatov na tkani parodonta v aktivnom periode ortodonticheskogo lecheniya:eksperimentalno-morfologicheskoe I klinicheskoe issledovanie. Klinicheskaya stomatologiya 2015 4: 42-49 [in Russian]

3. Balin VN, Balin DV, Iordanishvili AK, Muzyikin MI Osteostimuliruyuschee deystvie ksenogennogo kostnogo materiala na reparativnyiy osteogenez (eksperimentalno-morfologicheskoe issledovanie). Stomatologiya 2015 94(2): 5-9 [in Russian]

4. Hayashi ОН, Gudino CV, Gibson FC, Genco CA (2010) Review: pathogen-induced inflammation at sites distant from oral infection: bacterial persistence and induction of cells pecific innate immune inflammatory pathways. Mol. Oral. Microbiol 5(25): 305-316

5. Deev RV, Isaev AA, Kochish AYU, Tihilov RM (2016) Kletochnyie tehnologii v travmatologii i ortopedii: puti razvitiya. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya injeneriya 3(6): 22-33 [in Russian]

6. Poriadok provedennia naukovymy ustanovamy doslidiv, eksperymentiv na tvarynakh. Ofitsiinyi visnyk Ukrainy. Ofits. vyd. (2012) 24:82 [in Ukrainian]

7.Bahrii MM, Dibrova VA, Popadynets OH, Hryshchuk MI Metodyky morfolohichnykh doslidzhen:monohrafiia. Vinnytsia:Nova knyha (2016):328 [in Ukrainian

Размещено на Allbest.ru